謝曉楠 文貽勇 凌瓊穎 黃文鋒 覃芳卉 王洪學(xué) 周文獻(xiàn) 陸永奎 謝裕安 謝偉敏

對于無法接受酪氨酸激酶抑制劑（tyrosine kinase inhibitors，TKIs）治療或TKIs治療失敗后的進(jìn)展期非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）患者，含鉑類聯(lián)合方案是有效的治療措施，能顯著改善患者的生存質(zhì)量和預(yù)后［1-3]，而DNA修復(fù)通路相關(guān)基因的表達(dá)狀況或遺傳變異被認(rèn)為是影響含鉑類方案療效的重要因素［4-6]。本課題組在臨床實(shí)踐中發(fā)現(xiàn)，NSCLC患者接受含鉑類方案化療后其外周血中RAD23B mRNA的表達(dá)水平可能與其對鉑類藥物的敏感性有關(guān)。RAD23B基因是DNA修復(fù)通路的關(guān)鍵點(diǎn)，可影響腫瘤細(xì)胞對順鉑等藥物的敏感性［7-8]。研究顯示，RAD23B基因的單核苷酸多態(tài)性（singlenucleotide polymorphism，SNP）與肝癌等多種腫瘤的遺傳易感性有關(guān)［9-11]，但其與含鉑類方案治療NSCLC的療效及不良反應(yīng)的關(guān)系尚不明確。為此，本研究探討RAD23B基因rs10759225位點(diǎn)多態(tài)性與含鉑類方案一線治療晚期NSCLC患者的療效及血液學(xué)毒性的關(guān)系，為闡明兩者關(guān)系提供依據(jù)。

1 資料和方法

1.1 一般資料

從本課題組前期建立的肺癌患者臨床資料庫及外周血樣本庫中選擇2005年9月—2009年8月在廣西醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院治療的NSCLC患者。納入標(biāo)準(zhǔn)：⑴經(jīng)病理組織學(xué)或細(xì)胞學(xué)確診為NSCLC；⑵年齡18～70歲，美國東部腫瘤協(xié)作組（eastern cooperative oncology group，ECOG）評分 0～2分，預(yù)計生存期≥3個月；⑶TNM分期Ⅲ～Ⅳ期；⑷有化療適應(yīng)證且接受含順鉑（Cisplatin，DDP）或卡鉑（Carboplatin，CBP）方案一線化療，包括無表皮生長因子受體（epithelial growth factor receptor，EGFR）突變的初治患者，或有突變但接受TKIs治療后進(jìn)展且未接受過化療者，或既往手術(shù)和輔助治療后出現(xiàn)復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移者（無進(jìn)展生存期≥1年）；⑸入組時血常規(guī)、肝腎功能和心電圖檢查等指標(biāo)均基本正常，無化療禁忌證；⑹至少有1個經(jīng)CT等影像學(xué)檢查確定的可測量病灶；⑺自愿接受治療并簽署知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：⑴有癥狀的中樞神經(jīng)系統(tǒng)轉(zhuǎn)移；⑵心、肝、肺、腎等重要器官功能不全，無化療適應(yīng)證；⑶無法評價療效和血液學(xué)毒性者。本研究已獲得廣西醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2 治療方案

入組患者接受的含鉑類方案包括多西他賽聯(lián)合鉑類（DC方案）、培美曲塞聯(lián)合鉑類（PC方案）、吉西他濱聯(lián)合鉑類（GP方案）或長春瑞濱聯(lián)合鉑類（NP方案）等。鉑類藥物使用方法：DDP 25 mg/m2，d1～d3；或CBP曲線下面積（AUC）=5，d1。多西他賽、培美曲塞、吉西他濱等其他化療藥物的劑量和使用方法按常規(guī)。各化療方案均以21 d為1個周期。除非出現(xiàn)疾病進(jìn)展或患者不能耐受，否則至少化療2個周期（最多6個周期）?；熎陂g按常規(guī)給予5-羥色胺3受體（5-HT3R）拮抗劑聯(lián)合地塞米松止吐，注意保護(hù)心、肝、腎功能，必要時使用粒細(xì)胞集落刺激因子防治粒細(xì)胞減少癥等。

1.3 總DNA提取

所有入組患者均在接受含鉑類方案化療前抽取外周血2～5 mL，用乙二胺四乙酸（EDTA）抗凝。采用基因組DNA提取試劑盒按說明抽提總DNA，紫外分光光度儀檢測DNA濃度及純度，將符合要求的基因組DNA在-80℃冰箱凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 PCR及基因型檢測

通過My Sequenom網(wǎng)頁設(shè)計rs10759225位點(diǎn)的PCR擴(kuò)增引物，序列：上游引物為5'-GAGGGGTTTTGCGCACACG-3'；下游引物為 5'-TTTCTCACATTCC-ACTCATTCCTCA-3'，引物由上海生工生物有限公司合成。PCR反應(yīng)體系為20μL，其中含樣本DNA和多重PCR引物各1μL，其余同常規(guī)PCR反應(yīng)。PCR擴(kuò)增條件：95 ℃ 預(yù)變性2 min，94 ℃變性20 s，65 ℃退火40 s，72℃ 延伸90 s，共36個循環(huán)；72℃延伸2 min。擴(kuò)增片段長度為400 bp。PCR產(chǎn)物經(jīng)純化后，進(jìn)行連接反應(yīng)（94℃ 1 min，56℃ 4 min，38個循環(huán)）。采用改良多重高溫連接酶檢測反應(yīng)技術(shù)（上海天昊生物科技有限公司遺傳分析中心）進(jìn)行基因分型：取連接產(chǎn)物0.5μL，與Liz500 SIZE STANDARD 0.5 μL和Hi-Di 9 μL混勻，95℃變性5 min，然后使用 ABI3730XL測序儀檢測，采用 GeneMapper 4.1（Applied Biosystems，USA）對收集的原始數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

1.5 療效和不良反應(yīng)評價

每2個周期采用實(shí)體瘤療效評價標(biāo)準(zhǔn)（response evaluation criteria in solid tumors，RECIST）1.1 版進(jìn)行療效評價［12]，分為完全緩解（complete response，CR）、部分緩解（partial response，PR）、疾病穩(wěn)定（stable disease，SD）和疾病進(jìn)展（progressive disease，PD）。有效率（overall response rate，ORR）=（CR+PR）/總例數(shù)×100%，疾病控制率（disease control rate，DCR）=（CR+PR+SD）/總例數(shù)×100%。將CR和PR定義為化療有效，將SD和PD定義為化療無效。無進(jìn)展生存期（progress-free survival，PFS）定義為從含鉑類方案化療開始到腫瘤出現(xiàn)進(jìn)展的時間。每個周期采用通用不良事件術(shù)語標(biāo)準(zhǔn)4.0版（CTCAE 4.0）［13]評價不良反應(yīng)。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析。采用χ2檢驗(yàn)比較不同基因型病例組之間ORR和血液學(xué)毒性發(fā)生率的差異；采用比值比（OR）及其95%可信區(qū)間（CI）描述基因型與ORR及血液學(xué)毒性的關(guān)聯(lián)強(qiáng)度，以非條件Logistic回歸模型計算OR和95%CI，并校正潛在混淆因素：性別、年齡、吸煙狀況、ECOG評分（0～1分與2分）、TNM分期（Ⅲ期與Ⅳ期）、腫瘤組織學(xué)類型（鱗癌與非鱗癌）、放療史、輔助化療史、化療方案以及TKIs治療史。通過Kaplan-Meier繪制曲線，采用Log-rank檢驗(yàn)比較不同基因型患者PFS的差異。采用雙側(cè)概率檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 入組患者的臨床資料

共150例NSCLC患者符合入組條件。中位年齡55歲（22～70歲）；男性 106例，女性 44例；既往使用TKIs治療后進(jìn)展12例。其余詳細(xì)資料見表1。

表1 150例非小細(xì)胞肺癌患者的臨床資料Tab.1 Clinical data of 150 patients with non-small cell lung cancer

2.2 基因分型結(jié)果

所有樣本均分型成功，基因型分布符合Hardy-Weinberg平衡（P=0.276）。各基因型的頻率：G/G基因型 52.0%（78/150），G/A 基因型 40.0%（60/150），A/A基因型8.0%（12/150）；A等位基因型（G/A和A/A基因型）48.0%（72/150）。

2.3 療效

全部患者均完成至少2個周期化療，中位化療周期數(shù)為3個（2～6個周期），均可評估客觀療效，其中獲CR 3例（2.0%）、PR 40例（26.7%）、SD 66例（44.0%）、PD41例（27.3%），ORR為43例（28.7%）。Ⅲ期患者ORR為 35.7%（20/56），高于Ⅳ期患者的 24.5%（23/94），但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=2.171，P=0.141）。使用GP方案化療的患者占54.7%，但其ORR與其他方案組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。組織學(xué)類型為非鱗癌、ECOG評分0～1分、有TKIs治療史患者的ORR均高于對應(yīng)亞組，但差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

2.4 rs10759225位點(diǎn)多態(tài)性與化療療效的關(guān)系

以GG基因型為參照，A等位基因型在治療有效組中的頻率顯著高于無效組，攜帶A等位基因型患者對含鉑類方案的敏感性是攜帶G/G基因型患者的1.78 倍（OR校正=1.780，95%CI：1.110～2.884，P=0.042），見表2。

表2 rs10759225位點(diǎn)多態(tài)性與化療療效的關(guān)系［n（%）] Tab.2 Relationship between rs10759225 polymorphism and efficacy of chemotherapy［n（%）]

2.5 rs10759225位點(diǎn)多態(tài)性與預(yù)后的關(guān)系

隨訪至2016年12月31日，全組患者均可評價PFS，完成PFS隨訪后有35例失訪，由于失訪率過高，無法評價全組總生存期（overall survival，OS）。全組中位無進(jìn)展生存期（mPFS）為 5.6個月（95%CI：5.0～6.2個月）。G/G基因型患者mPFS為5.0個月（95%CI：3.3～6.7個月），G/A 基因型為 5.6個月（95%CI：3.6～7.6個月），A/A 基因型為 7.5個月（95%CI：4.7～10.3個月），A等位基因型為6.0個月（95%CI：5.2～6.8個月），各組PFS差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.537）。其中，A/A基因型患者的mPFS較G/G基因型患者延長2.5個月，但差異亦無統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.314），見圖1。

2.6 rs10759225位點(diǎn)多態(tài)性與化療相關(guān)血液學(xué)毒性的關(guān)系

2.6.1 rs10759225位點(diǎn)多態(tài)性與白細(xì)胞減少的關(guān)系 所有入組患者均可評價血液學(xué)毒性。白細(xì)胞減少組和未發(fā)生白細(xì)胞減少組中，各基因型頻率差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），見表3。但以G/G基因型為參照，A/A基因型在0～Ⅱ度白細(xì)胞減少組中的頻率顯著低于Ⅲ/Ⅳ度白細(xì)胞減少組（OR校正=0.468，95%CI：0.204～0.711，P=0.008），提示攜帶A/A基因型患者在化療后發(fā)生中重度白細(xì)胞減少的風(fēng)險顯著高于攜帶G/G基因型患者，見表4。

圖1 各基因型患者的無進(jìn)展生存曲線Fig.1 Progression-free survival curve of patients in each genotype group

表3 rs10759225位點(diǎn)多態(tài)性與化療后白細(xì)胞減少的關(guān)系［n（%）] Tab.3 Relationship between rs10759225 polymorphism and leukopenia［n（%）]

表4 rs10759225位點(diǎn)多態(tài)性與化療后白細(xì)胞減少程度的關(guān)系［n（%）] Tab.4 Relationshipbetween rs10759225polymorphism and degree of leukopenia［n（%）]

2.6.2 rs10759225位點(diǎn)多態(tài)性與中性粒細(xì)胞減少的關(guān)系 在發(fā)生中性粒細(xì)胞減少組和未發(fā)生中性粒細(xì)胞減少組中，各基因型的頻率差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），見表5。但以G/G基因型為參照，A等位基因型的頻率在0～Ⅱ度中性粒細(xì)胞減少組中顯著低于Ⅲ/Ⅳ度中性粒細(xì)胞減少組（OR校正=0.502，95%CI：0.155～0.887，P=0.022），提示攜帶A等位基因型患者在化療后發(fā)生中重度中性粒細(xì)胞減少的風(fēng)險較攜帶G/G基因型患者顯著增高，見表6。

表5 rs10759225位點(diǎn)多態(tài)性與化療后出現(xiàn)中性粒細(xì)胞減少的關(guān)系［n（%）] Tab.5 Relationship between rs10759225 polymorphism and neutropenia［n（%）]

表6 rs10759225位點(diǎn)多態(tài)性與化療后中性粒細(xì)胞減少程度的關(guān)系［n（%）] Tab.6 Relationship between rs10759225polymorphism and degree of neutropenia［n（%）]

2.6.3 rs10759225位點(diǎn)多態(tài)性與血小板減少的關(guān)系全組無患者出現(xiàn)Ⅳ度血小板減少。分析顯示，與攜帶G/G基因型患者比較，攜帶A等位基因型患者化療后發(fā)生血小板減少的風(fēng)險顯著增高（OR校正=0.494，95%CI：0.101～0.833，P=0.047），見表 7。

表 7 rs10759225位點(diǎn)多態(tài)性與化療后中性粒細(xì)胞減少的關(guān)系［n（%）] Tab.7 Relationship between rs10759225 polymorphism and neutropenia［n（%）]

2.6.4 rs10759225位點(diǎn)多態(tài)性與貧血的關(guān)系 全組無患者出現(xiàn)Ⅳ度貧血。各基因型的頻率在發(fā)生貧血組中與未發(fā)生貧血組的差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），見表8。但與攜帶G/G基因型患者比較，攜帶G/A基因型患者在化療后發(fā)生Ⅱ/Ⅲ度貧血的風(fēng)險顯著增高（OR校正=0.504，95%CI：0.213～0.890，P=0.047），見表9。

表8 rs10759225位點(diǎn)多態(tài)性與化療后貧血的關(guān)系［n（%）] Tab.8 Relationship between rs10759225 polymorphism and anemia［n（%）]

表9 rs10759225位點(diǎn)多態(tài)性與化療后貧血程度的關(guān)系［n（%）] Tab.9 Relationship between rs10759225 polymorphism and degree of anemia［n（%）]

3 討論

探索將DNA修復(fù)基因或其遺傳變異位點(diǎn)作為預(yù)測化療等治療手段療效和不良反應(yīng)的分子生物標(biāo)志物，以指導(dǎo)臨床實(shí)施精準(zhǔn)治療是NSCLC研究領(lǐng)域的重要內(nèi)容［5，14-15]。RAD23B 基因定位于人類染色體9q31.2，是核苷酸切除修復(fù)通路修復(fù)順鉑等大分子引起DNA雙鏈損傷的關(guān)鍵因子［8]。當(dāng)DNA損傷發(fā)生后，RAD23B蛋白與著色性干皮病基因組C（XPC）蛋白結(jié)合形成的XPC-RAD23B復(fù)合體可最先結(jié)合到損傷部位，識別損傷片段和啟動修復(fù)過程［7，16-17]。RAD23B基因遺傳變異與腫瘤的相關(guān)研究已有報道，涉及的多態(tài)性位點(diǎn)包括rs1805329（又稱Ala249Val）和rs10739234等，其中有關(guān)rs1805329位點(diǎn)的研究最多，其他位點(diǎn)的研究少見。研究表明，rs1805329位點(diǎn)多態(tài)性與乳腺癌［9]、原發(fā)性肝癌［10]及非霍奇金淋巴瘤［11]的遺傳易感性有關(guān)，與攜帶TT基因型個體比較，攜帶CC基因型的個體罹患癌癥的風(fēng)險顯著增高。一項(xiàng)研究［18]在接受含DDP方案一線治療的NSCLC患者中，分析了rs1805329等位點(diǎn)多態(tài)性與預(yù)后的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)攜帶rs1805329位點(diǎn)TT基因型患者的死亡風(fēng)險是攜帶CC基因型患者的2.08倍。但另一項(xiàng)在NSCLC患者中開展的相似研究（接受含鉑方案治療）卻未發(fā)現(xiàn)該位點(diǎn)多態(tài)性與NSCLC患者的生存期有關(guān)［19]。一些研究還探討了rs1805329位點(diǎn)多態(tài)性與食管癌［20]、直腸癌［21]同期放化療引起的急性毒性反應(yīng)的關(guān)系，但均未發(fā)現(xiàn)存在相關(guān)性。關(guān)于RAD23B基因的其他位點(diǎn)，僅檢索到一項(xiàng)研究報道了rs10739234位點(diǎn)多態(tài)性與乳腺癌發(fā)病風(fēng)險相關(guān)［9]。

本研究分析的rs10759225位點(diǎn)位于RAD23B基因的內(nèi)含子區(qū)，其多態(tài)性表現(xiàn)為腺嘌呤（A）被鳥嘌呤（G）替代。此位點(diǎn)發(fā)生突變對RAD23B功能的影響目前尚不明確，其與腫瘤的遺傳易感性、抗腫瘤治療的療效、不良反應(yīng)及患者預(yù)后等關(guān)系亦未見報道。本研究結(jié)果顯示，rs10759225位點(diǎn)多態(tài)性與含鉑類方案治療NSCLC的療效顯著相關(guān)，攜帶A等位基因型的患者治療有效（CR或PR）的概率顯著高于攜帶G/G基因型的患者。但未發(fā)現(xiàn)該位點(diǎn)多態(tài)性與患者的PFS有關(guān)，可能原因?yàn)槠渌麧撛诘幕祀s因素影響了此位點(diǎn)的遺傳變異與患者預(yù)后的關(guān)系。而在RAD23B基因多態(tài)性與含鉑類方案治療NSCLC患者的預(yù)后關(guān)系方面，現(xiàn)有研究的報道結(jié)果也不一致［18-19]。因此，RAD23B基因的rs10759225等位點(diǎn)的遺傳變異對NSCLC患者生存期的影響尚待進(jìn)一步研究。

本研究還發(fā)現(xiàn)，以G/G基因型為參照，含A等位（A/A和/或G/A）的基因型與含鉑類方案化療引起的血液學(xué)毒性密切相關(guān)。其中，A/A基因型與患者化療后發(fā)生Ⅲ/Ⅳ度白細(xì)胞減少的風(fēng)險相關(guān)，A等位基因型則與患者發(fā)生Ⅲ/Ⅳ度中性粒細(xì)胞減少和≥Ⅰ度血小板減少的風(fēng)險相關(guān)，而G/A基因型與發(fā)生Ⅱ/Ⅲ度貧血的風(fēng)險有關(guān)。為了消除潛在混淆因素對探討rs10759225位點(diǎn)多態(tài)性與相關(guān)指標(biāo)關(guān)系的影響，本研究在關(guān)聯(lián)分析中對性別、年齡、TNM分期和化療方案等多個因素進(jìn)行了校正。結(jié)果表明，此位點(diǎn)可作為預(yù)測NSCLC患者對含鉑類方案的敏感性及發(fā)生骨髓抑制風(fēng)險的遺傳標(biāo)志物。由于rs10759225位點(diǎn)位于RAD23B基因的內(nèi)含子區(qū)，其發(fā)生的堿基突變并不影響基因編碼的mRNA和蛋白質(zhì)，因此該位點(diǎn)影響化療療效及相關(guān)血液學(xué)毒性的作用機(jī)制尚待進(jìn)一步研究。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)RAD23B基因rs10759225位點(diǎn)多態(tài)性與含鉑類方案一線治療NSCLC的客觀緩解率及血液學(xué)毒性的發(fā)生風(fēng)險有關(guān)，此位點(diǎn)可能成為有效的療效預(yù)測指標(biāo)，為NSCLC患者的個體化治療提供依據(jù)。本研究入組的患者均在我院接受規(guī)范化診治，療效和不良反應(yīng)評估的一致性良好，但部分患者化療無效或出現(xiàn)疾病進(jìn)展后，由于經(jīng)濟(jì)等原因終止后續(xù)治療，造成失訪率偏高，無法分析此位點(diǎn)的遺傳變異與患者總生存期的關(guān)系，有關(guān)方面有待進(jìn)一步研究。