楊琳琳，王藝芳，葛文超，方建華

(河南省紅十字血液中心檢驗(yàn)科，河南 鄭州 450012)

《衛(wèi)生事業(yè)發(fā)展“十二五”規(guī)劃》明確提出：要完善無(wú)償獻(xiàn)血服務(wù)體系，加強(qiáng)血站血液安全保障能力建設(shè)，積極推進(jìn)血站核酸檢測(cè)工作，提高血站實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)能力。為了進(jìn)一步提高血液質(zhì)量和保證血液安全，核酸檢測(cè)（NAT）技術(shù)已在我國(guó)采供血機(jī)構(gòu)大力推廣和應(yīng)用。NAT能大大縮短經(jīng)血液傳播傳染病毒檢測(cè)的“窗口期”，降低輸血傳播傳染病毒的風(fēng)險(xiǎn)[1，2]。從2012年5月開(kāi)始對(duì)本血液中心的無(wú)償獻(xiàn)血者標(biāo)本進(jìn)行NAT檢測(cè)，本文通過(guò)對(duì)鄭州地區(qū)無(wú)償獻(xiàn)血者的NAT結(jié)果分析，以評(píng)估核酸檢測(cè)的功效?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來(lái)源 2012年5月-2017年12月本中心和集中化七家中心血站采集的無(wú)償獻(xiàn)血者標(biāo)本。獻(xiàn)血者均符合國(guó)家《獻(xiàn)血者健康檢查要求》中的相關(guān)要求。所有標(biāo)本的采集、離心、運(yùn)輸和保存均按《血站技術(shù)操作規(guī)程2015版》中相關(guān)要求進(jìn)行操作。

1.2 主要試劑 HBsAg ELISA檢測(cè)試劑盒（北京萬(wàn)泰生物藥業(yè)股份有限公司；珠海麗珠試劑股份有限公司），抗-HCV ELISA檢測(cè)試劑盒（北京萬(wàn)泰生物藥業(yè)股份有限公司；上?？迫A生物工程股份有限公司），抗-HIV1/2 ELISA檢測(cè)試劑盒（北京萬(wàn)泰生物藥業(yè)股份有限公司；法國(guó)BIO-RAD公司）。乙型肝炎丙型肝炎人類免疫缺陷病毒（I型）核酸檢測(cè)試劑 （上海科華生物工程股份有限公司），Cobas TaqScreen MPX text和Cobas TaqScreen MPX 2.0 text（美國(guó)羅氏診斷公司）；配套耗材均由各試劑公司提供，均在有效期內(nèi)使用。衛(wèi)計(jì)委臨檢中心鑒別確認(rèn)試驗(yàn)試劑為羅氏定量二代 （美國(guó)羅氏診斷公司），乙肝血清學(xué)補(bǔ)充試驗(yàn)試劑為雅培化學(xué)發(fā)光試劑（美國(guó)雅培公司）。

1.3 主要儀器 ELISA檢測(cè)使用：Hamilton Star全自動(dòng)加樣儀（瑞士HAMILTON公司）和FAME酶免分析儀（瑞士HAMILTON公司）。核酸檢測(cè)使用：Hamilton Star全自動(dòng)混樣儀 （瑞士HAMILTON公司），ABI 7500實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（美國(guó)ABI公司），Cobas AmpLiPrep核酸提取儀和Cobas Taq-Man Analyzer核酸擴(kuò)增檢測(cè)儀通過(guò)混樣和數(shù)據(jù)管理服務(wù)器（PDM）連接組成羅氏診斷Cobas's 201血液核酸血篩平臺(tái)（簡(jiǎn)稱CAP/CTM），低溫大容量離心機(jī)KUBOTA 8730（日本KUBOTA公司）。

1.4 檢測(cè)方法 ELISA檢測(cè)和NAT檢測(cè)嚴(yán)格按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作和判定結(jié)果[3]。

1.5 NAT陽(yáng)性標(biāo)本的確認(rèn)實(shí)驗(yàn)和血清學(xué)補(bǔ)充實(shí)驗(yàn)采用實(shí)驗(yàn)室的另一種NAT試劑NAT陽(yáng)性標(biāo)本進(jìn)行確認(rèn)，并送衛(wèi)計(jì)委臨檢中心做乙肝血清學(xué)補(bǔ)充試驗(yàn)[3]。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，采用χ2檢驗(yàn)，P＜0.05認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 NAT檢測(cè)結(jié)果 對(duì)ELISA檢測(cè)陰性（酶免雙試劑陽(yáng)性標(biāo)本除外）的其中571028例標(biāo)本進(jìn)行NAT結(jié)果，共檢出346例HBV DNA+、2例HCV RNA+和10例HIV RNA+?？偟腘AT陽(yáng)性率為0.63‰。見(jiàn)表1。

2.2 NAT陽(yáng)性標(biāo)本的再檢結(jié)果 40例NAT陽(yáng)性標(biāo)本經(jīng)另一種試劑（羅氏二代）確認(rèn)，27例為NAT陽(yáng)性，檢出率為67.50%。見(jiàn)表2。

2.3 乙肝血清學(xué)補(bǔ)充實(shí)驗(yàn)結(jié)果 38例送檢標(biāo)本乙肝“兩對(duì)半”結(jié)果的血清學(xué)模式：5例單純抗-HBs陽(yáng)性 （13.16%）；4例乙肝 “兩對(duì)半”結(jié)果為陰性（10.53%）；29例抗-HBc陽(yáng)性（76.31%），其中有 1例HBsAg已轉(zhuǎn)為陽(yáng)性。見(jiàn)表3。

3 討論

由于病毒抗原、抗體蛋白結(jié)構(gòu)的變異，造成“窗口期”漏檢的存在，常規(guī)的酶免檢測(cè)對(duì)經(jīng)血傳播傳染疾病的風(fēng)險(xiǎn)不能完全避免[2]。而核酸檢測(cè)技術(shù)（NAT）敏感性較高，在病毒感染后數(shù)天即能檢出標(biāo)本中的極微量的病毒核酸，可大大縮短 “窗口期”，發(fā)現(xiàn)隱匿性病毒感染，減少因ELISA漏檢而造成的輸血后病毒感染[3，4]。

在獻(xiàn)血者血液篩查中引入NAT，其主要目的是檢測(cè)出原有ELISA可能漏掉的具有感染性的獻(xiàn)血者樣本。從2012年5月到2017年12月采用科華核酸檢測(cè)系統(tǒng)共檢測(cè)了571028例標(biāo)本，共檢出346例 HBV DNA+、2例 HCV RNA+和 10例 HIV RNA+?？偟腘AT陽(yáng)性率為0.63‰和上海0.63‰[5]一致，低于西安 0.66‰[6]、 杭州 2.00‰[7]、 合肥1.62‰[8]、烏魯木齊 1.10‰[9]和南京 0.94‰[10]。 總有效拆分率56.38%也高于實(shí)驗(yàn)室之前報(bào)道該試劑的33.33%[3]。除2012年外，不同年份間NAT陽(yáng)性率和不同年份拆分陽(yáng)性率之間有差異。2012年沒(méi)有NAT陽(yáng)性標(biāo)本檢出，2013年和2014年NAT陽(yáng)性率和拆分陽(yáng)性率保持在一個(gè)比較平穩(wěn)的狀態(tài)，分析可能原因：在開(kāi)展核酸檢測(cè)的第1年，實(shí)驗(yàn)室各方面條件還不夠成熟，工作人員對(duì)儀器和試劑的性能不夠了解，操作不夠熟練。隨著標(biāo)本量的增加以及工作人員的操作逐漸熟練，陽(yáng)性率相對(duì)平穩(wěn)。和2013年和2014年相比，2015年和2016年NAT陽(yáng)性率和拆分陽(yáng)性率都有上升，查看實(shí)驗(yàn)記錄后發(fā)現(xiàn)：在2015年上半年只用該系統(tǒng)檢測(cè)了兩萬(wàn)份左右標(biāo)本，陽(yáng)性率和拆分陽(yáng)性率與之前持平，在2015年11月開(kāi)展了核酸集中化檢測(cè)直到2016年底結(jié)束。分析原因可能是：7個(gè)血站的標(biāo)本全部送到血液中心集中檢測(cè)，檢測(cè)前大批量的標(biāo)本處理，可能會(huì)造成一些假陽(yáng)性；各個(gè)單位血液篩查實(shí)驗(yàn)室的酶免檢測(cè)HBsAg/抗-HCV/抗-HIV1/2所用試劑、設(shè)備和人員操作水平以及地區(qū)流行病學(xué)特點(diǎn)也不盡相同，可能在某種程度上提升了NAT陽(yáng)性率。2017年NAT陽(yáng)性率下降可能與所檢測(cè)無(wú)償獻(xiàn)血人群標(biāo)本HBV、HCV、HIV的感染率有關(guān)。40例NAT陽(yáng)性標(biāo)本經(jīng)羅氏二代試劑檢測(cè)，確認(rèn)檢出率為67.50%。NAT陽(yáng)性標(biāo)本的確認(rèn)對(duì)科華核酸檢測(cè)系統(tǒng)的檢出率起到了監(jiān)控作用，本實(shí)驗(yàn)室已開(kāi)始對(duì)確認(rèn)結(jié)果不一致的獻(xiàn)血者進(jìn)行追蹤隨訪并將其血漿標(biāo)本送檢第三方實(shí)驗(yàn)室確認(rèn)。

表1 2012～2016年核酸檢測(cè)結(jié)果（n=571028）

表2 NAT陽(yáng)性標(biāo)本的再檢確認(rèn)結(jié)果（n=40）

表3 NAT陽(yáng)性標(biāo)本的乙肝“兩對(duì)半”血清學(xué)模式（n=38）

目前，鄭州地區(qū)無(wú)償獻(xiàn)血者的HBV感染率較高，輸血傳播HBV殘余風(fēng)險(xiǎn)明顯高于HCV和HIV，HBV DNA陽(yáng)性346例，占96.80%。筆者對(duì)38例HBV DNA陽(yáng)性標(biāo)本進(jìn)行了血清學(xué)補(bǔ)充實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)：5例單純抗-HBs陽(yáng)性（13.16%）；4例乙肝“兩對(duì)半”結(jié)果為陰性（10.53%），這4例可能為“窗口期”感染；29例為抗-HBc陽(yáng)性（76.31%），其中有1例HBsAg已轉(zhuǎn)為陽(yáng)性，其余標(biāo)本若證實(shí)為隱匿性HBV感染（OBI），說(shuō)明鄭州地區(qū)輸血?dú)堄囡L(fēng)險(xiǎn)主要來(lái)自于OBI。目前，本實(shí)驗(yàn)室已建立了ELISA陰性NAT陽(yáng)性獻(xiàn)血者追蹤隨訪程序，便于適時(shí)監(jiān)測(cè)輸血傳染病的血清轉(zhuǎn)化情況。在追蹤的獻(xiàn)血者中，其中1例HCV RNA陽(yáng)性的獻(xiàn)血者，在追蹤第6周時(shí)獻(xiàn)血者抗-HCV完全轉(zhuǎn)為陽(yáng)性[11]。

綜上所述，NAT能從ELISA檢測(cè)陰性的無(wú)償獻(xiàn)血者標(biāo)本中檢出漏檢的病毒感染者，降低輸血感染病毒的風(fēng)險(xiǎn)，是ELISA檢測(cè)的有力補(bǔ)充。核酸檢測(cè)應(yīng)用于鄭州地區(qū)血液篩查是十分可行且有效地保障了臨床輸血安全。