楊慧敏

(鄭州大學(xué)附屬兒童醫(yī)院，河南省兒童醫(yī)院，鄭州兒童醫(yī)院，心血管內(nèi)科，河南 鄭州450000)

先天性心臟病（congenital heart disease，CHD）相關(guān)的肺動(dòng)脈高壓（pulmonary artery hypertension，PAH）的發(fā)生，能夠增加患者的惡性心血管結(jié)局事件的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)，導(dǎo)致患者臨床轉(zhuǎn)歸的惡化[1]。流行病學(xué)研究提示，PAH的發(fā)病率可達(dá)252～363/10萬(wàn)人左右[2]。

不同的因素或者生物學(xué)因子的改變，能夠通過(guò)加劇氧化應(yīng)激反應(yīng)、促進(jìn)肺動(dòng)脈血管內(nèi)皮的損傷等，促進(jìn)肺動(dòng)脈高壓的發(fā)生。補(bǔ)體因子H相關(guān)蛋白 2 （complement factor H related protein 2，CFHR2）及外周血單核細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子T-bet mRNA的表達(dá)，能夠通過(guò)對(duì)趨化因子富集的影響，抑制補(bǔ)體成分對(duì)于肺動(dòng)脈內(nèi)皮下平滑肌細(xì)胞增殖的促進(jìn)作用，降低肺動(dòng)脈的狹窄和肺動(dòng)脈高壓的形成風(fēng)險(xiǎn)[3]；偶聯(lián)因子-6（coupling factor-6 CF6）的表達(dá)，能夠促進(jìn)血管收縮性因子的釋放，增加內(nèi)皮素等對(duì)于平滑肌的痙攣?zhàn)饔?，?dǎo)致血流灌注阻力的增加[4]。為了進(jìn)一步評(píng)估CHD-PAH患兒CFHR2、T-bet mRNA、CF6的變化，從而為臨床上PAH患者的肺動(dòng)脈高壓病情評(píng)估提供參考，本次研究選取我院2014年2月-2017年5月收集的CHD-PAH患兒60例，探討了不同指標(biāo)與患者肺功能的關(guān)系，報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取我院2014年2月-2017年5月收集的CHD-PAH患兒60例 （CHD-PAH組）、CHD未合并PAH患兒70例（CHD組）。CHD-PAH組，患兒年齡 12～54個(gè)月，平均 35.2±11.0個(gè)月，男34例、女26例；其中室間隔缺損33例、房間隔缺損 27 例；PAH 程度：輕度組（PAH：30～40mmHg）21例、 中度組 （PAH：40～70mmHg）24 例、 重度組（PAH：＞70mmHg）15 例。 CHD 組，患兒年齡 12～60個(gè)月，平均 38.0±13.2個(gè)月，男39例、女 31例；其中室間隔缺損38例、房間隔缺損32例。兩組患者的年齡、性別、CHD類型比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，具有可比性。納入標(biāo)準(zhǔn)：⑴CHD及PAH的診斷標(biāo)準(zhǔn)參考中華醫(yī)學(xué)會(huì)制定的標(biāo)準(zhǔn)[5]；⑵患者年齡1～5歲；⑶經(jīng)超聲心動(dòng)圖、彩色多普勒超聲檢查確診；⑷PAH患兒的肺動(dòng)脈高壓＞30mmHg；⑸本研究獲得患兒家長(zhǎng)的知情同意。排除標(biāo)準(zhǔn)：⑴合并惡性腫瘤；⑵由已知其他病因?qū)е路蝿?dòng)脈高壓；⑶伴有造血系統(tǒng)疾病、免疫系統(tǒng)疾??；⑷近期使用激素類藥物治療。

1.2 指標(biāo)檢測(cè)方法 CFHR2、CF6的檢測(cè)：采用化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)CFHR2，檢測(cè)儀器為MAGLUMI化學(xué)發(fā)光免疫分析儀及其配套試劑。采用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)CF6，檢測(cè)儀器為美國(guó)Bio-Bad全自動(dòng)酶標(biāo)儀，試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所，嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書操作。

T-bet mRNA的檢測(cè)：采集血液5ml，加入0.2ml的氯仿，2℃～8℃冰凍離心機(jī)中離心(12000g/min，15min)，反復(fù)一次洗滌 RNA，棄上清，在管底部可見一乳白色小沉淀物，加入1ml 75%乙醇，0.1%DEPC水溶解。加入HPV基因和GAPDH上下游引物、0.1%DEPC使其終濃度均為20pmol/ul，制備反應(yīng)體系，RT-PCR擴(kuò)增的條件與參數(shù)：48℃，45min，94℃，2min；94℃ 30s，58℃ 60s，68℃ 2min 共40個(gè)循環(huán)；循環(huán)完畢后68℃延伸7min。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析采用SPSS 16.0軟件，采用（±s）表示計(jì)量資料，兩組間比較采用成組設(shè)計(jì)t檢驗(yàn)、三組間比較采用單因素方差分析法、手術(shù)前后對(duì)比采用配對(duì)t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料比較采用χ2檢驗(yàn)；P值＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組患兒的血清CFHR2、CF6及T-bet mRNA水平比較 CHD-PAH患兒的血清CFHR2、T-bet mRNA水平顯著的低于CHD組患兒，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；CHD-PAH 患兒的 CF6 水平顯著的高于CHD組患兒，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；見表 1。

表1 兩組患兒的血清CFHR2、CF6及T-bet mRNA水平比較（±s）

表1 兩組患兒的血清CFHR2、CF6及T-bet mRNA水平比較（±s）

組別 n CHD-PAH組CHD組t值P值60 70 CFHR2（μg/L） CF6（ng/L） T-bet mRNA 76.1±22.9 160.3±48.4 12.339＜0.001 242.9±66.0 184.0±43.5 6.084＜0.001 6.93±0.58 7.40±0.62 4.438＜0.001

2.2 不同PAH病情患兒的血清CFHR2、CF6及T-bet mRNA水平比較 輕度、中度CHD-PAH患兒的血清CFHR2、T-bet mRNA水平顯著的高于重度CHD-PAH 組患兒（P＜0.05）；輕度、中度 CHD-PAH患兒的CF6水平顯著的低于重度CHD-PAH組患兒（P＜0.05）；輕度 CHD-PAH 患兒的血清 CFHR2、T-bet mRNA水平顯著的高于中度CHD-PAH組患兒（P＜0.05）；輕度CHD-PAH患兒的CF6水平顯著的低于中度CHD-PAH組患兒 （P＜0.05）；見表2。

表2 不同PAH病情患兒的血清CFHR2、CF6及T-bet mRNA水平比較（±s）

表2 不同PAH病情患兒的血清CFHR2、CF6及T-bet mRNA水平比較（±s）

PAH程度 n輕度中度重度F值P值21 24 15 CFHR2（μg/L） CF6（ng/L） T-bet mRNA 114.8±21.8 73.0±18.4 45.6±17.2 33.092＜0.001 194.2±61.4 238.8±55.0 311.2±59.1 29.817＜0.001 7.31±0.55 6.94±0.53 6.40±0.47 13.372＜0.001

2.3 CHD-PAH患兒手術(shù)前后的血清CFHR2、CF6及T-bet mRNA水平比較 手術(shù)后1周，CHDPAH患兒的血清CFHR2、T-bet mRNA水平顯著的較術(shù)前升高（P＜0.05）；CF6水平較手術(shù)前顯著的降低（P＜0.05）；見表 3。

表3 CHD-PAH患兒手術(shù)前后的血清CFHR2、CF6及T-bet mRNA水平比較（±s）

表3 CHD-PAH患兒手術(shù)前后的血清CFHR2、CF6及T-bet mRNA水平比較（±s）

時(shí)間 n手術(shù)前手術(shù)后1周t值P值CFHR2（μg/L） CF6（ng/L） T-bet mRNA 76.1±22.9 121.6±34.0 8.598＜0.001 242.9±66.0 193.0±31.8 5.276＜0.001 6.93±0.58 7.32±0.44 4.150＜0.001

2.4 CFHR2、CF6及 T-bet mRNA的診斷學(xué)分析血清CFHR2、CF6及T-bet mRNA水平鑒別診斷CHD-PAH患兒與CHD患兒的ROC曲線下面積AUC 值分別為 0.837、0.747、0.706。 見圖 1。

圖 1血清 CFHR2、CF6及 T-bet mRNA水平鑒別診斷CHD-PAH患兒與CHD患兒的ROC曲線

3 討論

先天性心臟病血流動(dòng)力學(xué)和心臟血管的結(jié)構(gòu)的改變等均能夠促進(jìn)PAH的發(fā)生，甚至導(dǎo)致患者多器官功能衰竭的發(fā)生[6，7]。長(zhǎng)期的臨床回顧性分析研究顯示，現(xiàn)階段臨床上PAH患者的治療總體有效率、治療后的再次入院率等指標(biāo)仍然較高，遠(yuǎn)期的心力衰竭的發(fā)生率仍然超過(guò)15%[8，9]。同時(shí)臨床上缺乏對(duì)于PAH患者肺功能評(píng)估的指標(biāo)，雖然動(dòng)脈血?dú)夥治瞿軌驗(yàn)榉蝿?dòng)脈高壓的病情評(píng)估提供參考，但其屬于有創(chuàng)檢查，且費(fèi)用較高。本次研究對(duì)于CFHR2、CF6及T-bet mRNA等指標(biāo)的相關(guān)研究，不僅能夠?yàn)镻AH患者的生物學(xué)治療提供潛在的治療靶點(diǎn)，同時(shí)還能夠?yàn)镻AH患者的肺動(dòng)脈高壓的病情評(píng)估提供血清學(xué)參考。

CFHR2對(duì)于補(bǔ)體成分的調(diào)控作用，能夠抑制下游C4、C3成分的激活，減輕其對(duì)于患者肺動(dòng)脈血管內(nèi)皮細(xì)胞的損傷，抑制內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡。近年來(lái)基礎(chǔ)領(lǐng)域的研究提示，CFHR2能夠抑制單核細(xì)胞對(duì)于動(dòng)脈血管內(nèi)皮的浸潤(rùn)，降低血管內(nèi)皮持續(xù)性病變的風(fēng)險(xiǎn)；T-bet mRNA作為核因子轉(zhuǎn)錄的重要調(diào)控因素，其能夠通過(guò)抑制肺動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞核轉(zhuǎn)錄上游啟動(dòng)子的激活，減少血管內(nèi)皮下組織的纖維化改變。T-bet mRNA還能夠通過(guò)穩(wěn)定MAPK信號(hào)通路，降低MAPK激活導(dǎo)致的動(dòng)脈管壁的重塑性改變[10，11]；CF6能夠誘導(dǎo)內(nèi)皮素的分泌，降低一氧化氮的合成和釋放，導(dǎo)致動(dòng)脈的持續(xù)性痙攣，增加動(dòng)脈血的血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)的紊亂，促進(jìn)肺動(dòng)脈高壓的發(fā)生[12]。部分研究揭示了CFHR2、T-bet mRNA、CF6在PAH患者中的差異性表達(dá)情況，認(rèn)為CFHR2等的下降是促進(jìn)PAH發(fā)生的重要因素，但缺乏對(duì)于不同指標(biāo)與肺動(dòng)脈高壓程度的關(guān)系分析。

本次研究對(duì)于血清中不同指標(biāo)的分析可見，CFHR2、T-bet mRNA、CF6在 PAH 患者中均存在明顯的異常表達(dá)波動(dòng)，其中CFHR2、T-bet mRNA的表達(dá)濃度明顯下降，而CF6的表達(dá)濃度明顯上升，提示了 CFHR2、T-bet mRNA、CF6 等均影響到了PAH患者肺動(dòng)脈高壓的病情進(jìn)展。從原因上分析，相關(guān)指標(biāo)對(duì)于患者肺動(dòng)脈高壓的影響主要包括下列幾個(gè)方面[3，13]：⑴CFHR2、T-bet mRNA 的上升能夠抑制肺動(dòng)脈平滑肌間質(zhì)細(xì)胞的纖維化和脂肪化；⑵CF6的上升能夠影響肺動(dòng)脈血管內(nèi)皮細(xì)胞的功能，導(dǎo)致局部血流呈現(xiàn)出明顯的“高阻力、低灌注”的現(xiàn)象。張茜等[14]研究者發(fā)現(xiàn)肺動(dòng)脈高壓患者血清中的異常表達(dá)情況，CFHR2的表達(dá)濃度可平均下降25%以上，同時(shí)患者的肺動(dòng)脈高壓越為嚴(yán)重，CFHR2的表達(dá)濃度下降越為明顯。在肺動(dòng)脈病情越為嚴(yán)重的患者中，CFHR2、T-bet mRNA的下降程度越高，而CF6的上升幅度越為明顯，這些均提示了 CFHR2、T-bet mRNA、CF6與患者肺動(dòng)脈高壓的直接關(guān)系，CFHR2等能夠通過(guò)抑制肺動(dòng)脈血管的重塑，穩(wěn)定動(dòng)脈血壓，從而降低肺動(dòng)脈血壓的波動(dòng)程度[15]。但部分學(xué)者并不認(rèn)為CFHR2等的表達(dá)與PAH患者的肺動(dòng)脈高壓具有線性的關(guān)系，不同研究間存在不同的結(jié)論，考慮主要由于不同指標(biāo)的監(jiān)測(cè)時(shí)機(jī)、不同PAH的肺動(dòng)脈高壓評(píng)估方式的差別有關(guān)。最后本次研究發(fā)現(xiàn)在治療后的患者中，相關(guān)指標(biāo)的表達(dá)呈現(xiàn)出了進(jìn)一步的波動(dòng)，其中治療后的CFHR2、T-bet mRNA有所恢復(fù)，而CF顯著下降，進(jìn)一步提示了CFHR2、T-bet mRNA、CF6等指標(biāo)與PAH患者的病情關(guān)系。診斷學(xué)分析研究可見，CFHR2、CF6及T-bet mRNA在單獨(dú)診斷肺動(dòng)脈高于的過(guò)程中均具有一定的價(jià)值，其中CFHR2單獨(dú)診斷的AUC下曲線面積較大，提示了CFHR2在單獨(dú)診斷疾病的過(guò)程中具有較高的參考價(jià)值。

綜上所述，CHD-PAH患兒血清CFHR2、CF6及T-bet mRNA較單純CHD患兒發(fā)生顯著的改變，并且與肺動(dòng)脈高壓嚴(yán)重程度具有一定的關(guān)系。