王匯鋒 陳潔 羅濤 陳苗 趙媛 王奪 黎樂群

原發(fā)性肝癌是全球第6大惡性腫瘤，也是癌癥死亡的常見原因［1]，其中我國新發(fā)病例數(shù)占全部發(fā)展中國家總發(fā)病例數(shù)的50%以上［2]。原發(fā)性肝癌（以下簡稱肝癌）可分為肝細胞癌、膽管細胞癌和混合細胞癌3種，其中大多為肝細胞癌。目前研究已證實其發(fā)生發(fā)展與乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、肝硬化、黃曲霉素甚至情緒等多種疾病及因素相關(guān)［3-6]，但肝癌的病因及確切分子機制尚未完全清楚。miRNA是一類由內(nèi)源基因編碼的長度約為20個核苷酸的非編碼單鏈RNA分子，可通過與一個或多個靶基因mRNA的3'-非翻譯區(qū)結(jié)合而抑制靶基因表達，從而影響腫瘤的生物學(xué)行為。多項研究［7-9]證明miRNA參與多種腫瘤細胞分化、周期、凋亡、增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移等生物學(xué)行為。但目前尚無關(guān)于Hsa-miR-4282與肝癌的相關(guān)文獻報道，本研究探討Hsa-miR-4282對肝癌細胞生長的影響及其作用機制，以期為闡明肝癌的發(fā)病機制提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 主要材料與試劑

人正常肝上皮細胞系HL-7702及人肝癌細胞系MHCC97-H、SMMC-7721均購自上海生命科學(xué)院細胞庫，保存于本實驗室。胎牛血清、DMEM購自美國Gibco公司，AnnexinⅤ：FITC Apoptosis Detection KitⅠ試劑盒購自美國BD公司。LipofectamineTM6000購自上海碧云天公司。Trizol試劑購自美國Invitrogen公司。miRcute Plus miRNA First-Strand cDNA Synthesis Kit和miRcute Plus miRNA qPCR Detection Kit試劑盒購自北京天根公司。microRNA-4282mimics、microRNA-4282 inhibitor、microRNA-4282 mimics negative control、microRNA-4282 inhibitor negative control均購自廣州銳博生物科技有限公司。所有引物合成均由北京天根公司設(shè)計及完成。

1.2 組織標(biāo)本

20例肝癌組織及其相應(yīng)癌旁組織標(biāo)本均來自廣西醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院肝膽外科2014—2016年的手術(shù)患者，術(shù)后病理檢查確診為原發(fā)性肝癌。本研究通過醫(yī)院倫理委員會的批準，患者知情同意。

1.3 細胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染

肝癌SMMC-7721、MHCC97-H細胞和人正常肝上皮細胞HL-7702均用含10%胎牛血清及1%青鏈霉素的DMEM完全培養(yǎng)基（以下簡稱完全培養(yǎng)基），置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每1～3 d用EDTA-胰蛋白酶消化液消化、傳代。

細胞轉(zhuǎn)染前24 h，胰蛋白酶消化對數(shù)生長期的肝癌SMMC-7721細胞，用完全培養(yǎng)基調(diào)整細胞數(shù)為4×105個/孔，接種于 6 孔板中，置于 37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染前，棄除6孔板中的培養(yǎng)基，PBS緩沖液清洗3次后備用。采用瞬時轉(zhuǎn)染法分別將Hsa-miR-4282 mimics（上調(diào)組）和 Hsa-miR-4282 inhibitor（下調(diào)組）轉(zhuǎn)染肝癌SMMC-7721細胞，上調(diào)組和下調(diào)組分別設(shè)置相應(yīng)陰性對照組。按說明書推薦量 mimics為 50 nmol/L、inhibitor為 100 nmol/L，分別加入1.5 mL離心管中，并加入120 μL Opti-MEM，混勻后室溫靜置孵育5 min；再加入5 μL LipofectamineTM6000，孵育20 min，6 h后完全培養(yǎng)基補足至2 mL/孔，24 h后更換完全培養(yǎng)基。轉(zhuǎn)染后通過qRT-PCR驗證轉(zhuǎn)染效率。

1.4 MTT實驗檢測細胞增殖能力

取轉(zhuǎn)染48 h后的4組細胞，用完全培養(yǎng)基調(diào)整細胞量，以3 000個/100 μL的細胞懸液接種于96孔板中央（5復(fù)孔/組），分別于 24 h、48 h、72 h、96 h取1 塊96孔板，棄原培養(yǎng)基后加入5 mg/mL MTT工作液100 μL/孔，常規(guī)培養(yǎng) 4 h后棄上清液，加入DMSO 150 μL/孔，搖床上搖勻10 min后在酶標(biāo)儀上在570 nm處測吸光度（OD）值。以上實驗重復(fù)3次。

1.5 平板克隆形成實驗檢測細胞克隆形成能力

取轉(zhuǎn)染48 h后計數(shù)的4組細胞，充分吹勻至單個懸浮細胞，以500個/孔接種至預(yù)先加入5 mL完全培養(yǎng)基的6孔板（3復(fù)孔/組）中混勻，于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2～3周。當(dāng)孔板中出現(xiàn)肉眼可見的克隆時終止培養(yǎng)，棄培養(yǎng)基，用PBS浸洗3次，甲醇固定30 min，0.1%結(jié)晶紫染色1 h，風(fēng)干后拍照。以上實驗重復(fù)3次。

1.6 實時熒光定量PCR檢測Hsa-miR-4282的表達

采用天根公司miRcute Plus miRNA First-Strand cDNA Synthesis Kit逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA。反應(yīng)條件：42℃ 60 min；95℃5 min。按試劑盒說明書建立反應(yīng)體系，以U6為內(nèi)參進行相對定量分析。實時熒光定量PCR采用ABI公司Stepone Plus系統(tǒng)進行分析，反應(yīng)條件：95 ℃ 15 min；94 ℃ 20 s，65 ℃ 30 s，72 ℃34 s，5個循環(huán)；94 ℃ 20 s，60 ℃ 34 s，45個循環(huán)。采用2-△△Ct法分析各個樣品的相對表達量。以上實驗重復(fù)3次。

1.7 流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡情況

取計數(shù)后的肝癌SMMC-7721細胞，以4×105個/孔接種于6孔板中，24 h后轉(zhuǎn)染Hsa-miR-4282模擬物和抑制物。轉(zhuǎn)染48 h后收集孔內(nèi)細胞，按照BD公司AnnexinⅤFITC Apoptosis Detection KitⅠ試劑盒說明書操作，1 h內(nèi)上機檢測細胞凋亡。以上實驗重復(fù)3次。

1.8 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 22.0軟件進行統(tǒng)計分析，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，多組比較采用LSD-t檢驗；兩組間比較采用獨立樣本t檢驗。以雙側(cè)P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Hsa-miR-4282在不同肝細胞株及組織標(biāo)本中的表達

實時熒光定量PCR檢測結(jié)果顯示，Hsa-miR-4282在肝癌MHCC97-H細胞和肝癌SMMC-7721細胞中的相對表達量分別為0.523±0.048和0.411±0.069，以人正常肝上皮細胞HL-7702為對照，Hsa-miR-4282在肝癌MHCC97-H 細胞（t=14.146，P=0.005）和 SMMC-7721 細胞（t=12.153，P＜0.001）中的相對表達量均降低。HsamiR-4282在肝癌組織中的相對表達量為0.68±0.35，亦低于癌旁組織（t=3.987，P=0.001），見圖 1。

2.2 Hsa-miR-4282轉(zhuǎn)染肝癌SMMC-7721細胞

轉(zhuǎn)染Hsa-miR-4282 mimics及inhibitor 48 h后，上調(diào)組Hsa-miR-4282的相對表達量為28.326±2.301，其表達水平高于相應(yīng)陰性對照組（t=16.196，P=0.004）；下調(diào)組的相對表達量為0.287±0.037，其表達水平低于相應(yīng)陰性對照組（t=27.320，P=0.001），見圖 2。

圖1 Hsa-miR-4282在不同肝細胞及組織中的表達Fig.1 Expression of Hsa-miR-4282 in different liver cells and tissues

圖2 轉(zhuǎn)染后肝癌SMMC-7721細胞中Hsa-miR-4282的表達Fig.2 Expression of Hsa-miR-4282 in liver cancer SMMC-7721 cells after transfection

2.3 Hsa-miR-4282對肝癌SMMC-7721細胞增殖能力的影響

MTT實驗結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染24 h、48 h、72 h及96 h后，上調(diào)組肝癌SMMC-7721細胞OD值均低于其陰性對照組，而下調(diào)組OD值高于其陰性對照組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見表 1、圖 3。

7721 cells after transfection

表1 MTT法檢測轉(zhuǎn)染后肝癌SMMC-7721細胞的增殖情況Tab.1 MTT assay for detection of cell proliferation after upregulation and down-regulation of miR-4282

2.4 Hsa-miR-4282對肝癌SMMC-7721細胞克隆形成能力的影響

平板克隆實驗結(jié)果顯示，下調(diào)組肝癌SMMC-7721細胞克隆數(shù)高于下調(diào)陰性對照組［（240±7）個 vs（191±10）個，t=5.650，P=0.005）] ，而上調(diào)組細胞克隆數(shù)低于上調(diào)陰性對照組［（146±10）個 vs（193±12）個；t=4.310，P=0.013] ，見圖 4。

圖4 平板克隆形成檢測轉(zhuǎn)染后肝癌SMMC-7721細胞的克隆形成能力Fig.4 Plate colony formation assay for clonal formation ability of liver cancer SMMC-7721 cells after transfection

2.5 Hsa-miR-4282對肝癌SMMC-7721細胞凋亡的影響

流式細胞儀檢測結(jié)果顯示，上調(diào)組肝癌SMMC-7721細胞凋亡率高于其陰性對照組［（23.89±1.89）%vs（16.6±1.14）%，t=4.677，P=0.009] ，而下調(diào)組肝癌SMMC-7721細胞凋亡率低于其陰性對照組［（14.98±0.46）%vs（17.79±0.73）%，t=4.633，P=0.010] ，見圖 5。

圖5 流式細胞儀檢測轉(zhuǎn)染后肝癌SMMC-7721細胞的凋亡情況Fig.5 Flow cytometry for cell apoptosis of liver cancer SMMC-7721 cells after transfection

3 討論

目前研究證實多種miRNA可通過激活或抑制癌基因及抑癌基因的表達參與腫瘤的生物學(xué)行為［10-11]，其對惡性腫瘤診斷及預(yù)后判斷等亦有一定價值［12-13]，因此miRNA研究成為腫瘤研究的熱點之一。多項研究表明miRNA參與肝癌發(fā)生發(fā)展，其中miR-33a低表達提示肝癌預(yù)后不良［14]，miR-1468可促進肝癌細胞增殖和細胞周期進程，誘導(dǎo)細胞凋亡［15]，miR-608亦可抑制肝癌細胞增殖［16]，而miR-644a高表達抑制肝癌細胞增殖并促進細胞凋亡［17]。KANG 等［18]在結(jié)腸癌細胞HT29、HcT116、T84 研究中發(fā)現(xiàn)，miR-4282 表達明顯低于正常結(jié)腸細胞CCD-18Co，而抑制miR-4282高表達可促進細胞增殖，認為其在結(jié)腸癌中發(fā)揮抑癌基因作用?；谀壳皩sa-miR-4282及miRNA相關(guān)研究，我們推測Hsa-miR-4282差異表達亦可能與肝癌發(fā)生發(fā)展有關(guān)，且在正常肝細胞中發(fā)揮抑癌基因作用。為此本研究采用實時熒光定量PCR檢測肝癌組織及其癌旁組織，以及肝癌細胞SMMC-7721、MHCC97-H和正常肝上皮細胞HL-7702中Hsa-miR-4282的表達，發(fā)現(xiàn)肝癌組織和肝癌細胞中Hsa-miR-4282表達量均降低，提示該分子可能參與肝癌的發(fā)生發(fā)展。

為進一步觀察Hsa-miR-4282表達變化對肝癌生物學(xué)行為的影響，本研究進行了體外細胞功能實驗。鑒于肝癌SMMC-7721細胞中Hsa-miR-4282的表達相對較高，故選擇該細胞株進行后續(xù)功能實驗。通過轉(zhuǎn)染Hsa-miR-4282模擬物和抑制物調(diào)控肝癌SMMC-7721細胞中Hsa-miR-4282的表達，然后采用MTT實驗檢測細胞增殖能力，發(fā)現(xiàn)下調(diào)Hsa-miR-4282表達可促進肝癌SMMC-7721細胞增殖能力，而上調(diào)Hsa-miR-4282表達抑制了細胞增殖能力。平板克隆形成實驗結(jié)果顯示，上調(diào)Hsa-miR-4282后肝癌SMMC-7721細胞克隆形成能力減弱，而下調(diào)其表達則克隆形成能力增強。凋亡實驗亦證實上調(diào)Hsa-miR-4282使肝癌SMMC-7721細胞凋亡率增加，促進細胞凋亡；而下調(diào)則使細胞凋亡率降低，抑制細胞凋亡。以上實驗結(jié)果提示Hsa-miR-4282是肝癌發(fā)生發(fā)展中的一個重要分子，其在肝癌中低表達可促使細胞增殖能力增強，但具體作用機制不明。有研究發(fā)現(xiàn)miR-197可直接靶向Axin-2、裸露的角質(zhì)層 1（NKD1）和 Dickkopf相關(guān)蛋白2（DKK2），通過激活 Wnt/β-catenin 信號通路促進肝癌侵襲和轉(zhuǎn)移［19]。因此推測Hsa-miR-4282作用肝癌SMMC-7721細胞的途徑亦可能與miRNA調(diào)節(jié)靶基因mRNA的表達，進而影響細胞增殖及凋亡相關(guān)分子表達或激活相關(guān)通路有關(guān)。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)Hsa-miR-4282上調(diào)可抑制肝癌SMMC-7721細胞增殖，促進細胞凋亡，可能參與肝癌的發(fā)生發(fā)展，有望成為肝癌診斷的生物標(biāo)志物。但本研究僅從細胞增殖、凋亡方面分析了該分子對肝癌細胞的影響，其對其他細胞功能的影響以及具體的作用機制有待進一步研究。