(川省閬中市人民醫(yī)院血液內(nèi)科，四川 閬中 637400)

免疫性血小板減少癥(primary immune thrombocytopenia，ITP)是一種自身免疫性疾病，其病理基礎(chǔ)為以抗血小板自身抗體介導的自身免疫反應為靶點，加快血小板損傷或?qū)ρ“迳稍斐勺璧K，使患者出血風險升高[1]。ITP的病理生理較為復雜，涉及因素較多。此前大量研究報道，ITP發(fā)病是由于FC受體介導的巨噬細胞遭到破壞[2-3]。近來，較多研究指出，T細胞也參與了ITP的發(fā)病，在T細胞中，T輔助細胞(T helper，Th)在免疫調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用，特別在適應性免疫系統(tǒng)中，可能通過分泌T細胞相關(guān)的細胞因子參與此過程[4]。免疫調(diào)節(jié)過程中，Th17/Th9也被證明參與了ITP[5]，但關(guān)于其在ITP過程中發(fā)揮的作用國內(nèi)未見報道。因此本研究通過檢測ITP患者血漿Th17/Th9的含量，探討其影響ITP的機制，以期為臨床研究提供新的治療ITP的靶點。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2016年3月至2018年3月本院血液科收治的105例原發(fā)免疫性血小板減少癥(Primary immunogenic thrombocytopenia，ITP)患者為研究對象，ITP診斷符合《成人原發(fā)免疫性血小板減少癥診斷與治療中國專家共識(2016年版)》[6]中標準。根據(jù)血小板計數(shù)分為活動性ITP組(n=62)和緩解期ITP組(n=43)，血小板計數(shù)低于30×109/L患者為活動性ITP?；顒有訧TP組62例，男性29例，女性33例，年齡20～76歲，平均年齡46.83(34.81，54.77)歲，血小板計數(shù)為(17.23±3.15)×109/L；緩解期ITP組43例，男性20例，女性23例，年齡19～80歲，平均年齡45.16(37.32，58.05)歲，血小板計數(shù)為(132.84±33.76)×109/L；選取同期健康查體者30例作為對照組，男性15例，女性15例，年齡23～72歲，平均年齡44.16(32.11，51.93)歲，血小板計數(shù)為(238.64±44.83)×109/L。三組患者年齡(Mann-Whitney U=1.163，P=0.316)、性別(χ2=0.105，P=0.949)比較差異無統(tǒng)計學意義，具有可比性。本研究獲得本院醫(yī)學倫理委員會批準同意。此次研究中所有參與者均知情同意，并簽署知情同意書。

1.2 Th9/Th17檢測

采集患者外周靜脈血4 mL，3 500 r/min離心5 min，分離得血漿，將血漿置于-80 ℃冰箱待測。采用梯度離心法在FIXOLPAQUE PLUS淋巴細胞分離液(美國GE公司)中分離外周血單核細胞(peripheral blood mononuclear cells，PBMC)；將PBMC在RPMI-1640培養(yǎng)基中重新懸浮，后接種到24孔板中，每孔1×109/mL，細胞培養(yǎng)用PMA(終濃度50 ng/mL)(英國，Abcam公司)，離子霉素(750 ng/mL)(上海源葉生物科技有限公司)和BFA(10 μg/mL)(美國Invitrogen公司)，然后將24孔板細胞轉(zhuǎn)移至含5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h。結(jié)束后，將細胞轉(zhuǎn)移至無菌離心管中，離心5 min。細胞懸浮液轉(zhuǎn)至試管中，分別加入抗人IL-9及抗人IL-17抗體(均購自美國Pepro Tech公司)，染色30 min，進行分析。以同型抗體作為對照，CD4+IL-9+為Th9細胞，CD4+IL-17+細胞為Th17細胞。

1.3 實時定量熒光PCR法(RT-PCR)測定轉(zhuǎn)錄因子PU.1、IRF4、BATF及RORγt水平

加入Trizol溶液提取總RNA。應用核酸蛋白儀和瓊脂糖電泳對提取的RNA進行分析。取總RNA 4 μL，82 ℃水浴5 min加入反轉(zhuǎn)錄反應液，44 ℃孵育60 min終止，留取產(chǎn)物待用。擴增參數(shù)，95 ℃ 10 min，60 ℃ 15 s,72 ℃延伸15 s，72 ℃最終延伸10 min，10 ℃最終保存?；虮磉_分析采用2-△Ct法測定相對含量，將GADPH設為內(nèi)參，取Ct值。計算公式為△Ct= Ct(目的基因)- Ct(GADPH)。引物序列見表1。

表1 引物序列

1.4 統(tǒng)計學分析

采用SPSS19.0統(tǒng)計學軟件進行統(tǒng)計學分析，血清Th9/IL -9、Th17/IL-17采用均數(shù)±標準差表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間比較采用Newman-Keuls檢驗，患者治療前后血清Th9/IL -9、Th17/IL-17水平采用配對t檢驗，患者年齡資料以【M(Q1，Q3)】表示，組間比較采用Mann-Whitney U秩和檢驗；例數(shù)資料用n(%)表示，采用卡方檢驗；采用Pearson卡方進行相關(guān)性分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 流式細胞儀檢測Th9/Th17在三組中的表達

活動性ITP組、緩解期ITP組及對照組Th9分別為(0.72±0.17)、(0.27±0.09)、(0.32±0.06)，三組Th9表達比較差異有統(tǒng)計學意義(F=180.442，P=0.000)，活動期ITP組Th9表達明顯高于緩解期ITP組及對照組(q=24.797、19.669，均P<0.05)，緩解期ITP組與對照組Th9比較差異無統(tǒng)計學意義(q=2.298，P>0.05)。活動性ITP組、緩解期ITP組及對照組Th17分別為(1.21±0.13)、(0.73±0.11)、(0.86±0.09)，三組Th17表達比較差異有統(tǒng)計學意義(F=210.054，P=0.000)，活動性ITP組Th17明顯高于緩解期ITP組及對照組(q=26.338、20.891，均P<0.05)，緩解期ITP組與對照組比較差異無統(tǒng)計學意義(q=2.441，P>0.05)。Th9/Th17在活動性ITP患者中異常表達，在緩解期患者中Th9/Th17細胞恢復至正常水平。

圖1 三組Th9/Th17表達水平比較與活動期ZTP組比較；*P<0.05

2.2 Th9轉(zhuǎn)錄因子在三組的表達

活動性ITP組、緩解期ITP組及對照組PU.1分別為(1.83±0.24)、(1.06±0.12)、(0.98±0.10)，PU.1在三組中表達差異有統(tǒng)計學意義(F=325.241，P=0.000)，活動性ITP組PU.1表達明顯高于緩解期ITP組及對照組(q=30.025、29.576，均P<0.05)，緩解期PU.1表達與對照組比較差異無統(tǒng)計學意義(q=2.603，P<0.05)。活動性ITP組、緩解期ITP組及對照組IRF4分別為(2.06±0.23)、(1.21±0.24)、(0.88±0.15)，IRF4在三組中表達差異有統(tǒng)計學意義(F=288.402，P=0.000)，活動性ITP組患者IRF4表達明顯高于緩解期ITP及對照組患者(q=28.294、27.830，均P<0.05)，緩解期ITP組與對照組比較差異無統(tǒng)計學意義(q=2.414，P>0.05)?；顒有訧TP組、緩解期ITP組及對照組BATF分別為(1.81±0.21)、(1.10±0.15)、(0.79±0.11)，三組患者BATF表達比較差異有統(tǒng)計學意義(F=342.103，P=0.000)，活動性ITP組患者BATF表達明顯高于緩解期(q=30.756、30.372，均P<0.05)，緩解期ITP患者BATF表達與對照組比較差異無統(tǒng)計學意義(q=2.737，P>0.05)。結(jié)果提示，轉(zhuǎn)錄因子表達升高可能為造成Th9表達升高的原因。見圖2。

圖2 PU.1、IRF4及BATF在三組受試者中表達比較與活動期ZTP組比較；*P<0.05

2.3 Th17轉(zhuǎn)錄因子RORγt在三組中的表達

活動性ITP組、緩解期ITP組及對照組RORγt表達分別為(1.85±0.24)、(0.46±0.11)、(0.98±0.13)；三組間比較差異有統(tǒng)計學意義(F=476.871，P=0.000)，活動性ITP組患者RORγt表達明顯高于緩解期ITP組及對照組(q=39.302、32.093，均P<0.05)，緩解期ITP患者RORγt表達與對照組比較差異無統(tǒng)計學意義(q=2.784，P>0.05)。提示，RORγt表達可能為引起ITP患者Th17表達升高的原因。

2.4 IL-9/IL-17在三組中的表達水平

活動性ITP組、緩解期ITP組及對照組IL-9表達分別為(18.38±1.20)、(14.62±0.95)、(9.64±0.52)ng/L，三組患者血清IL-9水平比較差異有統(tǒng)計學意義(F=775.000，P=0.000)，活動期ITP患者血清IL-9水平明顯高于緩解期ITP患者及對照組患者(q=26.635、55.245，均P<0.05)，緩解期ITP患者血清IL-9水平明顯高于對照組患者(q=29.430，P>0.05)。活動性ITP組、緩解期ITP組及對照組IL-17表達分別為(5.26±0.27)、(4.13±0.30)、(2.26±0.18)ng/L，三組受試者血清IL-17水平比較差異有統(tǒng)計學意義(F=1162.452，P=0.000)，活動性ITP組患者血清IL-17水平明顯高于緩解期ITP患者及對照組患者(q=33.261、67.565，均P<0.05)，緩解期ITP組患者血清IL-17水平明顯高于對照組患者(q=35.419，P<0.05)。見圖3。

圖3 IL-9/IL-17在三組中的表達水平比較與活動期ZTP組比較；*P<0.05；與對照組比較；#P<0.05

2.5 Th9/Th17及IL-9/IL-17診斷活動性ITP的效能

Th9診斷活動性ITP的最大約等指數(shù)為0.694，對應最佳截斷點為0.65；Th17診斷活動性ITP的最大約等指數(shù)為0.708，對應的最佳截斷點為1.17；IL-9診斷活動性ITP的最大約登指數(shù)為0.443，對應的最佳截斷點為15.86 ng/L；IL-17診斷活動性ITP的最大約等指數(shù)為0.419，對應的最佳截斷點為4.60 ng/L。AUCTh17>AUCIL-17，AUCTh17>AUCIL-9，AUCTh17>AUCTh9，(Z分別為4.886、4.718、1.696，P=0.000、0.000、0.090)。見圖4、表2。

圖4 Th9/Th17及IL-9/IL-17診斷活動性ITP的ROC曲線

表2 Th9/Th17及IL-9/IL-17診斷活動性ITP的統(tǒng)計學結(jié)果

2.6 Th9與Th17及IL-9與IL-17的相關(guān)性分析

活動性ITP組Th9與 Th17呈正相關(guān)(r=0.568,P=0.000)，IL-9與IL-17呈正相關(guān)(r=0.885,P=0.000)；緩解期ITP患者Th9與 Th17呈正相關(guān)(r=0.776，P=0.000)，IL-9與IL-17呈正相關(guān)(r=0.811，P=0.000)。見圖5。

圖5 Th9與Th17及IL-9與IL-17的相關(guān)性分析

3 討 論

ITP為自身免疫性疾病，特征為對血小板的破壞及阻礙其生成，造成出血。ITP為器官特異性疾病，T細胞及B細胞介導的免疫耐受及攻擊間的失衡在ITP的發(fā)生發(fā)展過程中具有重要作用[7]。研究報道，除Th1/Th2外，Th17/Th9為新的Th亞型，其特征在于能夠分泌IL-17及IL-9，鑒于IL-17/IL-9的多效性，Th17/Th9細胞已被證明參與機體的炎性反應及自身免疫性疾病[8-9]。然而，對于Th17/Th9是否參與ITP的發(fā)病及其機制的報道鮮有報道。本研究通過測量ITP患者Th17/IL-17、Th9/IL-9的含量，明確其與ITP的關(guān)系。

研究表明Th細胞為調(diào)節(jié)免疫應答的關(guān)鍵，其特征在于其特異的轉(zhuǎn)錄因子表達[10]。Th17/Th9細胞為新發(fā)現(xiàn)的Th細胞效應物，越來越多證據(jù)表明Th17及Th9與許多自身免疫性疾病相關(guān)，如動物實驗表明Th9細胞可在轉(zhuǎn)移性結(jié)腸炎模型中誘發(fā)炎癥[11-12]。本研究中，活動性ITP組患者Th17及Th9細胞的表達明顯升高，并在緩解期恢復至正常水平，提示其可能與ITP的發(fā)生相關(guān)。近年來，通過對Th17及Th9基因表達的分析，發(fā)現(xiàn)BATF為Th9細胞富集的基因[13]。其作用與Th9細胞分化為轉(zhuǎn)錄因子的作用相同，本研究中觀察到活動性ITP患者PU.1、IRF4及BATF的表達明顯升高，可能與Th9細胞分化增強相關(guān)，提示三者可能共同參與誘導Th9細胞的轉(zhuǎn)錄，介導ITP的發(fā)生；RORγt為Th17細胞發(fā)育所需的主轉(zhuǎn)錄因子，本研究中結(jié)果顯示，Th17細胞在活動性ITP患者中數(shù)量明顯增多，在緩解期恢復至正常水平，RORγt與其變化趨勢相同，結(jié)果與先前的研究相符。最近研究[14]發(fā)現(xiàn)Th9細胞可合成分泌IL-9，其能通過結(jié)合其特異性受體，增加IL-4介導的IgE及IgG的產(chǎn)生，其作用途徑與ITP在免疫調(diào)節(jié)中途徑相同[15]。Th-9能夠誘導CD4+T細胞向Th17細胞的分化，而且Th-9對Th17分泌的細胞因子IL-17具有促進發(fā)育的作用[16]。IL-17能夠作用于相應的靶細胞，參與體內(nèi)的炎癥反應，也能引發(fā)自身免疫性疾病，進而導致ITP患者機體免疫功能紊亂并影響疾病的發(fā)生發(fā)展。本研究中活動性ITP患者Th17/IL-17含量均明顯升高，與此前研究相一致，提示Th17/IL-17主要通過引起炎癥反應參與ITP的發(fā)展。本研究中觀察到ITP患者Th9細胞與Th17細胞及IL-17與IL-9均呈現(xiàn)正相關(guān)，提示Th9/IL-9及Th17/IL-17可能協(xié)同參與ITP的發(fā)病。本研究中同時利用Th17/IL-17及Th9/IL-9對ITP進行診斷，結(jié)果發(fā)現(xiàn)四者均對ITP具有一定診斷價值，當患者Th9高于0.65、Th17高于1.17、IL-9高于15.86 ng/L、IL-17高于4.60 ng/L應警惕患者發(fā)生ITP的可能。有研究指出Th17/IL-17及Th9/IL-9對ITP的預后存在關(guān)聯(lián)[17]，本研究下一步將延長觀察時間對ITP患者預后進行分析，并將加大樣本量對本研究結(jié)果進行進一步確認。

綜上所述，本次研究表明，Th17/IL-17及Th9/IL-9在活動性ITP患者中過表達增加，其影響ITP發(fā)病的機制可能與增加轉(zhuǎn)錄因子表達相關(guān)，還發(fā)現(xiàn)Th17/IL-17及Th9/IL-9呈正相關(guān)，提示Th17/IL-17可能與Th9/IL-9協(xié)同參與ITP的發(fā)病，并發(fā)現(xiàn)四者對ITP均具有一定診斷價值，為臨床預防治療ITP提供了新的靶點。