夏 紅，楊 強(qiáng)

(重慶市大足區(qū)人民醫(yī)院感染科，重慶 402360)

我國是乙型肝炎高發(fā)國，HBV反復(fù)、持續(xù)感染是一系列肝臟疾病的危險因素，包括肝炎性、肝硬化、肝癌等[1]。目前，抗病毒治療是防止乙肝發(fā)展為肝硬化、肝癌的主要療法；核苷酸類藥物如拉米夫定可以通過抑制HBV DNA復(fù)制，從而有效治療HBV感染，而且是主要的抗病毒藥物[2]。研究顯示，治療可以顯著改善HBV感染患者的臨床、生化和病毒學(xué)等指標(biāo)，且使肝組織炎性壞死等病理損害明顯好轉(zhuǎn)[3]。但研究顯示，拉米夫定絡(luò)氨酸-蛋氨酸-天門冬氨酸-天門冬氨酸(tyrosine methionine aspartate aspartate, YMDD)變異率隨著抗病毒治療時間延長而逐漸增高[4]，并認(rèn)為這些變異可能是治療失敗或產(chǎn)生耐藥性的原因[5]。本文研究HBV聚合酶YMDD變異與乙型肝炎臨床病情變化及HBsAg的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2014至2016年間在本院就診的慢性乙型肝炎患者290例，均符合2000年修訂的《病毒性肝炎防治方案》慢性乙型肝炎診斷標(biāo)準(zhǔn)[6]。其中男196例，女94例，年齡17～76歲，平均年齡(47.5±13.7)歲。無癥狀攜帶者(asymptomatic carriers, ASC)56例，急性肝炎(acute hepatitis, AH)55例，慢性乙型肝炎(chronic hepatitis B, CHB)68例，肝硬化(cirrhosis of liver, LC)53例，重型肝炎(severe hepatitis, SH)31例，原發(fā)性肝癌(primary hepatocellular carcinoma, PHC)27例?；颊呓邮芾追蚨ㄖ委?2～48月，平均(31.5±6.5)個月。分別于治療前及治療中每4～6月抽取患者外周血，分離血清，-70 ℃儲存，待測。

1.2 試劑

使用ABI 7700熒光PCR擴(kuò)增儀(美國BIO～RAD公司)、乙型肝炎病毒核酸擴(kuò)增(polymerase chain reaction, PCR)熒光定量試劑盒及YMDD變異檢測試劑盒(廣州市達(dá)暉生物技術(shù)有限公司)測定纈氨酸突變型(tyrosine valine aspartate aspartate,YVDD)對照品、異亮氨酸突變型(tyrosine isoleucine aspartate aspartate,YIDD)突變類型；使用人乙肝表面抗原(HBsAg)Elisa試劑盒(上海廣銳生物科技有限公司)測定HBsAg。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 HBV變異檢測 (1)樣本處理：取50 μL待測血清標(biāo)本、陰性血清對照品、強(qiáng)陽性和臨界陽性于1.5 mL離心管中，分別加入50 μL核酸提取液，混勻，2 000 rpm離心10 s，100 ℃水浴10 min，12 000 rpm離心10 min，取上清，-20 ℃保存，待測。(2)上樣：在HBV反應(yīng)混合液A的反應(yīng)管中分別加入4 μL的陰性對照、強(qiáng)陽性對照、臨界陽性對照、待檢測樣品處理上清液、HBV定量標(biāo)準(zhǔn)品。在HBV反應(yīng)混合液B和C的反應(yīng)管中分別加入4 μL的強(qiáng)陽性對照、待檢測樣品處理上清液、YVDD對照品、YIDD對照品。蓋緊反應(yīng)管，轉(zhuǎn)移至檢測區(qū)。(3)PCR擴(kuò)增及熒光檢測：反應(yīng)管置于PCR儀上進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增條件：37 ℃ 2 min；95℃ 5 min；94 ℃ 20 s，62 ℃ 60 s，循環(huán)40次，熒光檢測。(4)結(jié)果分析：如果樣品的反應(yīng)混合液B檢測陰性，反應(yīng)混合液C檢測陽性，則可判定該樣品為YIDD突變株。如果樣品的反應(yīng)混合液B檢測陽性，反應(yīng)混合液C檢測陰性，則可判定該樣品為YVDD突變株。如果樣品的反應(yīng)混合液B檢測陰性，反應(yīng)混合液C檢測陰性，則可判定該樣品為野生型株。如果樣品的反應(yīng)混合液B檢測陽性，反應(yīng)混合液C檢測陽性，則判定該樣品為YVDD、YIDD共生株。

1.3.2 生化指標(biāo)檢測 使用全自動生化檢測儀檢測血清AST、ALT、ALP和TBIL表達(dá)水平。

1.3.3 HBsAg檢測 抽取患者靜脈血，收集血清。設(shè)置空白孔和待測樣品孔。待測樣品孔中依次加入40 μL樣品稀釋液、10 μL待測樣品，輕搖混勻，37 ℃×30 min，洗板5次；加入50 μL酶標(biāo)試劑，37 ℃×30 min，洗板5次；依次加入顯色劑A和B各50 μL，輕搖混勻，避光37 ℃×15 min，終止反應(yīng)；以空白孔調(diào)零，依序測量各孔吸光度(450 nm)；繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，代入樣品OD值計算出濃度，再乘以稀釋倍數(shù)，即實(shí)際濃度。空白對照孔不加樣品及酶標(biāo)試劑，其余各步操作相同。

肝穿刺：患者取仰臥位，穿刺點(diǎn)位于右側(cè)腋中線第8和第9肋間、肝實(shí)音處穿刺，局部皮膚消毒，肝被膜用2%利多卡因局部麻醉，三棱針刺孔，由刺孔刺入穿刺針，注射器推出0.5～1.0 cm防止針頭堵塞，注射器抽成負(fù)壓并保持，叮囑患者吸氣，深呼吸末屏住呼吸，將穿刺針刺入肝內(nèi)并抽出，生理鹽水沖出肝組織條，10%甲醛固定送檢。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié) 果

2.1 患者一般情況分布特征

病毒變異組和無變異組的性別、年齡、病程、乙肝疫苗接種史和HBV家族感染史等一般臨床資料相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見表1。

表1 患者一般情況特征分布

2.2 病毒變異與患者病情分布的關(guān)聯(lián)

病毒變異組與無變異組的病情分布差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；病毒變異組患者的肝功能指標(biāo)表達(dá)水平與無變異組差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，病毒變異組AST、ALT、ALB和TBIL水平顯著高于無變異組。見表2。

表2 兩組患者病情分布特征

2.3 病毒變異與無變異患者HBsAg陽性率及表達(dá)方式對比

變異組140例患者中，肝細(xì)胞內(nèi)HBsAg表達(dá)陽性104例，陽性率為74.29%，無變異組150例患者中，肝細(xì)胞內(nèi)HBsAg表達(dá)陽性91例，陽性率為60.67%，變異組顯著高于無變異組(χ2=4.541，P=0.033)。變異組的HBsAg表達(dá)方式主要以漿核型為主，約占陽性表達(dá)患者的47.25%，無變異組的表達(dá)方式主要以核型為主，約占陽性表達(dá)患者的46.15%，兩組表達(dá)方式差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表3。

表3 病毒變異與患者HBsAg陽性率及表達(dá)方式 (例，%)

3 討 論

HBV DNA復(fù)制起始于蛋白啟動的逆轉(zhuǎn)錄機(jī)制，HBV聚合酶蛋白在其中發(fā)揮關(guān)鍵作用[7]；但由于HBV聚合酶缺乏3′～5′校對能力，發(fā)生核苷酸替代變異后難以修正，所以HBV是一個高度變異的病毒，而這些突變以準(zhǔn)種的形式存在于體內(nèi)，病毒準(zhǔn)種的進(jìn)化依賴于抗病毒藥物、免疫應(yīng)答、復(fù)制適用性等為更強(qiáng)適用性的變異株提供復(fù)制空間[8]；與野生株相比，HBV突變株在沒有藥物壓力下復(fù)制能力較低，但抗病毒藥物治療可以改變宿主機(jī)體內(nèi)環(huán)境，使變異株的復(fù)制適用性超過野生株。一段時間后，野生株感染的肝細(xì)胞以細(xì)胞更新的方式被清除，并取代以未感染的細(xì)胞，而未被感染的細(xì)胞很容易被變異株感染[9]。研究顯示，HBV的變異與HBV P蛋白YMDD基因序列突變有關(guān)[10]。

本文研究發(fā)現(xiàn)，與未變異組相比，病毒變異組的病情分布差異有統(tǒng)計學(xué)意義。變異組患者的肝功能指標(biāo)，如AST、ALT、ALB和TBIL的表達(dá)水平顯著升高。ALT和AST主要存在于肝細(xì)胞線粒體中，是肝臟損傷的重要血清標(biāo)志物。變異組升高更加明顯，其原因可能與YMDD變異后，治療藥物對變異的HBV失去原有的治療作用有關(guān)，從而使變異株病毒滴度升高，更多的病毒顆粒作用于肝細(xì)胞，肝細(xì)胞病理狀態(tài)進(jìn)一步惡化，病情加重[11]。同時，本文研究還發(fā)現(xiàn)，病毒變異組患者HBsAg表達(dá)陽性率顯著低于無變異組。HBsAg是HBV病毒復(fù)制過程中產(chǎn)生的重要病毒蛋白，其在病毒對宿主的黏附及HBV持續(xù)感染和發(fā)病機(jī)制方面均有重要作用[12]。研究表明，HBsAg是機(jī)體特異性細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞攻擊的主要靶抗原，其在肝組織內(nèi)的表達(dá)水平，反應(yīng)HBV患者機(jī)體免疫水平和HBV復(fù)制之間的平衡，臨床上通常把HBsAg的表達(dá)作為HBV復(fù)制的重要標(biāo)志，能反映肝臟的炎癥活動度和纖維化程度，而非活動性病毒復(fù)制階段多表現(xiàn)為陰性[13]。研究表明，機(jī)體免疫應(yīng)答增強(qiáng)并啟動對HBV清除，繼而攻擊并大量破壞被HBV感染的肝細(xì)胞，肝組織發(fā)生纖維化及壞死等，正常肝細(xì)胞不斷減少，肝細(xì)胞內(nèi)HBV病毒顆粒不斷減少，導(dǎo)致HBsAg水平不斷降低[14]。研究發(fā)現(xiàn)，肝細(xì)胞內(nèi)HBsAg的表達(dá)形式有胞槳型、胞核型、漿核型3種，其表達(dá)方式與HBV感染的不同時期有關(guān)[15]。慢性HBV感染的自然史分為免疫耐受期、免疫清除期、非活動攜帶狀態(tài)機(jī)再活動期4個階段[16]。早期免疫耐受期HBsAg在肝細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)以核型為主，此時肝臟很少或沒有炎癥活動，多見于兒童和青年人；而在免疫清除階段，HBsAg在肝細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)以槳型和/或漿核型為主，多見于活動型肝炎患者[17]。本文研究顯示，變異組的HBsAg表達(dá)形式主要是漿核型，約占陽性表達(dá)患者的47.25%，而無變異組的HBsAg表達(dá)方式主要以核型為主，約占陽性表達(dá)患者的46.15%，兩組HBsAg表達(dá)方式差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

本文研究結(jié)果提示，HBV聚合酶YMDD變異的乙肝患者臨床病情更重，HBV表面抗原陽性表達(dá)比例低。

致謝：感謝我院、感染科的相關(guān)醫(yī)護(hù)人員及入院患者對本研究的支持。