王利紅，張 偉,2，曹玉嬌

（1.江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學院，江蘇泰州 225300；2.江蘇姜曲海種豬場，江蘇泰州 225300)

沉默蛋白（Sir2-related Enzymes，Sirtuin）或者沉默信息調(diào)節(jié)因子2（Silence Information Regulator 2，Sir2）最初是在釀酒酵母中發(fā)現(xiàn)的一類高度保守的煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD）依賴的組蛋白去乙?；福℉DAC）。此后研究發(fā)現(xiàn)，從古細菌到人類的生命活動，沉默蛋白都發(fā)揮著重要作用。哺乳動物有7 種Sirtuin同源基因SIRT1-SIRT7，它們具有不同的亞細胞定位和功能[1]。這些蛋白能夠結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)因子、細胞骨架蛋白等多種因子，通過去乙?；磻?yīng)或ADP（Adenosine Diphosphate）核糖轉(zhuǎn)移反應(yīng)參與能量代謝、基因沉默、DNA 損傷修復(fù)、細胞周期調(diào)控和細胞分化等功能過程，是生物學功能十分廣泛并且作用較為重要的酶類[2]。SIRT5 因具有更大的賴氨酸酰基結(jié)合口袋的結(jié)構(gòu)特點，使其除了具有較弱的去乙?；富钚酝猓€有很強的去琥珀?；?、去丙二酰化和去戊二?；富钚裕ㄟ^不同的酶活性，參與調(diào)控葡萄糖、氨基酸、脂質(zhì)等多種物質(zhì)代謝過程，并發(fā)揮抗氧化、調(diào)控細胞和線粒體凋亡和炎性反應(yīng)等生物學功能[3-5]。截至目前，有關(guān)豬SIRT5 基因在組織中表達的研究較少，且尚未見在蘇姜豬組織中表達的研究報道。本研究以蘇姜豬為研究對象，進行SIRT5 基因組織表達和定位檢測分析，旨在從分子遺傳方面深入了解SIRT5基因在豬組織中的表達特征，進而為優(yōu)質(zhì)豬種的選育提供理論參考。

1 材料方法

1.1 組織樣的采集 選取體重在85 kg 左右的蘇姜豬6頭（公、母各半）。屠宰后立即采集豬的心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、大腸、小腸、腹脂肪、背最長肌、腿肌、胃、卵巢（母豬）、子宮（母豬）、輸卵管（母豬）等組織，每個組織3 個重復(fù)，分裝在 1.5 mL 的Eppendorf 管（EP 管）中，放入液氮進行保存和運輸。在實驗室中將內(nèi)臟組織存儲在-80℃條件下，用于組織總 RNA 和蛋白質(zhì)的提取。同時采集各組織樣本置于10%中性福爾馬林溶液中固定，用于后續(xù)免疫組織化學檢測。

1.2 實時熒光定量PCR 根據(jù)GenBank 提供的豬SIRT5 基因序列使用Primer Premier 5 設(shè)計引物（表1），由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成。根據(jù)說明書，使用TRIzol（TaKaRa）提取所有受試豬各組織樣品中的總RNA。取1 000 ng 總RNA，按照SuperScriptTMIII First-Strand Synthesis SuperMix for qRT-PCR 試劑盒說明操作，Real-Time PCR 擴增反應(yīng)體系為20 μL：上、下游引物(10 μmol/L) 各0.5 μL，cDNA 1.0 μL，Power SYBR?Green Master Mix 10.0 μL；反應(yīng)條件為95℃，1 min；40 個 循 環(huán)（95 ℃，15 s，63 ℃，25 s）， 反 轉(zhuǎn)錄成cDNA 于-70℃保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 實時熒光定量PCR 引物

1.3 酶聯(lián)免疫分析（ELISA） 利用ELISA 對蘇姜豬各組織中的蛋白水平進行測定：①取適量組織塊，于預(yù)冷的PBS（0.02 mol/L，pH 為7.0～7.2）中清洗去除血液，稱重1.0 g 組織用于后續(xù)實驗（組織塊較大需先剪碎后再勻漿）。②首先將組織塊移入10 mL EP 管中，加入5 mL 預(yù)冷PBS 及10 μL PMSF 蛋白酶抑制劑后，使用電動勻漿機10 000 r/min 間歇勻漿 3 min，每次1 min，該過程在冰上進行。得到的勻漿液再利用超聲破碎30 s（冰?。?。③將制備好的勻漿液于離心機中13 000 r/min 離心5 min，取上清用于ELISA 檢測。④蛋白提取液中SIRT5 的蛋白水平使用SIRT5 酶聯(lián)免疫分析ELISA 試劑盒測定，即在酶標包被板上的待測樣品孔中先加稀釋液40 μL，然后再加待測樣品10 μL，之后在每孔中加入酶標試劑50 μL，封板膜封板后置37℃溫育30 min，加洗滌液靜置30 s 后棄去，重復(fù)洗滌5 次，拍干，每孔加入顯色劑A 和B 各50 μL 混勻，37℃避光顯色10 min，最后每孔加終止液50 μL，終止反應(yīng)后以450 nm 波長測定樣品吸光度。

1.4 免疫組織化學檢測 取10%中性福爾馬林溶液中固定的各組織臟器，經(jīng)常規(guī)石蠟包埋，5 μm 厚切片。石蠟切片經(jīng)脫蠟和水化處理后，用Tris-EDTA（pH=9）作為抗原修復(fù)液，微波加熱至98℃并保持10 min，自然冷卻至室溫后，TBS 洗滌3 次，用3% H2O2封閉內(nèi)源性過氧化物酶。TBS 洗滌3 次后，以5% BSA 于37℃封閉30 min，棄掉封閉液，使用兔抗SIRT5 抗體（CST，1∶250）作為一抗4℃孵育過夜。使用HRP 標記的羊抗兔IgG（南京生興生物技術(shù)有限公司，sn134，1∶100）作為二抗識別特異性一抗，DAB 顯色液顯色。以蘇木精復(fù)染細胞核后，梯度酒精脫水，中性樹膠封片，光學顯微鏡下觀察染色結(jié)果。

1.5 統(tǒng)計分析 SIRT5 mRNA 轉(zhuǎn)錄水平數(shù)據(jù)以心臟組織中表達量為標準，并以2-△△Ct計算。使用SPSS 19.0 單因素方差分析（ANOVA）及獨立樣本t 檢驗，進行差異顯著性分析；用雙變量Pearson 相關(guān)分析，P＜0.05 表示差異或相關(guān)顯著。

2 結(jié) 果

2.1 蘇姜豬各組織中SIRT5 mRNA 轉(zhuǎn)錄和蛋白表達水平通過RT-PCR 及ELISA 方法，在蘇姜豬心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、大腸、小腸、腹脂肪、背最長肌、腿肌、胃、卵巢（母豬）、子宮（母豬）、輸卵管（母豬）等組織中均檢測到SIRT5 的表達（圖1、圖2）。

由圖1 可看出，蘇姜豬公豬SIRT5 mRNA 轉(zhuǎn)錄水平在心臟和肝臟組織中有豐富的表達，顯著高于其他組織（P＜0.05）；其次肺臟、大腸、小腸和胃組織的SIRT5 mRNA 轉(zhuǎn)錄水平高于脾臟、腎臟、腹脂肪、背最長肌和腿肌組織（P＜0.05）。從各組織中SIRT5 蛋白表達水平看，胃和大腸組織中表達量相對最高，均高于脾臟、腎臟、腹脂肪、背最長肌、腿肌組織（P＜0.05），小腸和肺臟組織中表達量相近，與其他組織中表達量差異不顯著，腹部脂肪中表達量相對最低，低于心臟、大腸和胃組織（P＜0.05）。

由圖2 可看出，蘇姜豬母豬的小腸組織中SIRT5 mRNA 表達量相對最高，顯著高于其他組織（P＜0.05）；其次在心臟、肺臟、腎臟、大腸、胃、卵巢、輸卵管組織中也有較豐富的表達量，但與其他剩余組織間差異不顯著。從各組織中SIRT5 蛋白表達結(jié)果看，心臟、肺臟、腎臟、大腸、小腸、子宮和輸卵管組織中的表達量高于肝臟、脾臟、腹脂肪、背最長肌、腿肌、胃和卵巢組織（P＜0.05）。

由表2 可看出，蘇姜豬公豬各組織SIRT5 mRNA轉(zhuǎn)錄水平與蛋白表達水平間未達到線性顯著相關(guān)（P＞0.05），而母豬各組織SIRT5 mRNA 轉(zhuǎn)錄水平與蛋白表達水平間則呈線性極顯著相關(guān)性（P＜0.01）。

圖1 SIRT5 在蘇姜豬公豬不同組織臟器中的mRNA 轉(zhuǎn)錄和蛋白表達水平

圖2 SIRT5 在蘇姜豬母豬不同組織臟器中的mRNA 轉(zhuǎn)錄和蛋白表達水平

表2 蘇姜豬SIRT5 mRNA 轉(zhuǎn)錄與蛋白表達相關(guān)性分析

2.2 SIRT5 在蘇姜豬組織中的表達定位分布 通過免疫組織化學方法，在蘇姜豬的心臟、肝臟、脾、肺、腎臟、胃、大腸、小腸、脂肪、背最長肌、腿肌、卵巢、輸卵管、子宮等組織中均檢測到SIRT5 免疫陽性細胞，且免疫陽性顆粒主要定位于各組織構(gòu)成細胞的細胞質(zhì)中（圖3）。由圖3 可看出，SIRT5 蛋白免疫陽性顆粒在蘇姜豬多種臟器的組織細胞質(zhì)中表達，且在肌肉細胞（如心臟的心肌細胞、背最長肌和腿肌的肌細胞、胃和腸的肌層細胞、子宮和輸卵管的肌層細胞）有豐富的表達。此外，在肝臟的肝細胞、脾臟的紅髓細胞、肺臟的肺泡壁上皮層和支氣管黏膜層的細胞、腎臟皮質(zhì)迷路的近曲小管內(nèi)皮細胞、大腸和小腸腸腺和固有層細胞、脂肪組織的脂肪細胞、胃組織的固有腺層細胞、卵巢卵泡顆粒細胞以及子宮和輸卵管組織的黏膜層細胞中也有豐富的免疫陽性顆粒。

圖3 SIRT5 在蘇姜豬多種組織內(nèi)的免疫組化檢測

3 討 論

SIRT5 作為Sirtuins 家族中的一員，具有去乙?；浮⑷ョ牾；浮⑷ケ；讣叭ノ於；富钚?，主要參與調(diào)控葡萄糖、脂質(zhì)、活性氧（ROS）、ATP 等物質(zhì)和能量代謝過程[6]。在動物組織中SIRT5表達具有廣泛性，且在動物的心臟、肝臟、肌肉、腦以及生殖器官組織中呈高表達[3]。本研究通過RT-PCR、ELISA 和免疫組織化學方法在蘇姜豬公豬11 個組織和母豬14 個組織中均檢測到SIRT5 mRNA 轉(zhuǎn)錄和蛋白表達，表明蘇姜豬組織中SIRT5 表達同樣具有廣泛性；通過相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，蘇姜豬母豬組織中SIRT5 mRNA相對表達量與蛋白表達量間呈線性極顯著相關(guān)，表明該基因在蘇姜豬母豬組織中的轉(zhuǎn)錄和翻譯水平具有一致性，但公豬mRNA 相對表達量與蛋白表達量間則未呈顯著線性相關(guān)，表明公、母蘇姜豬不同組織細胞中SIRT5 調(diào)控機制存在差異。

本研究結(jié)果顯示，蘇姜豬公豬SIRT5 mRNA 在心臟和肝臟組織中表達量相對最高，顯著高于其他組織，脾臟中表達量相對最低。這一結(jié)果與Jin 等[7]報道的通城豬公豬的SIRT5 mRNA 組織表達譜結(jié)果相似。然而，本實驗中SIRT5 mRNA 在胃組織中的相對表達量則與通城豬公豬的結(jié)果不同，從ELISA 檢測結(jié)果看，蘇姜豬公豬胃組織中SIRT5 蛋白表達量也較高。對比蘇姜豬公豬SIRT5 mRNA 和蛋白表達水平，脾臟和腹脂肪組織中表達量相對均最低，其次是背最長肌、腿肌和腎臟組織，而表達量差異相對較大的為心臟、胃、肝臟、肺臟、大腸和小腸組織。

在動物機體物質(zhì)和能量代謝過程中SIRT5 發(fā)揮著重要的作用，SIRT5 缺失會導(dǎo)致動物機體幾種代謝途徑紊亂，且已有研究表明，SIRT5 可以作為秦川牛肉品質(zhì)性狀的候選基因，用于加速優(yōu)質(zhì)肉牛品種的選育[3-5,8-9]。本研究中，公、母蘇姜豬脾臟、腹部脂肪、背最長肌和腿肌組織中SIRT5mRNA 表達量均相對較低，心臟、胃、肺臟和肝臟組織中有一定豐度的表達量，而在腎臟、大腸和小腸組織中表達量則母豬相對較高、公豬相對較低；母豬組織中的SIRT5 蛋白表達量總體相對低于公豬，這一點與母豬的生長勢較公豬弱（如蘇姜豬成年公豬平均體重204.68 kg，母豬體重168.71 kg）的特點相符。除生長勢外，公、母豬在屠宰與肉品質(zhì)方面也存在差異，如閹公豬的腹脂重顯著低于母豬，而閹公豬肉的飽和脂肪酸含量顯著高于母豬，且其肉色、貯存損失、熟肉率上均有一定優(yōu)勢，母豬則在大理石紋評分和失水率上稍有優(yōu)勢[10-11]。這種生長或肉品質(zhì)性狀差異是否與SIRT5基因表達有關(guān)，尚待后續(xù)進一步研究。

通過免疫組織化學方法，在所測定的蘇姜豬組織中均檢測到SIRT5 免疫陽性顆粒。肝臟是動物機體內(nèi)重要的代謝器官。Nakagawa 等[12]研究表明，SIRT5 缺失的小鼠在長期饑餓后磷酸合成酶1（CPS1）的乙?；潭壬?，氨濃度增加，顯示SIRT5 與肝臟中氨的代謝相關(guān)。本研究在蘇姜豬肝細胞中檢測到了豐富的SIRT5免疫陽性顆粒。在消化系統(tǒng)中，SIRT5 免疫陽性顆粒主要定位于蘇姜豬胃組織的胃底腺層細胞和大腸、小腸的腸腺細胞，表明SIRT5 與腺細胞的分泌功能有關(guān)。機體最大的免疫器官——脾臟含有大量淋巴細胞和巨噬細胞，是機體細胞免疫和體液免疫的中心。通過細胞定位發(fā)現(xiàn)，SIRT5 免疫陽性顆粒主要分布于蘇姜豬脾臟的紅髓細胞。肌肉是動物機體能量代謝的主要組織。本研究在蘇姜豬心臟、背最長肌和腿肌的肌細胞中均檢測到SIRT5 免疫陽性顆粒，表明SIRT5 在蘇姜豬能量代謝過程中具有重要作用。

氨基甲酰磷酸合成酶1（CPS1）是SIRT5 的一個重要底物，是尿素循環(huán)過程中重要的限速酶。SIRT5 不僅可以直接去乙?；饔肅PS1，增強其活性，而且在能量限制條件下還可以間接提高CPS1 的活性，限制尿素循環(huán)起始步驟，完成氨的解毒，在禁食或高蛋白質(zhì)飲食期間，SIRT5 基因敲除小鼠的血液中有較高水平的氨，正是因CPS1 去乙酰程度降低，其活性降低所至[8,12]。當SIRT5 過表達時，CPS1 的戊二?；浇档?，其酶活性升高[12-13]。通過細胞定位檢測，SIRT5 免疫陽性顆粒主要在蘇姜豬腎臟的皮質(zhì)迷路近曲小管的內(nèi)皮細胞中分布。在生殖系統(tǒng)中，SIRT5 免疫陽性顆粒主要分布于蘇姜豬輸卵管和子宮的黏膜層細胞中，表明SIRT5 與生殖道分泌功能有關(guān)，但其表達量相對不高。在卵巢組織中，SIRT5 免疫陽性顆粒主要分布于卵泡的顆粒層細胞，表明SIRT5 與顆粒細胞的功能有關(guān)，進而間接決定著卵母細胞的生長成熟；在卵巢黃體中未檢測到SIRT5免疫陽性顆粒，表明該基因不參與黃體功能的行使。

4 結(jié) 論

SIRT5 在蘇姜豬組織中具有表達廣泛性，但僅母豬組織中SIRT5 轉(zhuǎn)錄與翻譯水平呈極顯著線性相關(guān)；在組織臟器中，在物質(zhì)和能量代謝旺盛的組織（如胃、腸、肝臟、肌肉和腎臟等）中有相對較高的表達量，但母豬SIRT5 蛋白表達量總體低于公豬；SIRT5 免疫陽性顆粒主要定位于肝細胞、脾臟的紅髓細胞、肺泡上皮細胞、近曲小管內(nèi)皮細胞、胃和腸組織腺細胞、卵泡顆粒細胞、黏膜層細胞以及多種臟器的肌細胞中。