黃珍婷楊文明蔡志友

阿爾茨海默病(Alzheimer′s disease，AD)是常見的老年期癡呆類型，是一種中樞神經(jīng)退行性疾病，以進行性的認知功能障礙及不同程度的行為損害為特征。隨著人均壽命不斷增加與社會老齡化，AD患病率逐漸升高[1]。AD導(dǎo)致的社會和經(jīng)濟問題已引起世界各國和社會的高度重視。AD的主要病理特征是細胞外以β-淀粉樣蛋白(β-amyloid peptide，Aβ)沉積形成的神經(jīng)炎性斑塊(鏡下可見的老年斑)，細胞內(nèi)神經(jīng)原纖維纏結(jié)(neurofibrillary tangles，NFT)及神經(jīng)元丟失[2-5]。AD致病因素復(fù)雜，其發(fā)病機制有多種假說，存在一個共同點是Aβ積聚。大量研究表明，Aβ積聚可引起機體一系列病理變化，是導(dǎo)致AD發(fā)病的重要原因。這是目前被人們普遍接受的AD重要發(fā)病機制——Aβ級聯(lián)假說[6-9]。黃連素又稱小檗堿(berberine)，是從黃連、黃柏等植物中提取的異喹啉類生物堿，具有廣泛的藥理作用。有研究顯示，黃連素具有抗炎、抗氧化應(yīng)激、抑制膽堿酯酶活性、抑制Aβ蛋白聚集和Tau蛋白過度磷酸化等作用，因此其對AD防治具有巨大的潛力[10-15]。本研究探討黃連素能否減少APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠腦內(nèi)Aβ的產(chǎn)生和積聚，改善其認知功能。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 黃連素(鹽酸小檗堿，廣東華南藥業(yè)集團，規(guī)格：每粒0.1 g，批號：150904)；生理鹽水(四川科倫藥業(yè)股份有限公司，規(guī)格：每袋100 mL，批號：18052902)；Western blot所用 Anti-beta Amyloid 1-42兔單克隆抗體(Abcam公司，批號：GR32357441，稀釋濃度1︰1 000)；免疫熒光所用β-Amyloid鼠單克隆抗體(Santa Cruz 公司，批號：10718，稀釋濃度1∶100)；Alexa Fluor?488標(biāo)記山羊抗兔IgG(H+L)(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，批號：134331)、辣根酶標(biāo)記山羊抗兔IgG(H+L)(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，批號：1326080)；DAPI染色液(碧云天，批號：p0010s)；GAPDH抗體(碧云天，批號：101917180302)；通用二步法檢測試劑盒(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，批號：K185910E)。

1.2 主要儀器 天能化學(xué)發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)(天能5200Multi)；耐可視(Nexcope)科研級生物正置顯微鏡(耐可視NE900)；水迷宮設(shè)備(江蘇賽昂斯生物科技有限公司SA201)；電子旋轉(zhuǎn)切片機(賽默飛HM 340E)；自動組織脫水機(浙江省金華市科迪儀器設(shè)備有限公司KD-TS3A)；超微量分光光度計(賽默飛ND One)；小型垂直電泳轉(zhuǎn)印系統(tǒng)(Bio-Rad#1658033)。

1.3 分組及給藥方法

1.3.1 實驗動物 4月齡APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠20只，購自北京華阜康生物科技股份有限公司，許可證號[SCXK(京)2014-0004]，代養(yǎng)于重慶醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心[SYXK(渝)2018-003]。實驗過程中動物自由攝食和飲水。

1.3.2 分組和給藥 采用SPSS 23.0統(tǒng)計分析軟件將20只小鼠隨機分為生理鹽水組和黃連素組，每組10只。給藥途徑：首先將黃連素粉末加入生理鹽水充分溶解后配成濃度為10 mg/mL的混懸液，小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后開始灌胃。使用灌胃器，將藥液由動物口直接注入到動物胃中。黃連素組予100 mg/(kg·d)黃連素，生理鹽水組給予等量生理鹽水，每日1次于09：00灌胃，共4周。

1.4 Morris水迷宮實驗檢測準(zhǔn)轉(zhuǎn)基因小鼠學(xué)習(xí)記憶能力 Morris水迷宮設(shè)備采用江蘇賽昂斯小鼠水迷宮視頻分析系統(tǒng)。整套裝置由圓形水池、小鼠站臺、控溫裝置、攝像機及錄像機、顯示器、分析系統(tǒng)等構(gòu)成，水池直徑為120 cm，小鼠站臺直徑為8 cm，高度30 cm，水池水深(32.0±0.5)cm，水溫(22±2)℃，水池分為4個象限，每個象限均有不同符號的導(dǎo)航標(biāo)識。水迷宮實驗共進行7 d，前6 d為定位航行試驗，將小鼠頭朝池壁依次放入第一、第二、第三、第四象限固定起始位置，其中第二象限為小鼠站臺所在象限即目標(biāo)象限，記錄小鼠60 s內(nèi)找到隱蔽于水面下的站臺時間，此段時間稱為逃避潛伏期(escape latency)；第7天除去站臺，選擇原站臺位置對角線象限即第四象限將小鼠頭朝池壁放入水中，記錄小鼠60 s內(nèi)經(jīng)過原站臺所在位置的次數(shù)和在目標(biāo)象限內(nèi)的活動時間觀察小鼠對原站臺的記憶能力，此為空間探索試驗(spatial probe)。

1.5 取材及標(biāo)本制備

1.5.1 新鮮組織標(biāo)本 小鼠經(jīng)心臟灌注預(yù)冷的生理鹽水后取腦。各組行為學(xué)測試完畢后從各組隨機取5只小鼠，用3.5%水合氯醛腹腔注射麻醉，待深度麻醉后將小鼠固定于解剖臺，剖開胸腔，暴露心臟，用4.5號靜脈輸液針，磨平針尖，連接預(yù)冷的生理鹽水，針頭刺入左心室，同時剪開右心耳，緩慢勻速地推注預(yù)冷的生理鹽水防止蛋白降解，時間維持在10 min左右，待小鼠肝臟、眼睛變白，血液完全排出后斷頭、取腦并剝離海馬組織。取出的海馬組織經(jīng)液氮速凍后放入-80 ℃冰箱凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.5.2 石蠟切片備制 取余下兩組剩余5只小鼠，同樣經(jīng)心臟灌注預(yù)冷的生理鹽水，待血液完全排出后，繼續(xù)緩慢灌注4%多聚甲醛固定，直至動物呈僵硬狀態(tài)。原位靜置20 min后，剝離腦組織，采用上述固定液固定48 h。使用pH7.2～7.4的0.01 mol/L磷酸鹽緩沖溶液(phosphate buffered saline，PBS)沖洗干凈后，用手術(shù)刀片將小鼠腦分成兩半，依次經(jīng)50%乙醇、70%乙醇、85%乙醇、95%乙醇兩次、無水乙醇兩次脫水，環(huán)保透明劑透明，低熔點石蠟、高熔點石蠟兩次浸蠟，石蠟包埋。包埋后的石蠟運用石蠟切片機切片、展片儀展片，之后用干凈的防脫黏附載玻片撈貼，烘干備用染色。切片前進行適當(dāng)修片，于冠狀位海馬區(qū)連續(xù)切片，厚度 5 μm。

1.6 免疫組化(immunohistochemistry，IHC)和免疫熒光(immunofluorescence，IF)分別檢測Aβ42表達及其積聚沉積 免疫組化方法：取制備好的石蠟切片，兩組10只小鼠，每只選擇2張切片、65 ℃烤片3 h，放入環(huán)保透明中脫蠟，再經(jīng)高濃度乙醇至低濃度乙醇復(fù)水便于后續(xù)染色。內(nèi)源性過氧化物酶阻斷后，將切片放入盛有檸檬酸緩沖液(pH6.0)容器中，置于微波爐內(nèi)高火5 min加熱至修復(fù)液沸騰后改用中火繼續(xù)加熱15 min進行抗原修復(fù)，增加組織通透性，取出容器放置室溫冷卻。PBS洗滌3次，每次5 min，之后用二抗來源動物的非免疫血清封閉非結(jié)合位點，37 ℃孵育30 min；后將封閉血清吸出，滴加一抗，4 ℃冰箱孵育過夜。次日從冰箱拿出復(fù)溫20 min后PBS洗3次，每次5 min，再滴加反應(yīng)增強液室溫孵育20 min。經(jīng)PBS洗3次，每次5 min后滴加二抗。PBS洗去二抗用新鮮配制的顯色液于顯微鏡下控制顯色時間。顯色完成后自來水沖洗，將切片置于蘇木素染色液孵育45 s染色組織細胞核，染色完成后將切片放入盛滿自來水的盆中，流水沖洗后用1%鹽酸乙醇分化9 s，分化完成后用流水反復(fù)沖洗后再用碳酸鋰反藍，時間為9 s。沖洗干凈后用吹風(fēng)機吹干切片，最后用中性樹膠封片。免疫熒光方法基本同前，二抗使用Alexa Fluor?488標(biāo)記山羊抗兔IgG(H+L)熒光二抗，染核使用DAPI染色液(DAPI Staining Solution，DAPI)，PBS充分洗凈DAPI后，使用抗熒光淬滅封片劑封片。每張切片取3～5個視野，每張切片所取視野盡量相同，于40倍、100倍、200倍、400倍鏡頭下分別采集圖像，使用Image J 8.0分析圖像，測量累計光密度值(integrated optical density，IOD)和圖像面積(Area)，用IOD/Area所得平均光密度(mean optical density，MOD)進行下一步統(tǒng)計分析。

1.7 Western blot檢測APP/PSI轉(zhuǎn)基因小鼠海馬Aβ42的蛋白表達 取出凍存的新鮮小鼠腦組織進行稱重，按照每20 mg組織加入150 μL新鮮配制的組織裂解液比例裂解組織，在冰上研磨組織使其充分裂解后放入預(yù)冷的4 ℃離心機以12 000 r/min離心15 min，小心吸取上清液，丟棄沉淀，使用BCA蛋白濃度測定試劑盒檢測蛋白濃度。調(diào)節(jié)各組蛋白樣品濃度后，按照每4 μL蛋白樣品加入1 μL蛋白上樣緩沖液(5×)比例混合蛋白樣品和蛋白上樣緩沖液，在100 ℃金屬浴中加熱5 min，使蛋白充分變性。按照BCA法所測蛋白濃度計算上樣量，上樣后進行聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)，分離全程80 V。之后250 mA恒流電轉(zhuǎn)(濕轉(zhuǎn))至聚偏氟乙烯膜(polyvinylidene difluoride，PVDF)。轉(zhuǎn)膜完成后，用5%脫脂牛奶配制封閉液進行非特異性位點封閉，搖床上室溫封閉2 h，無須洗膜，直接將PVDF膜放入稀釋后的一抗中(稀釋濃度1∶1 000)4 ℃搖床孵育過夜。洗去一抗后將PVDF膜放入已稀釋的二抗中(稀釋濃度1∶5 000)，室溫搖床孵育2 h。洗膜后用增強發(fā)光液(enhanced chemiluminescence，ECL)發(fā)光成像。導(dǎo)出圖片后利用Image J軟件測定蛋白條帶灰度值。使用目的條帶灰度值/內(nèi)參灰度值對所得的相對數(shù)進行統(tǒng)計分析。

2 結(jié) 果

2.1 Morris 水迷宮測試結(jié)果 定位航行試驗中的1～6 d，每日取4個象限逃避潛伏期平均值進行統(tǒng)計，結(jié)果顯示：兩組小鼠逃避潛伏期均逐漸縮短，但與生理鹽水組相比，黃連素組小鼠逃避潛伏期時間明顯縮短，第1天差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，從第2天～第6天，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，詳見表1?？臻g探索實驗中，兩組小鼠60 s內(nèi)經(jīng)過原平臺位置次數(shù)所得數(shù)據(jù)滿足兩獨立樣本t檢驗的要求。與生理鹽水組相比，黃連素組小鼠經(jīng)過原站臺位置次數(shù)多，目標(biāo)象限活動時間長，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，詳見表2、圖1。水迷宮實驗結(jié)果提示，黃連素能改善APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠的學(xué)習(xí)和記憶能力。

表1 黃連素對APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠水迷宮定位航行實驗逃避潛伏期比較(±s) s

與生理鹽水組比較，1)P<0.05

表2 空間探索實驗APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠穿過原站臺次數(shù)和在目標(biāo)象限活動時間比較(±s)

生理鹽水組 黃連素組

2.2 Western blot檢測APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠海馬組織Aβ42蛋白的表達 黃連素組APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠行4周黃連素灌胃后，海馬組織內(nèi)Aβ42表達水平較生理鹽水組明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，詳見表3、圖2。Western blot結(jié)果提示，黃連素能降低轉(zhuǎn)基因小鼠海馬組織Aβ42的產(chǎn)生。

表3 黃連素對APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠海馬組織Aβ42表達的影響(±s)

與生理鹽水比較，1)P<0.05

圖2 黃連素對APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠海馬組織Aβ42表達的影響

2.3 免疫組化檢測APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠海馬組織Aβ42蛋白的表達水平 與生理鹽水組相比，黃連素組Aβ42染色平均光密度明顯降低(P<0.05)，詳見表4、圖3。免疫組化結(jié)果提示黃連素能降低小鼠腦內(nèi)Aβ42的表達。

表4 黃連素對APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠腦皮質(zhì)Aβ42表達光密度值的影響(±s) IOD

與生理鹽水組比較，1)P<0.05

生理鹽水組 黃連素組

2.4 免疫熒光檢測APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠腦內(nèi)Aβ的積聚 老年斑形狀和大小不同，主要由Aβ構(gòu)成，這些多肽聚集認為具有神經(jīng)毒性。生理鹽水和黃連素灌胃后APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠腦內(nèi)老年斑散在分布，相同視野下，與生理鹽水組比較，黃連素組小鼠腦內(nèi)老年斑形成減少，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，詳見表5、圖4、圖5。免疫熒光實驗結(jié)果提示，黃連素能減少Aβ積聚形成的老年斑。

表5 黃連素對APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠腦內(nèi)老年斑形成的影響(±s) 個

與生理鹽水組比較，1)P<0.05

圖4 生理鹽水組APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠腦內(nèi)老年斑形成的情況(IF，×40)

圖5 黃連素組APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠腦內(nèi)老年斑形成的情況(IF，×400)

3 討 論

隨著我國老齡人口增加，AD是危及老年人生命健康的重要病因，AD發(fā)病原因、病理機制仍有待明確。對該病發(fā)病機制的研究，有效藥物的開發(fā)對今后AD防治具有重要臨床意義。具有廣泛藥理作用的黃連素是一種天然的異喹啉類生物堿，是我國應(yīng)用長久的中藥，可從多種植物中提取，如黃連、黃柏，主要藥理作用包括抗炎、抑菌、降脂、降糖等[16-20]。黃連素價格便宜、服用簡單、攜帶方便，是一種物美價廉的臨床常用藥物，隨著深入研究，近年來黃連素在AD防治方面作用越來越受到關(guān)注。相關(guān)研究表明，黃連素能抑制膽堿酯酶活性，抗氧化應(yīng)激，減少Aβ形成，抑制Tau蛋白的過度磷酸化。本研究探討黃連素對AD模型小鼠認知功能和Aβ病理改變的影響。APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠是建立在Aβ沉積作為AD病理改變的中心環(huán)節(jié)發(fā)病機制假說，能較好地模擬AD病理改變的動物模型之一。采用Morris 水迷宮定位航行實驗及空間探索實驗?zāi)苡行y試小鼠對空間定位(空間方向感和空間位置感)的學(xué)習(xí)記憶能力[21]。本研究結(jié)果顯示，黃連素組小鼠表現(xiàn)為逃避潛伏期時間縮短和經(jīng)過原站臺位置次數(shù)增加及目標(biāo)象限內(nèi)活動時間增加優(yōu)于生理鹽水組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，提示中藥黃連素能改善AD轉(zhuǎn)基因小鼠的認知功能。

淀粉樣斑塊即老年斑沉積是AD的主要病理學(xué)特征。20世紀80年代Aβ認為AD病人腦內(nèi)淀粉樣沉積物的主要成分，其在AD發(fā)病及疾病進展過程中起到了重要作用。Aβ學(xué)說存在缺陷，如Aβ病理存在于認知功能正常個體中，臨床癥狀與病理表現(xiàn)不相關(guān)。由神經(jīng)元產(chǎn)生的Aβ其中一種聚合形式產(chǎn)生可溶性低聚體，這種聚合形成的寡聚體形式分子量小，能容易地進入突觸等神經(jīng)結(jié)構(gòu)，認為具有神經(jīng)毒性，造成線粒體損傷，引起氧化應(yīng)激，誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)及神經(jīng)細胞死亡，最終導(dǎo)致AD發(fā)生。Aβ產(chǎn)生和清除失衡是AD發(fā)病機制關(guān)鍵[22]。降低Aβ的產(chǎn)生及加速Aβ的清除是AD治療靶點。Aβ40和Aβ42是人體內(nèi)Aβ常見的亞型，其是淀粉樣前體蛋白(amyloid precursor protein，APP)經(jīng)β-和γ-分泌酶水解生成，由39～43個氨基酸組成。Aβ聚集能力一定程度上取決于自身的空間構(gòu)型，Aβ為β片層結(jié)構(gòu)，因其疏水性強，Aβ42更易聚積形成神經(jīng)炎性斑塊即構(gòu)成鏡下可見老年斑的主要成分，可能是Aβ主要的致病形式[23-24]。本研究應(yīng)用多種分子生物技術(shù)檢測黃連素對AD模型小鼠Aβ病理學(xué)影響，即能否影響Aβ42的表達水平和積聚。免疫組化和蛋白質(zhì)印跡試驗結(jié)果均顯示黃連素組小鼠皮質(zhì)及海馬內(nèi)Aβ42表達水平較生理鹽水組降低；免疫熒光結(jié)果進一步表明黃連素能減少小鼠腦內(nèi)老年斑的形成。

綜上所述，中藥提取物黃連素能改善AD模型小鼠的認知功能和減輕病理損害，但具體作用機制有待進一步研究和證實，如黃連素能否通過影響相關(guān)分泌酶活性改變APP水解途徑減少Aβ生成或通過增加小鼠腦內(nèi)Aβ的降解達到治療目的。