楊金鳳，李潔

（河北民族師范學(xué)院生物與食品科學(xué)系，河北 承德 067000）

酸棗 Ziziphus jujuba Mill.var.spinosa （Bunge）Hu ex H.F.Chow 是鼠李科（Rhamnaceae）棗屬（Ziziphus）植物，其渾身是寶，果實(shí)營養(yǎng)成分豐富，酸棗仁是傳統(tǒng)中藥材?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明，酸棗葉在寧心安神，提高睡眠質(zhì)量等方面具有其獨(dú)到功效，有“東方睡葉”之美稱。此外，王迎進(jìn)等[1-2]研究表明，酸棗葉多糖具有明顯清除氧自由基作用及還原能力，是一種優(yōu)良的天然抗氧化劑和自由基清除劑。裴香萍等[3]發(fā)現(xiàn)山西省不同產(chǎn)地的酸棗葉中蘆丁含量在5～6月份最高，隨后下降，在10月份有所回升。李蘭芳[4]研究發(fā)現(xiàn)，河北省邢臺(tái)地區(qū)的酸棗葉中黃酮類成分主要是蘆丁，還有3 個(gè)黃酮類成分，總黃酮含量和蘆丁含量以10月份含量最高。這些研究為酸棗葉的開發(fā)利用提供了基礎(chǔ)。

微生物發(fā)酵茶是在以茶葉或其他植物葉片為主的基質(zhì)中接種特定的微生物，通過其代謝作用使茶葉或葉片發(fā)生深度的良性生理生化變化，從而改善茶葉品質(zhì)[5]。發(fā)酵茶所涉及到的微生物種類很多，如乳酸桿菌、醋酸桿菌、酵母菌、霉菌、食藥用真菌[6]。其中用食藥用真菌發(fā)酵葉茶，因真菌的酶解作用，可使植物葉片中的有效成分能更好的析出，口味好，易吸收[7-9]。同時(shí)，兼有茶和所接種藥用真菌的營養(yǎng)和生物活性成分，具有保健功能[10]。

目前，市面上有極少量酸棗葉茶出售，主要是采取的一般綠茶制作工藝制備而成，價(jià)格昂貴且只含單一的酸棗葉的活性物質(zhì)成分，靠浸泡難以保證其功能成分完全浸出。因此，采用現(xiàn)代生物發(fā)酵技術(shù)，利用食用真菌，開發(fā)酸棗葉發(fā)酵茶新產(chǎn)品，對(duì)提高酸棗葉茶的技術(shù)水平，增加野生酸棗產(chǎn)品的附加值，促進(jìn)山區(qū)經(jīng)濟(jì)的發(fā)展具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

酸棗葉：承德月光之夢(mèng)農(nóng)業(yè)專業(yè)合作社；靈芝菌種：平泉希才食用菌公司；秀珍菇、香菇、雪玉松茸菌種：特色生物資源開發(fā)科研室保存；小麥米、玉米、黑米、薏仁：超市；蘆?。禾K州天可貿(mào)易有限公司；齊墩果酸：上海融禾醫(yī)藥科技有限公司；香草醛：天津市凱通化學(xué)試劑有限公司；蒽酮：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；亞硝酸鈉、硝酸鋁、硫酸、乙醇、葡萄糖等均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

HS-1300 超凈工作臺(tái)：蘇州蘇潔凈化設(shè)備有限公司；SHB-3 循環(huán)水多用真空：真空杜甫儀器廠；RE-2000A 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器：上海亞榮生化儀器廠；752N 紫外可見分光光度計(jì)：上海精密儀器科學(xué)有限公司；TU-1900雙光束紫外可見分光光度計(jì)：北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；SHZ-82AB 數(shù)顯冷凍恒溫振蕩器：常州榮華儀器制造有限公司。

1.3 方法

1.3.1 食用菌培養(yǎng)基的配制

采用馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基[11]。

1.3.2 酸棗葉發(fā)酵基質(zhì)的配制

根據(jù)食用菌菌絲生長(zhǎng)營養(yǎng)需求，將5 g 酸棗葉與雜糧按5 ∶2（質(zhì)量比）的比例加到50 mL 燒杯中，再加入15 mL 蒸餾水?dāng)嚢杈鶆颍饪?。滅菌備用?/p>

1.3.3 固體發(fā)酵培養(yǎng)

將接入適量液體菌中的酸棗葉發(fā)酵基質(zhì)封口，放入恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.3.4 黃酮含量的測(cè)定

黃酮含量的測(cè)定采用亞硝酸鈉——硝酸鋁法[12]。

1.3.5 三萜含量的測(cè)定

三萜含量的測(cè)定采用香草醛——冰乙酸法[13]。

1.3.6 多糖含量的測(cè)定

多糖含量的測(cè)定采用蒽酮——硫酸法[14]。

1.3.7 發(fā)酵單因素試驗(yàn)

1.3.7.1 發(fā)酵菌種的篩選

將雪玉松茸、香菇、秀珍菇、靈芝接入配制好的酸棗葉發(fā)酵基質(zhì)內(nèi)，每組3 個(gè)重復(fù)試驗(yàn)。放入恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，待其中一瓶長(zhǎng)滿全部取出，烘干后打成粉，備用。

1.3.7.2 接種量的篩選

分別向每瓶酸棗葉發(fā)酵基質(zhì)內(nèi)接入0、5、10、15、20 mL 的菌液，每組設(shè)3 個(gè)重復(fù)試驗(yàn)。放入恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，待其中一瓶長(zhǎng)滿全部取出，打成粉，備用。

1.3.7.3 發(fā)酵時(shí)間的篩選

向每瓶酸棗葉發(fā)酵基質(zhì)內(nèi)接入等量的菌液，每組設(shè)3 個(gè)重復(fù)試驗(yàn)。放入恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，分別在0、3、6、9、12、15 d 取樣，烘干后打成粉備用。

1.3.7.4 雜糧種類的篩選

分別將等量的菌液接入添加不同雜糧的酸棗葉發(fā)酵基質(zhì)內(nèi)，做好標(biāo)記，每組設(shè)3 個(gè)重復(fù)試驗(yàn)。放入恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，待其中一瓶長(zhǎng)滿全部取出，打成粉，備用。

1.3.8 發(fā)酵正交試驗(yàn)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，以添加雜糧種類、發(fā)酵時(shí)間、接種量，設(shè)計(jì)三因素三水平L9（33）正交試驗(yàn)，對(duì)酸棗葉發(fā)酵茶的配方及工藝進(jìn)行優(yōu)化。試驗(yàn)因素水平設(shè)計(jì)見表1。

表1 試驗(yàn)因素水平設(shè)計(jì)Table 1 Horizontal design of test factors

1.3.9 驗(yàn)證試驗(yàn)

在正交試驗(yàn)的最佳條件下，分第1、2、3 組，每組3個(gè)重復(fù)，進(jìn)行發(fā)酵；分別測(cè)定酸棗葉發(fā)酵物中黃酮、三萜、多糖的含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵菌種的篩選

2.1.1 不同菌種在酸棗葉發(fā)酵基質(zhì)中的生長(zhǎng)情況

接種不同的菌種在1.3.2 酸棗葉發(fā)酵基質(zhì)中，其菌絲生長(zhǎng)的情況不同，見表2。

表2 不同菌種在酸棗葉發(fā)酵培養(yǎng)基中菌絲生長(zhǎng)情況差異Table 2 Differences of mycelium growth among different strains in jujube leaf fermentation medium

通過測(cè)量菌絲生長(zhǎng)速度，由表2 可知，靈芝菌絲在酸棗葉基質(zhì)中的生長(zhǎng)速度最快，顯著優(yōu)于其他的食用菌菌絲生長(zhǎng)速度。

2.1.2 不同菌種對(duì)酸棗葉發(fā)酵物中活性成分含量的影響

對(duì)接種不同菌種的酸棗葉發(fā)酵物的生物活性物質(zhì)含量進(jìn)行測(cè)定，見圖1。

圖1 不同菌種對(duì)發(fā)酵物活性成分含量的影響Fig.1 Effect of different strains on the content of active components of fermentation

如圖1所示，發(fā)現(xiàn)接種雪玉松茸的酸棗葉發(fā)酵物的黃酮含量最高，其次為接種靈芝、香菇的發(fā)酵物，接種秀珍菇的酸棗葉發(fā)酵物黃酮含量最低比接種雪玉松茸的低60%；測(cè)定發(fā)酵物三萜含量，發(fā)現(xiàn)三萜含量最高的為酸棗葉靈芝發(fā)酵物，比接種雪玉松茸、香菇、秀珍菇的分別高39%、21%和36%，說明接種靈芝有利于提高三萜含量；而酸棗葉發(fā)酵物多糖含量最高的為接種雪玉松茸的發(fā)酵物，其次為接種秀珍菇的發(fā)酵物，香菇發(fā)酵物多糖含量最低。

2.2 接種量對(duì)酸棗葉發(fā)酵物生物活性物質(zhì)含量的影響

不同接種量對(duì)發(fā)酵物中活性成分含量的影響，見圖2。

圖2 不同接種量對(duì)發(fā)酵物中活性成分含量的影響Fig.2 Effect of different inoculation amount on the content of active components in fermentation

如圖2所示，未接種靈芝的發(fā)酵基質(zhì)中黃酮的含量遠(yuǎn)高于接種靈芝的培養(yǎng)基，且隨著接種量的增加黃酮含量呈下降趨勢(shì)，原因可能是靈芝生長(zhǎng)過程中消耗了黃酮類物質(zhì)，導(dǎo)致黃酮含量減少；接種量為15 mL 的發(fā)酵基質(zhì)中三萜含量最高，且明顯高于接種量為5 mL和10 mL；多糖含量最高的為未接靈芝菌種的試驗(yàn)組，且顯著高于其他組，比最低的高52%，可能在發(fā)酵的過程中靈芝菌絲的生長(zhǎng)需要大量的糖所致。

2.3 發(fā)酵時(shí)間對(duì)酸棗葉發(fā)酵物生物活性物質(zhì)含量的影響

在不同發(fā)酵時(shí)間取樣，測(cè)定不同酸棗葉發(fā)酵物中黃酮的含量，見圖3。

圖3 不同發(fā)酵時(shí)間對(duì)發(fā)酵物中活性成分含量的影響Fig.3 Effect of different fermentation time on the content of active components in fermentation products

結(jié)果如圖3，發(fā)酵物中黃酮含量，在0～9 d 內(nèi)隨著發(fā)酵時(shí)間的增加而降低，在9 d～15 d 內(nèi)黃酮含量基本保持不變，可能是在發(fā)酵的前期靈芝菌絲生長(zhǎng)過程中利用黃酮生成其他新的物質(zhì)；發(fā)酵物中三萜含量，在發(fā)酵的1 d～6 d 內(nèi)隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)而減少，6 d～9 d內(nèi)三萜含量增加，在9 d 達(dá)到最高，然后又隨發(fā)酵時(shí)間的增加而減少，到12 d 以后基本保持不變。發(fā)酵物中多糖含量，在0～3 d 內(nèi)隨著發(fā)酵時(shí)間的增加而增加，并且在第3 天有最大值達(dá)88.65 mg/g，之后隨著發(fā)酵時(shí)間的增加而減少。

2.4 不同雜糧對(duì)酸棗葉固體發(fā)酵的影響

添加不同雜糧對(duì)發(fā)酵物中活性成分含量的影響，見圖4。

圖4 添加不同雜糧對(duì)發(fā)酵物中活性成分含量的影響Fig.4 Effect of adding different grains on the content of active components in fermentation

由圖4 可知，純酸棗葉發(fā)酵物中黃酮含量最高，其次依次為發(fā)酵基質(zhì)中添加薏仁、小麥米、玉米的發(fā)酵物，黃酮含量最少的是發(fā)酵基質(zhì)中添加黑米的發(fā)酵物；三萜含量最高的是添加薏仁的發(fā)酵物，且顯著高于其他組，其次依次為添加小麥米、玉米、黑米的發(fā)酵物，純酸棗葉三萜含量最少，比添加薏仁的組少50%。原因可能是薏仁中含有三萜類物質(zhì)；添加薏仁的發(fā)酵物中多糖含量最高，純酸棗葉發(fā)酵物中多糖含量最低，比添加薏仁的降低了65.5%。

2.5 正交試驗(yàn)酸棗葉發(fā)酵物中生物活性含量分析

根據(jù)單因素的試驗(yàn)結(jié)果，選取影響因子合適區(qū)間值進(jìn)行正交試驗(yàn)，正交試驗(yàn)發(fā)酵物中黃酮含量、三萜含量和多糖含量分別見表3、表4 和表5。

表3 正交試驗(yàn)黃酮含量分析Table 3 Analysis of flavonoids in orthogonal test

表4 正交試驗(yàn)發(fā)酵物三萜含量分析Table 4 Analysis of triterpene content in fermentation products by orthogonal test

表5 正交試驗(yàn)發(fā)酵物多糖含量分析Table 5 Analysis of polysaccharides in fermentation products by orthogonal experiment

由表3 可知，影響發(fā)酵物中黃酮含量的主次因素依次為發(fā)酵時(shí)間＞接種量＞雜糧種類，得到的最佳發(fā)酵條件為A2B1C1，即5 g 酸棗葉，添加2 g 小麥米，接種靈芝液體菌液5 mL，28 ℃發(fā)酵3 d。該組合不在正交試驗(yàn)中，故進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)（圖5）。

由表4 可知影響酸棗葉發(fā)酵物中三萜含量的主次因素依次為雜糧種類＞接種量＞發(fā)酵時(shí)間，最佳發(fā)酵條件為A1B3C3，即5 g 酸棗葉，添加2 g 薏仁，接種靈芝液體菌液15 mL，28 ℃發(fā)酵9 d。該組合不在正交試驗(yàn)中，故進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)（圖6）。

由表5 可知，影響發(fā)酵物中多糖含量的主次因素依次為雜糧種類＞接種量＞發(fā)酵時(shí)間，最佳發(fā)酵條件為A1B3C2，即5 酸棗葉，2 g 薏仁，靈芝液體菌種接種量10 mL，28 ℃發(fā)酵9 d。并進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)（圖7）。

2.6 驗(yàn)證試驗(yàn)

為了增強(qiáng)正交試驗(yàn)的真實(shí)性，對(duì)正交試驗(yàn)的結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證。首先在最佳條件下進(jìn)行發(fā)酵，第1 組為發(fā)酵黃酮的最佳條件A2B1C1；第2 組為發(fā)酵三萜的最佳條件A1B3C3；第3 組為發(fā)酵多糖的最佳條件A1B3C2。分別測(cè)定發(fā)酵物中黃酮、三萜、多糖的含量。驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果圖分別見圖5、圖6 和圖7。

圖5 黃酮最佳發(fā)酵條件驗(yàn)證結(jié)果圖Fig.5 Verification results of the optimal fermentation conditions of flavonoids

圖6 三萜最佳發(fā)酵條件驗(yàn)證結(jié)果圖Fig.6 Verification results of optimal fermentation conditions of triterpenes

圖7 多糖最佳發(fā)酵條件驗(yàn)證結(jié)果圖Fig.7 Verification results of optimal fermentation conditions of polysaccharides

驗(yàn)證試驗(yàn)的結(jié)果符合正交試驗(yàn)的結(jié)果。第1 組為酸棗葉發(fā)酵茶黃酮含量最高，最佳發(fā)酵條件為添加雜糧小麥米，接種量靈芝液體菌液5 mL，發(fā)酵時(shí)間3 d。第2 組為酸棗葉發(fā)酵茶三萜含量最高，最佳發(fā)酵條件為添加雜糧薏仁，接種靈芝液體菌液15 mL，發(fā)酵時(shí)間9 d。第3 組為發(fā)酵茶多糖含量最高，最佳發(fā)酵條件為添加雜糧薏仁，接種靈芝液體菌種10 mL，發(fā)酵時(shí)間9 d。

3 結(jié)論

發(fā)酵能夠有效地改善茶的組分，改變茶口感，從而提高茶的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。本試驗(yàn)以酸棗葉和雜糧為原料，采用食用真菌發(fā)酵，研究酸棗葉發(fā)酵茶及制備工藝。

發(fā)酵菌種篩選試驗(yàn)得出，靈芝為酸棗葉固體發(fā)酵最佳菌種；以黃酮、三萜和多糖等生物活性物質(zhì)的含量為考察指標(biāo)，通過單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)，確定酸棗葉發(fā)酵茶的制備工藝。其中酸棗葉發(fā)酵茶黃酮含量最高的制備條件為5 g 酸棗葉添加2 g 小麥米、接種量為5 mL、28 ℃發(fā)酵3 d；三萜含量最高的制備條件為5 g酸棗葉添加2 g 薏仁、接種量為15 mL、28 ℃發(fā)酵9 d；多糖含量最高的制備條件為5 g 酸棗葉添加2 g 薏仁、接種量為10 mL、28 ℃發(fā)酵9 d。制備的酸棗葉發(fā)酵茶具有酸棗葉天然的清香味、呈淡黃色、口感適宜。

靈芝酸棗葉發(fā)酵茶，以靈芝發(fā)酵酸棗葉，靈芝生長(zhǎng)過程中分泌多種酶，分解酸棗葉和雜糧的纖維素，促進(jìn)有效成分釋放，同時(shí)還產(chǎn)生多種次生代謝產(chǎn)物，如氨基酸、靈芝多糖、三萜等，提高了酸棗葉發(fā)酵茶的營養(yǎng)成分和生物活性成分含量，易于人體吸收，具有保健作用，而且食用方便，是一種新型功能茶，具有實(shí)用價(jià)值。