徐冬云 王娟 李可 于觀貞 俞文隆 徐永茂

Homebox（HOX）基因是由183個(gè)核苷酸組成的保守序列，通過(guò)編碼一類轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，特異性調(diào)控靶基因，進(jìn)而影響胚胎發(fā)育及細(xì)胞增殖等。近年來(lái)，多種實(shí)體腫瘤及白血病均發(fā)現(xiàn)HOX基因表達(dá)失調(diào)，且與惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展、浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移、誘導(dǎo)血管生成等生物學(xué)行為及預(yù)后密切相關(guān)［1-2]。HOXC8是HOX基因簇的重要成員，在多種實(shí)體瘤組織中過(guò)高或過(guò)低表達(dá)，如食管癌［3]、乳腺癌［4]、非小細(xì)胞肺癌［5]等，但其在肝門部膽管癌中的表達(dá)及臨床價(jià)值鮮有報(bào)道。本研究采用免疫組化法檢測(cè)HOXC8在人肝門部膽管癌組織中的表達(dá)，并探討其表達(dá)與臨床病理特征和預(yù)后的相關(guān)性。

1 材料與方法

1.1 一般資料

收集東方肝膽外科醫(yī)院2003年1月至2005年5月收治的49例肝門部膽管癌患者及其對(duì)應(yīng)癌旁正常組織的石蠟標(biāo)本。所有患者均經(jīng)病理組織學(xué)檢查確診，術(shù)前均未行放化療，其中男性25例，女性24例；中位年齡59歲（31～79歲），年齡≤55歲35例，＞55歲14例；腫瘤大小≤3 cm 18例，＞3 cm 31例。TNM分期依據(jù)美國(guó)癌癥聯(lián)合會(huì)（AJCC）第7版，T分期：T1～3期7例，T4期42例；N分期：N0期16例，N1～2期33例；TNM分期：Ⅰ/Ⅱ期20例，Ⅲ/Ⅳ期29例。分化程度：中/高分化37例，低/未分化12例；所有腫瘤組織病理診斷均為膽管腺癌，肝細(xì)胞癌、肉瘤、淋巴瘤等均排除。本研究經(jīng)我院倫理委員會(huì)審查批準(zhǔn)（批準(zhǔn)文號(hào)：2019005），患者簽署知情同意書(shū)。

1.2 主要試劑

SP免疫組化試劑盒、多聚-L-賴氨酸及DAB試劑盒均購(gòu)自福州邁新生物技術(shù)開(kāi)發(fā)公司，HOXC8抗體購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司。

1.3 免疫組化染色

切片、烘片、常規(guī)脫蠟、水化、PBS沖洗，檸檬酸修復(fù)液中微波修復(fù)。根據(jù)SP法阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，血清封閉各10 min，滴加HOXC8（sc-49823；稀釋比例1∶100）一抗，4 ℃孵育過(guò)夜，滴加二抗，DAB 顯色，蘇木素復(fù)染，0.1%HCl分化，自來(lái)水沖洗，藍(lán)化，切片經(jīng)梯度酒精脫水干燥，二甲苯透明，中性樹(shù)膠封固。PBS替代一抗作陰性對(duì)照。

1.4 結(jié)果判斷

于光鏡下觀察切片，每例切片隨機(jī)選取5個(gè)高倍鏡視野行結(jié)果判讀，由2名以上病理醫(yī)師確認(rèn)結(jié)果。HOXC8陽(yáng)性染色為淡黃色、棕黃色或棕褐色，定位于細(xì)胞質(zhì)。評(píng)分采用二級(jí)計(jì)分法：⑴按陽(yáng)性細(xì)胞所占比例計(jì)數(shù)，其中陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)≤5%計(jì)0分，6%～25%計(jì)1分，26%～50%計(jì) 2分，51%～75%計(jì)3分，＞75%計(jì)4分；⑵按染色強(qiáng)度分類，其中無(wú)陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)0分，淡黃色計(jì)1分，黃或深黃色計(jì)2分，褐或棕褐色計(jì)3分。將兩者計(jì)分相乘，乘積≥3分為陽(yáng)性表達(dá)［6]。

1.5 隨訪

通過(guò)電話、書(shū)信和查詢醫(yī)院病案等方式隨訪。隨訪截至2011年2月28日。49例患者隨訪資料完整，隨訪1～59個(gè)月，中位隨訪時(shí)間為37個(gè)月?？偵嫫冢∣S）定義為手術(shù)當(dāng)日至患者死亡或末次隨訪的時(shí)間。疾病進(jìn)展時(shí)間（TTP）定義為手術(shù)當(dāng)日至患者術(shù)后腫瘤復(fù)發(fā)的時(shí)間。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 20.0及GraphPad Prism 5.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析和繪圖。計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)：?jiǎn)我蛩厣娣治霾捎肒aplan-Meier法，組間比較采用Log-rank檢驗(yàn)；多因素生存分析采用Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型。以雙側(cè)P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HOXC8在人肝門部膽管癌組織及癌旁正常組織中的表達(dá)

HOXC8主要染色于腫瘤細(xì)胞質(zhì)，陽(yáng)性染色為淡黃、棕黃乃至深褐色，彌漫性分布，癌旁正常細(xì)胞中呈淡黃色或不著色見(jiàn)圖A1～A3、B1～B3。HOXC8在肝門部膽管癌組織中的陽(yáng)性表達(dá)率為57.1%（28/49），高于癌旁正常組織的陽(yáng)性表達(dá)率42.9%（21/49），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001），其相對(duì)表達(dá)量見(jiàn)圖1C。

2.2 HOXC8表達(dá)與肝門部膽管患者臨床病理特征的關(guān)系

HOXC8表達(dá)與肝門部膽管癌患者腫瘤浸潤(rùn)深度（P=0.001）、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（P=0.011）、TNM 分期（P=0.044）相關(guān)，而與年齡、性別、腫瘤大小及分化程度無(wú)關(guān)（P＞0.05）。見(jiàn)表 1。

圖1 HOXC8在肝門部膽管癌組織及癌旁正常組織中的表達(dá)Fig.1 Expression of HOXC8 in hilar cholangiocarcinoma and adjacent non-cancerous tissues

表1 HOXC8表達(dá)與肝門部膽管癌患者臨床病理特征的關(guān)系Tab.1 Correlation between the expression of HOXC8 and clinico pathological parameters of patients with hilar cholan giocarcinoma

2.3 HOXC8表達(dá)與預(yù)后的關(guān)系

圖2 HOXC8與肝門部膽管癌患者預(yù)后的關(guān)系Fig.2 Relationship between expression of HOXC8 and prognosis of patients with hilar cholangiocarcinoma

單因素分析顯示，HOXC8陽(yáng)性表達(dá)患者中位OS為12個(gè)月，明顯低于HOXC8陰性表達(dá)患者的46個(gè)月（P＜0.001），見(jiàn)圖2A；HOXC8陽(yáng)性患者中位TTP 亦明顯較低表達(dá)者短（9個(gè)月 vs 39個(gè)月，P＜0.001），見(jiàn)圖2B。肝門部膽管癌患者腫瘤浸潤(rùn)深度（P=0.006）、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（P=0.018）及術(shù)式（P=0.002）與術(shù)后疾病進(jìn)展時(shí)間有關(guān)，見(jiàn)表2。COX多因素回歸分析顯示，HOXC8是影響肝門部膽管癌患者預(yù)后的獨(dú)立因素（P=0.039），而腫瘤浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及術(shù)式均不是肝門部膽管癌患者的獨(dú)立預(yù)后因素。見(jiàn)表3。

3 討論

肝門部膽管癌亦稱高位膽管癌、Klatskin瘤，是原發(fā)于肝總管與左、右肝管結(jié)合部的膽管細(xì)胞癌，發(fā)生率占肝外膽管癌的50%～70%［7]。因肝門部膽管癌起病隱匿，早期診斷困難，易侵犯周圍肝動(dòng)脈、門靜脈，手術(shù)根治切除率低，預(yù)后極差，5年生存率不足10%［8]。即使行根治性腫瘤切除術(shù)，術(shù)后復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移率仍居高不下，術(shù)后放化療、光動(dòng)力治療、靶向治療及免疫治療等多種輔助治療手段貫穿肝門部膽管癌患者治療始終，亦收效甚微，故尋找肝門部膽管癌早期診斷標(biāo)志物和基因治療新靶點(diǎn)尤為重要。目前，相對(duì)于其他實(shí)體瘤，有關(guān)肝門部膽管癌的分子腫瘤標(biāo)志物報(bào)道較少。我們前期研究發(fā)現(xiàn)PKM2在肝門部膽管癌中表達(dá)上調(diào)，且是其獨(dú)立預(yù)后因子和治療靶點(diǎn)，機(jī)制可能與PKM2調(diào)節(jié)SDC2表達(dá)和神經(jīng)侵犯有關(guān)［9]。

表2 影響肝門部膽管癌患者生存的單因素和多因素分析Tab.2 Univariate and multivariate analysis of survival in patients with hilar cholangiocar cinoma

圖3 影響肝門部膽管癌術(shù)后疾病進(jìn)展的單因素和多因素分析Tab.3 Univariate and multivariate analysis of postoperative disease progression in patients with hilar cholangioc arcinoma

HOXC8是位于12號(hào)染色體的HOXC簇基因之一，早期研究顯示，HOXC8作為驅(qū)動(dòng)基因參與了軟骨發(fā)育［10-11]。隨著研究深入，研究者發(fā)現(xiàn)HOXC8在多種人類腫瘤中高表達(dá)，且在促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲轉(zhuǎn)移、化療耐藥中扮演重要角色。CHENG等［12]通過(guò)免疫組化法檢測(cè)50例骨肉瘤患者HOXC8蛋白的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)其在62.0%的癌組織中呈高表達(dá)，且HOXC8表達(dá)與低分化或未分化相關(guān)，生存分析顯示HOXC8高表達(dá)患者預(yù)后不良。HUANG等［13]研究發(fā)現(xiàn) HOXC8在宮頸癌組織和宮頸癌細(xì)胞中表達(dá)均增加，siRNA下調(diào)HOXC8表達(dá)可顯著抑制宮頸癌細(xì)胞生長(zhǎng)。同樣，沉默HOXC8可抑制上皮性卵巢癌細(xì)胞增殖、遷移和誘導(dǎo)凋亡，可能與增加ZAC1的表達(dá)有關(guān)［14]。ZHANG等［15]研究報(bào)道與正常乳腺組織相比，HOXC8在晚期乳腺癌中表達(dá)水平明顯升高，且與乳腺癌患者較差的遠(yuǎn)端無(wú)轉(zhuǎn)移生存率關(guān)系密切，并指出HOXC8可激活CDH11的轉(zhuǎn)錄從而促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞侵襲、轉(zhuǎn)移。HOXC8亦可作為轉(zhuǎn)錄抑制劑抑制EMB的表達(dá)，從而促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)和遷移［16]。但SHAH等［17]發(fā)現(xiàn)HOXC8在所有乳腺分子亞型的干細(xì)胞/祖細(xì)胞中均持續(xù)下調(diào)，可能是候選的乳腺腫瘤抑制基因，上調(diào)HOXC8表達(dá)，可減少乳腺癌干細(xì)胞數(shù)量和抑制乳腺癌細(xì)胞增殖，而下調(diào)其表達(dá)，則增加干細(xì)胞的自我更新，阻止維甲酸誘導(dǎo)的分化，促進(jìn)乳腺腫瘤發(fā)生。此外，有研究發(fā)現(xiàn)下調(diào)肝癌Hep G2細(xì)胞中HOXC8的表達(dá)，可延緩G1-S相變，抑制肝癌細(xì)胞增殖，并降低其對(duì)奧沙利鉑的抗性，表明HOXC8的表達(dá)可能影響了肝癌對(duì)奧沙利鉑的化療敏感性［18]。上述研究表明HOXC8可能在腫瘤發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用，而其作用機(jī)制復(fù)雜。

本研究采用免疫組化法檢測(cè)HOXC8在49例肝門部膽管癌組織中的表達(dá)，結(jié)果顯示HOXC8在腫瘤組織的陽(yáng)性表達(dá)率高于癌旁正常組織，且HOXC8表達(dá)與腫瘤浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，進(jìn)一步單因素生存分析顯示，HOXC8陽(yáng)性表達(dá)患者的中位OS及中位TTP均明顯較陰性患者差，多因素分析顯示HOXC8是肝門部膽管癌患者的獨(dú)立預(yù)后因子。上述結(jié)果表明，隨著腫瘤進(jìn)展，HOXC8表達(dá)逐步上調(diào)，且HOXC8高表達(dá)患者預(yù)后較差，提示HOXC8可能作為促癌基因參與肝門部膽管癌的發(fā)生發(fā)展，但其具體調(diào)控機(jī)制仍需深入研究。XU等［18]在肝細(xì)胞癌研究中亦發(fā)現(xiàn)HOXC8表達(dá)上調(diào)，且與組織學(xué)分級(jí)呈正相關(guān)，與本研究結(jié)果一致。

綜上所述，HOXC8高表達(dá)與肝門部膽管癌的轉(zhuǎn)移和預(yù)后差密切相關(guān)，有可能成為肝門部膽管癌的預(yù)后標(biāo)志物和潛在治療靶點(diǎn)。但本研究樣本量較少，今后需進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量深入研究，明確其在腫瘤發(fā)生發(fā)展的作用及調(diào)控機(jī)制。