張翼 洪雪琪 段坦炎 時鵬 楊敏 何并文 林飛

何首烏是始載于《開寶本草》的中草藥，為蓼科植物何首烏Polygonum multiflorum Thunb的根部，其性微溫，味苦、甘澀。研究表明，何首烏的化學成分包括二苯乙烯苷類、大黃素和兒茶素類等化合物，具有抗衰老、提高免疫力、降血脂、抗動脈粥樣硬化、抗炎、抗菌、抗癌、抗誘變等藥理作用［1]。張又枝［2]研究發(fā)現何首烏中的 2，3，5，4'-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D 葡萄糖苷具有抗炎鎮(zhèn)痛作用，可能與抑制局部炎癥介質如前列腺素和5-羥色胺的釋放、直接抑制PGE2和COX-2合成有關。LI等［3]研究發(fā)現納米粒子包裹大黃素通過減少由背根神經節(jié)嘌呤2X3受體介導的2型糖尿病大鼠的興奮性傳遞減輕病理性神經痛。此外，研究表明兒茶素通過調節(jié)胰腺癌不同的信號通路，誘導細胞凋亡并抑制腫瘤進展［4]。然而，何首烏是否對癌痛具有鎮(zhèn)痛效果及其有效成分尚未見報道。本研究通過建立大鼠骨癌痛模型，采用何首烏有效成分單體灌胃，探討其鎮(zhèn)痛效果。

1 材料和方法

1.1 動物來源及分組

36只雌性Sprague-Dawley（SD）大鼠購自廣西醫(yī)科大學實驗動物中心，4周齡，體重（100±20）g。分籠飼養(yǎng)于不銹鋼鼠籠，室溫控制在（23±1）℃，相對濕度（70±10）%，自由飲水攝食。walker256大鼠乳腺癌細胞購自上海中喬新舟生物有限公司。經4周適應期后，將36只雌性SD大鼠隨機分成3組：A組大鼠為正?？瞻讓φ眨╪=6），B組大鼠注射無菌生理鹽水（n=6），C組大鼠左后腿脛骨注射walker256大鼠乳腺癌細胞建立骨癌痛模型（n=24）。建立骨癌痛模型的C組SD大鼠按灌胃藥物隨機分成C1、C2、C3、C4 4組，每組6只。建模后 14 d、15 d、16 d連續(xù)對C1組大鼠灌胃生理鹽水（2 mL）；C2組大鼠灌胃二苯乙烯苷（60 mg/mL，2 mL）；C3組大鼠灌胃大黃素（60 mg/mL，2 mL）；C4組大鼠灌胃兒茶素（60 mg/mL，2 mL）。

1.2 主要試劑

DMSO、RPMI-1640培養(yǎng)基、胎牛血清、PBS溶液和胰蛋白酶均購自美國Gibco公司；Von Frey纖維絲痛閾測試包購自美國stoelting公司；何首烏有效成分二苯乙烯苷單體、大黃素和兒茶素購自上海瑞永生物科技有限公司。

1.3 細胞培養(yǎng)

walker256大鼠乳腺癌細胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素及100 U/mL鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基，置于37℃、5%CO2和100%濕度細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細胞生長至占滿觀察視野90%以上時傳代，2～3 d傳代1次。取對數生長期、活力旺盛且無變形的細胞制成單細胞懸液，計數并調整細胞數量到2×107個/mL置于清潔試管中備用。

1.4 大鼠骨癌痛模型的建立

參照姚明等［5]研究建立大鼠骨癌痛模型。取1 mL walker256腫瘤細胞，注射到體重為80 g左右的24只雌性SD大鼠腹腔中，腹水培養(yǎng)7 d。7～9 d后觀察到SD大鼠腹部明顯腫大，脫頸處死大鼠后抽取腹水，1 000 r/min離心5 min，除去上清液，沉淀細胞用RPMI-1640培養(yǎng)基清洗3次，重新計數并調整到1×108個/mL，置于冰盒內備用。將24只C組大鼠手術并于左后腿脛骨注射walker256大鼠乳腺癌細胞建立骨癌痛模型。具體如下：大鼠腹腔注射10%水合氯酸（3 mL/kg）麻醉后，左側膝關節(jié)部位備皮。左手固定膝關節(jié)，用小型鐘表拿子在膝關節(jié)髕韌帶內側緣沿脛骨縱軸往脛骨遠端鉆孔，用微量移液器抽取腫瘤細胞15～20 μL（或無菌生理鹽水 15～20 μL），緩緩注射。注射完成后固定15～20 s，然后緩慢拔出，最后用醫(yī)用骨蠟封好鉆孔。使用酒精棉球消毒并擦除溢出的腫瘤細胞，逐層縫合。

1.5 脛骨HE染色切片

建模后14 d，每組隨機取1只大鼠并脫頸處死，分離出新鮮脛骨，經脫鈣、石蠟包埋后行蘇木素-伊紅（HE）染色，在光學顯微鏡下觀察腫瘤情況及脛骨骨質破壞情況。

1.6 觀察指標與方法

機械性異常性疼痛是骨癌疼痛的行為學標志，通過測量50%縮爪閾值（突然抬起、舔舐或移開所刺激的后足）來評估機械性痛閾。將SD大鼠放在鐵網上，覆蓋倒置的透明塑料籠，提前20 min放入適應。透明塑料籠從低到高放置 Von Frey細絲（1.4 g、2.0 g、4.0 g、6.0 g、8.0 g、10.0 g、15.0 g 和 26.0 g）。每次測量都使垂直于足底傳遞的Von Frey力作用于左側腳掌中部，纖維絲彎曲成S形，持續(xù)4～6 s。刺激期間或之后出現1次突然抬起、舔舐或移開所刺激的后足記錄為1次陽性反應。當有陽性或陰性反應時，下一次分別施加較弱或較強的單位。每一刻度Von Frey纖維絲進行5次測量，出現3次或以上陽性（陰性）反應則認為該刻度有效（無效）。若刻度小于1.4 g，動物也未做出反應，則記錄為1.4 g；反之，記錄該值為30.0 g。當測量出結果小于4.0 g時，則認為大鼠出現痛覺超敏現象［6]。在術前 1 d、術后 1 d、術后 3 d、術后 5 d、術后7 d、術后10 d和術后14 d分別對A組、B組和C組SD大鼠進行痛閾測量。術后14 d開始，對C1～C4組大鼠進行連續(xù)3 d的灌胃。在灌胃前、灌胃后30 min和灌胃后1 h對大鼠進行痛閾測量。

1.7 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 22.0進行數據分析。計量資料以均數±標準差（±s）表示。多組間比較采用單因素方差分析，若整體差異有統(tǒng)計學意義，進一步的兩兩比較采用Bonferroni檢驗；每組大鼠各時間點的兩兩比較采用配對t檢驗；重復測量數據采用重復測量方差分析，評價其時間效應、組間效應和交互效應。本研究以雙側P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 每組大鼠機械痛閾的改變

重復測量方差分析結果顯示，組間效應差異有統(tǒng)計學意義（F=19.789，P＜0.001），提示排除時間效應影響，各組大鼠機械痛閾值有差異；時間效應差異無統(tǒng)計學意義（F=1.673，P=0.060），提示各組大鼠機械痛閾值不隨時間變化而變化；交互效應無統(tǒng)計學意義（F=1.673，P=0.091），提示各組大鼠機械痛閾值時間變化趨勢相同。進一步分析發(fā)現，A組和B組大鼠各時點的機械痛閾值差異均無明顯統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。C組大鼠術后7 d、10 d和14 d機械痛閾值較A組B組大鼠同期明顯降低（P＜0.05），且C組大鼠術后7 d、10 d和14 d機械痛閾值差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。C組大鼠術后7 d機械痛閾值較術后第5天明顯降低（t=7.885，P=0.001），其余時點比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見表 1。

表1 每組大鼠機械痛閾的比較Tab.1 Comparison of mechanical pain thresholds in each group of rats

2.2 各組大鼠骨質破壞情況

鏡下觀察可見A組和B組大鼠脛骨骨質結構緊密且骨小梁完整，骨細胞清晰可辨，骨小梁邊緣有許多成骨細胞成行排列；C1～C4組大鼠骨小梁結構排列紊亂，邊緣模糊，骨質破壞明顯，伴隨細胞核分裂增多，腫瘤細胞在骨髓腔內聚集浸潤，表明骨癌痛大鼠脛骨組織被腫瘤細胞浸潤侵襲并出現損傷。見圖1。

圖1 各組大鼠左后腿脛骨HE染色結果（HE×400）Fig.1 HE staining results of the left hind leg tibia in rats（HE×400）

2.3 何首烏提取物對骨癌痛模型大鼠機械痛閾的影響

重復測量方差分析結果顯示，C1～C4組大鼠術后14 d、15 d和16 d的機械痛閾值組間效應差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），提示排除時間效應影響，各組大鼠機械痛閾值有差異；時間效應差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），提示各組大鼠機械痛閾值隨時間變化而變化；交互效應有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），提示各組大鼠機械痛閾值時間變化趨勢不相同，見表2。進一步分析發(fā)現，與灌胃前比較，C2組大鼠術后14～16 d灌胃后30 min和1 h的機械痛閾明顯升高（P＜0.05）。但灌胃后30 min和1 h的機械痛閾差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。C2組大鼠術后14～16d灌胃后30 min和1 h的機械痛閾較其余3組均明顯升高（P＜0.05）。見表3。

表2 C1～C4組大鼠術后不同時點的機械痛閾重復測量方差分析Tab.2 Repeated measurement analysis of variance of pain threshold at different time points in rats in C1-C4 group

表3 C1～C4組大鼠灌胃前、灌胃后30 min、灌胃后1.0 h機械痛閾改變Tab.3 Pain threshold changes in rats in C1-C4 group before gavage，30 min after gavag，and 1 h after gavage

3 討論

癌痛是晚期癌癥患者最常見的癥狀之一，骨癌導致的疼痛包括癌癥進展導致的侵襲性疼痛和神經性疼痛［6-7]。癌痛治療是長期的過程，鎮(zhèn)痛藥物長期給藥導致的臨床耐受和帶來的不良反應是治療中的難題。阿片類藥物雖可有效鎮(zhèn)痛，但成癮性和嚴重的副作用限制了其應用［8]。為了對癌痛機制進行更深入探討，尋找緩解癌痛的新辦法和篩選更有效的鎮(zhèn)痛途徑，中藥鎮(zhèn)痛受到了越來越多關注和研究。中藥對急性或慢性疼痛均能起到一定的鎮(zhèn)痛作用，其低成癮性和較少的副作用有望成為新的鎮(zhèn)痛選擇。何首烏的藥理、藥代動力學等研究證實其具有一定的臨床作用，包括抗衰老作用、降血脂及抗動脈粥樣硬化作用、心肌保護作用、免疫保護作用、保肝作用、神經保護作用、抗菌作用等［9]，但是在何首烏及其活性成分是否對癌痛治療有效未進行更深一步的研究。本研究通過成功構建大鼠骨癌痛模型，同時進行何首烏有效成分單體進行灌胃，發(fā)現二苯乙烯苷可有效緩解骨癌痛。

癌癥進展導致動物模型在不同時期表現出不同的行為，早期多表現為熱覺過敏和機械痛覺過敏，晚期熱覺痛敏與機械誘發(fā)痛同時存在［10]。本研究發(fā)現，A組和B組大鼠各時點機械痛閾及HE染色骨質結構正常，而C組大鼠術后7 d、10 d和14 d機械痛閾明顯降低；骨質失去正常形態(tài)，結構排列紊亂，邊緣模糊，骨質破壞明顯，伴細胞核分裂增多，腫瘤細胞在骨髓腔內聚集浸潤，表明骨癌痛模型成功構建。

研究證明，何首烏主要有效成分為蒽醌類、二苯乙烯類、磷脂類、黃酮類和酚類［2]。本研究分別以蒽醌類、二苯乙烯類和兒茶素對骨癌痛大鼠進行灌胃，發(fā)現在連續(xù)3 d的灌胃實驗中，二苯乙烯苷的鎮(zhèn)痛效果較其他成分更顯著，且隨時間變化的趨勢不同，表明中藥何首烏中二苯乙烯類化合物對骨癌痛具有鎮(zhèn)痛作用。腫瘤細胞可分泌大量腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）、白介素（interleukin，IL）和前列腺素E2等因子，這些因子均可促進NF-κB表達加重炎癥導致疼痛［11-13]。二苯乙烯苷則可抑制腫瘤細胞促炎因子如TNF-α，IL-1β和IL-6的釋放，同時降低NF-κB蛋白表達水平，發(fā)揮抗炎和抗氧化性的作用［14]。FAN等［15]研究發(fā)現二苯乙烯苷劑量依賴性的減輕小鼠后爪的腫脹和疼痛，可能與二苯乙烯苷抑制扣帶回前皮質含N-甲基-d-天冬氨酸受體的GluN2B上調和GluN2A下調、增加Bcl-2而降低Bax和Caspase-3的表達、抑制p38磷酸化及保護神經元存活率等有關。環(huán)氧化酶-2在食管癌、胃癌、直腸癌、肺癌、乳腺癌和前列腺癌中呈過度激活狀態(tài)［16-17]，提示環(huán)氧化酶-2可能是多種腫瘤細胞引起組織發(fā)生炎癥和疼痛的重要物質。應用環(huán)氧化酶-2抑制劑則對多種腫瘤細胞表現出了抑制增殖和促進凋亡的作用［18]，所以二苯乙烯苷可能在細胞水平抑制環(huán)氧化酶-2活性而達到鎮(zhèn)痛效果。

綜上所述，本研究表明何首烏可有效降低大鼠的骨癌痛，其有效單體成分是二苯乙烯苷。但本研究樣本量較少、具體機制及在細胞層面的研究尚不明確，今后本課題組將擴大樣本量、進行體內和體外的鎮(zhèn)痛機制研究，為何首烏用于臨床鎮(zhèn)痛提供理論依據。