劉成軍 涂艷琴 王藹明 商 微 王偉周 李 敏 沈玉良

1 肇慶西江醫(yī)院生殖中心(肇慶526000) 2 海軍總醫(yī)院生殖中心(北京100048)

目前，不孕不育已經(jīng)是世界各國都面臨的一個挑戰(zhàn)，試管嬰兒技術的誕生為不孕不育患者帶來的福音。當然，人類輔助生殖技術仍然是一個新的學科，還有很多問題未解決。在進行輔助生殖治療的過程中，經(jīng)常會有未成熟的卵母細胞，特別是行卵胞漿內(nèi)單精子注射(intracytoplasmic sperm injection, ICSI)的患者。將這些卵母細胞直接丟棄很可惜，還有沒有利用價值？ 本文就ICSI后剩余未成熟卵母細胞的應用做了嘗試。

1 材料與方法

1.1 實驗對象

2008年—2012年生殖中心進行ICSI的患者，ICSI的原因為男方因素，女方年齡在22～35歲之間，女方卵巢功能正常。收集ICSI后未成熟卵母細胞GV期和MI期，隨機分兩組，一組先冷凍，解凍后再進行體外成熟培養(yǎng)，一組直接進行體外成熟培養(yǎng)。

1.2 實驗試劑及設備

1.2.1 試劑 卵母細胞采用玻璃化冷凍方法冷凍保存，冷凍液分1～3液，1液為M-HTF(sage，USA)添加質(zhì)量濃度為200 g/L的SPS，2液以1液為基礎液添加質(zhì)量濃度為80 g/L的DMSO和質(zhì)量濃度為80 g/L的EG(V/V), 3液以1液為基礎添加質(zhì)量濃度為160 g/L的DMSO和質(zhì)量濃度為160 g/L的EG(V/V)以及0.5 mol/L蔗糖。解凍液以冷凍液1為基礎液添加蔗糖，濃度分別為1.0 mol/L、0.5 mol/L、0.25 mol/L、0.125 mol/L。體外成熟培養(yǎng)液以TCM199為基礎液，添加質(zhì)量濃度為100 g/L的SPS、0.075 IU/ML 重組FSH(雪蘭諾，SWISS)+0.075 IU/ML 重組LH(雪蘭諾，SWISS)、10 ng/mL EGF、0.6 mmol半胱氨酸、0.22 mmol丙酮酸鈉，受精液、卵裂液、囊胚培養(yǎng)液為COOK公司生產(chǎn),其余未注明廠家的用品均為美國Sigma公司生產(chǎn)。

1.2.2 設備 培養(yǎng)箱為美國產(chǎn)COOK桌面培養(yǎng)箱，倒置顯微鏡及體式顯微鏡為日本NIKON公司生產(chǎn)。

1.3 實驗方法

1.3.1 卵母細胞冷凍方法，將冷凍液恢復到室溫后，將未成熟卵母細胞放入冷凍液1中洗滌3次，然后轉(zhuǎn)入冷凍液2中并計時，卵母細胞體積恢復后(6～12min)轉(zhuǎn)入冷凍液3中，40～60s裝入冷凍載體并投入液氮。卵母細胞解凍過程，首先將解凍液加熱到37 ℃，然后將卵母細胞從液氮取出，快速投入1.0 mol/L蔗糖的解凍液，1分鐘后先后轉(zhuǎn)入0.5 mol/L、0.25 mol/L、0.125 mol/L蔗糖的解凍液中，時間分別為3、5、5min，最后轉(zhuǎn)入體外成熟培養(yǎng)液。

體外成熟培養(yǎng)在37 ℃、體積分數(shù)為6%的CO2、體積分數(shù)為5%的O2的COOK桌面培養(yǎng)箱進行培養(yǎng)24～36 h，觀察到卵母細胞排出第一極體為成熟。為了避免不同精子對胚胎發(fā)育的影響，本實驗采用孤雌激活的方法進行激活卵母細胞。具體過程如下： 成熟后的卵母細胞轉(zhuǎn)入含有10 μmol離子霉素(sigma，USA)的受精液中6min，再轉(zhuǎn)入含2 mmol 6-DMAP(sigma，USA)的受精液中4 h，然后放入卵裂液中培養(yǎng)。

16～18 h后倒置顯微鏡下觀察受精情況，有原核出現(xiàn)即為受精，并計算受精率。將受精后的胚胎轉(zhuǎn)入新鮮的卵裂液中繼續(xù)培養(yǎng)，第二天觀察卵裂情況，記錄卵裂胚胎數(shù)并計算卵裂率。第三天觀察胚胎發(fā)育情況，7～9細胞，卵裂球大小基本均勻且碎片≤10%的胚胎為優(yōu)質(zhì)胚胎，計算優(yōu)胚率。在第三天上午，觀察胚胎完畢后將胚胎轉(zhuǎn)入囊胚培養(yǎng)液中培養(yǎng)，分別在第5、6天觀察囊胚形成情況，并計算囊胚率。

將數(shù)據(jù)錄入SPSS 18.0軟件，采用卡方檢驗分別比較GV、MI卵母細胞冷凍與新鮮組的成熟率、受精率、優(yōu)胚率、囊胚率有無差異，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

GV卵母細胞冷凍后的成熟率、受精率、卵裂率較新鮮組雖然有所下降，但無明顯差別(P>0.05)，見表1。MI卵母細胞冷凍后的成熟率、受精率、卵裂率、優(yōu)質(zhì)胚胎率較新鮮組沒有明顯變化，見表2。新鮮GV期與MI期卵母細胞成熟率分別為73.91%、94.59%，有差異 (P=0.016)；新鮮GV期與MI期卵母細胞成熟卵母細胞的受精率分別為67.65%、85.71%，但無統(tǒng)計學意義(P=0.075)，見表3。為不同階段冷凍卵母細胞的差別，從中可以看到GV、MI期卵母細胞解凍存活率、胚胎卵裂率及優(yōu)質(zhì)胚胎率均無差別，但卵母細胞成熟率有差異(P=0.020)，而且受精率有差異(P=0.014)，見表4。

表1 GV卵母細胞冷凍組與新鮮組的比較 例(%)

表2 MI 卵母細胞冷凍組與新鮮組的比較 例(%)

表3 新鮮GV與MI卵母細胞比較

注： 同列有字母標示的表示有差異(P<0.05), 成熟率有差異(P=0.016)

表4 冷凍GV與MI卵母細胞的比較

注： 同列有字母標示的表示有差異，成熟率有差異(P=0.020)，受精率有差異(P=0.014)

3 討 論

卵母細胞冷凍根據(jù)其的成熟度可以分為成熟卵母細胞和未成熟卵母細胞冷凍。目前卵母細胞冷凍是女性生育力保存的有效方法之一，同時也是比較常用的方法。由于卵母細胞是人類體積最大的細胞，冷凍時容易產(chǎn)生冰晶造成其損失，目前卵母細胞冷凍技術與胚胎冷凍技術相比還欠完善，但相對與卵巢冷凍技術比較簡單，冷凍效果也比卵巢冷凍好很多，比較適用于年輕單身女性。自1986年澳洲D(zhuǎn)r.Chen首次報告卵母細胞冷凍合并體外受精成功懷孕的例子后[1]，約有十年的時間卵母細胞冷凍并沒有明顯之進展。這幾年來在國內(nèi)外學者的努力研究下，在技術上以及原理上已有長足的進步，MII期卵母細胞冷凍成功率大為提高，也在臨床中得到了廣泛應用。而玻璃化冷凍是冷凍新方法，在冷凍過程中由于細胞中的水份而容易形成冰晶，從而造成細胞膜及細胞內(nèi)細胞器的損失，而玻璃化冷凍可以有效的降低這種損傷。玻璃化冷凍技術的基本原理是利用較高濃度的冷凍保護劑溶液，如乙二醇(EG)、二甲基亞砜(DMSO)等置換掉細胞內(nèi)大部分的水份，同時利用高濃度蔗糖等大分子物質(zhì)形成高滲溶液，使細胞進一步脫水，然后液氮等低溫物質(zhì)是細胞急速降溫快速越過冰晶點溫度，形成玻璃狀的形態(tài)。目前卵母細胞的玻璃化冷凍技術優(yōu)勢明顯，玻璃化冷凍的卵母細胞復蘇率大大提高了，解凍后的受精率幾乎和新鮮卵母細胞一樣[2]。Cao等人對成熟卵母細胞慢速冷凍和玻璃化冷凍做了比較研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)玻璃化冷凍卵母細胞的復蘇率、胚胎卵裂率和囊胚率均比慢速冷凍卵母細胞高[3]。

從原理上講卵母細胞的冷凍損傷的程度和發(fā)育階段有關系，GV期的卵母細胞冷凍后比MⅡ期卵母細胞存活率高[4]，而且紡錘體異常率比MⅡ期卵母細胞低[5]。Michael等首次報道了采用慢速冷凍快速解凍方法，為一名28歲女性患者進行未成熟卵母細胞(GV期)冷凍解凍并ICSI受精，移植胚胎后順利產(chǎn)下一名足月女嬰[6]。Chian等人收集未成熟卵母細胞體外成熟并玻璃化冷凍，解凍后ICSI受精，患者產(chǎn)下一健康嬰兒[7]。不過以上成功報道均是帶有顆粒細胞未成熟卵母細胞的研究，未成熟裸卵的冷凍研究較少。本研究中，未成熟卵母細胞均為去除顆粒細胞的卵母細胞，冷凍解凍存活率大于88%，且冷凍組與新鮮組的體外成熟率、受精率、卵裂率、優(yōu)質(zhì)胚胎率及囊胚率均沒有明顯差異，說明未成熟卵母細胞的玻璃化冷凍未對卵母細胞的早期發(fā)育潛力產(chǎn)生明顯影響。但不管是冷凍組還是新鮮組均無囊胚形成，說明本研究的體外成熟培養(yǎng)系統(tǒng)不夠完善。當然，沒有卵丘顆粒細胞也是卵母細胞成熟障礙一個重要因素。

卵母細胞的成熟是受精前的必要準備過程，可以簡單的分為胞核成熟和胞質(zhì)成熟。胞核的成熟機理研究比較早，一般由是否排除第一極體作為判斷卵母細胞核成熟的標準，主要由細胞質(zhì)蛋白、有絲分裂原激活蛋白激素(mitogen-activated protein kinase,MAPK)、成熟促進因子和細胞靜止因子(cytological factor,CSF)等物質(zhì)調(diào)節(jié)卵母細胞的核成熟。卵母細胞恢復減數(shù)分裂排出第一極體，過去一直被作為卵母細胞完全成熟的標志。但隨著體外成熟培養(yǎng)及受精技術的開展，研究發(fā)現(xiàn)伴隨減數(shù)分裂過程除細胞核發(fā)生相應的變化外,細胞質(zhì)也發(fā)生某些相應的變化即胞質(zhì)成熟，才能使卵母細胞完全具備受精及胚胎生長發(fā)育的能力[8-10]。近年來，有關胞質(zhì)成熟的研究越來越多，胞質(zhì)成熟作為卵母細胞成熟的一部分對卵母細胞的受精及胚胎發(fā)育都極其重要[11]。 卵丘顆粒細胞通過縫隙鏈接對卵母細胞的成熟擔負運輸營養(yǎng)物質(zhì)、傳遞信號等作用。在動物試驗中發(fā)現(xiàn)，GVBD的發(fā)生需要蛋白質(zhì)的合成[12-14]，而且從GV到MII期的轉(zhuǎn)變以及排卵前MII期的停滯都需要蛋白質(zhì)的合成[15-17]。在人類卵母細胞的成熟中，GVBD也需要蛋白質(zhì)的合成[18-19]。Goud等人研究發(fā)現(xiàn)，GV期卵母細胞去除卵丘顆粒細胞在30小時的成熟率及受精后卵裂率明顯降低，說明顆粒細胞能促進GV期卵母細胞胞核和胞質(zhì)的成熟。同時發(fā)現(xiàn)添加EGF能顯著提高去除顆粒細胞GV卵母細胞成熟率，但對受精率沒有明顯影響。這說明去除顆粒細胞的低成熟率可能和EGF的缺失有一定關系[20]。2008年Johnson等人對顆粒細胞對卵母細胞成熟的作用做了進一步對比研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)卵丘顆粒細胞對M I期卵母細胞成熟沒有顯著影響，但GV期卵母細胞去除顆粒細胞組和對照組相比成熟率顯著下降(P<0.05)。試驗共收集ICSI周期中239枚未成熟卵母細胞，成熟培養(yǎng)液為HTF添加10%代血清，過夜培養(yǎng)后100枚達到M II期，87枚經(jīng)ICSI受精，結(jié)果正常受精54枚卵母細胞，最終得到7枚可利用囊胚。7枚囊胚均自M1期培養(yǎng)成熟，其中6枚囊胚來自有顆粒細胞組，只有1枚囊胚來自裸卵組。這說明卵丘顆粒細胞對GVBD有一定的作用，對MI期卵母細胞核成熟沒有顯著影響，但對胞質(zhì)成熟促進作用[21]。2010年Reichman等人收集ICSI周期中未成熟卵母細胞并進行成熟培養(yǎng)，并與同周期體內(nèi)成熟的卵母細胞做比較研究。試驗共收集41個ICSI周期中去除顆粒細胞后未成熟卵母細胞263枚，成熟卵母細胞為234枚。成熟卵母細胞進行常規(guī)ICSI受精，263枚未成熟卵母細胞(GV期185枚，M I期78枚)在IVM-SAGE液中添加75 mIU/mL FSH 和75 mIU/mL LH培養(yǎng)24小時，以排出第一極體為成熟標志，結(jié)果GV期成熟63枚(35.1%)，M I期成熟61枚(78.2%)。所有體外培養(yǎng)成熟的卵母細胞進行ICSI受精，結(jié)果發(fā)現(xiàn)受精率和體內(nèi)成熟的卵母細胞沒有顯著差異，但胚胎發(fā)育能力明顯降低，第二天胚胎質(zhì)量明顯降低，表現(xiàn)為4細胞胚胎比例降低，胚胎碎片增多，胞質(zhì)不均勻胚胎增加。體外成熟卵母細胞共獲得可移植胚胎54枚，冷凍30枚，移植24枚但均沒有著床[22]。本研究中，GV卵母細胞的成熟率較MI期低，可能和顆粒細胞確實對GVBD造成了一定影響，與這些研究結(jié)果一致。同時也證明未成熟卵母細胞特別是MI期卵母細胞除去顆粒細胞后對其核成熟影響不大，但對胞質(zhì)成熟影響較大。成熟卵母細胞受精后的發(fā)育潛力地下，表現(xiàn)為優(yōu)質(zhì)胚胎率低且無囊胚形成。2014年Nikiforaki等人研究表明，未成熟卵母細胞冷凍及體外成熟培養(yǎng)都影響卵母細胞受精過程中鈣振蕩[23]。鑒于此，對于ICSI后未成熟裸卵，利用價值有限，特別是GV期卵母細胞，未成熟卵母細胞特別是未成熟裸卵的體外成熟培養(yǎng)體系需要進一步優(yōu)化。

綜上所述，卵母細胞的冷凍技術和體外培養(yǎng)技術都取得了很大進展，但未成熟卵母細胞冷凍研究較少，仍有很多問題沒有解決，卵母細胞體外成熟培養(yǎng)和體內(nèi)成熟過程時間差異較大，也可能對卵母細胞存在潛在風險，仍需要進一步探討。