王霞 徐燦 吳秀園 孫雯婷 王英鋒 李中峰

摘?要?應(yīng)用核磁共振（NMR）代謝組學方法研究狼毒大戟根部毒性導(dǎo)致大鼠糞便代謝物的變化。將36 只SPF級雄性SD大鼠隨機分為3組，給藥組大鼠腹腔注射高低兩個劑量的狼毒大戟根部醇提物，對照組給予同體積含有3% 吐溫80的生理鹽水。每天給藥一次，連續(xù)給藥15天后停藥恢復(fù)15天，收集各組大鼠的糞便樣品。利用NMR技術(shù)檢測大鼠糞便中代謝物，對得到的1H-NMR數(shù)據(jù)進行多元統(tǒng)計分析，獲取大鼠糞便中內(nèi)源性代謝產(chǎn)物的變化規(guī)律。通過Student t檢驗進一步確定具有統(tǒng)計學意義的生物標志物。大鼠糞便中鑒定出35種代謝物，狼毒大戟導(dǎo)致12種代謝物變化顯著，其中谷氨酸、天冬氨酸、亮氨酸、丙氨酸、賴氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、二甲胺、三甲胺、尿嘧啶含量下降，葡萄糖、丁酸含量升高。這些與腸道菌群有關(guān)的代謝物變化表明，狼毒大戟毒性導(dǎo)致大鼠的腸道菌群紊亂，進而造成了大鼠體內(nèi)氨基酸、短鏈脂肪酸和葡萄糖代謝異常，為進一步揭示狼毒大戟的毒性提供了實驗依據(jù)。

關(guān)鍵詞?狼毒大戟; 代謝組學; 糞便; 核磁共振

1?引 言

據(jù)《中藥大辭典》記載，狼毒大戟（Euphorbia fischeriana Steud）為大戟科大戟屬草本植物，主要分布在我國的河北、黑龍江、遼寧、內(nèi)蒙古、吉林等地。狼毒大戟以根入藥，具有抗癌、抗白血病、抗菌、抗病毒和抗痛風、殺蟲、抗氧化等作用[1，2]。由于狼毒大戟具有多種藥效作用，尤其在抗腫瘤方面具有良好的活性而受到廣泛關(guān)注。然而，《本草綱目》中記載：狼毒（根）辛、平、有大毒。胡爽等[3]在狼毒大戟急性毒性實驗研究中發(fā)現(xiàn)，小鼠腹腔注射較高劑量的狼毒大戟根部提取物后，明顯出現(xiàn)活動困難、呼吸急促、步態(tài)不穩(wěn)等現(xiàn)象，并有一定數(shù)量的小鼠死亡。狼毒大戟因為具有較大的毒性，其應(yīng)用受到了限制。因此，充分認識和了解狼毒大戟的毒性是其安全、合理使用的前提。

代謝組學是通過對生物體內(nèi)所有代謝物進行定量分析，研究機體代謝產(chǎn)物變化的方法。代謝組學可以反映機體在疾病侵襲、藥物干預(yù)等作用下，內(nèi)源性小分子代謝物種類、數(shù)量的變化情況[4]，從而得到機體代謝變化的信息，已經(jīng)應(yīng)用于中藥毒性[5]、疾病診斷[6]、藥物作用機制[7]等領(lǐng)域。核磁共振（NMR）技術(shù)具有對樣品預(yù)處理簡單、無破壞性、實時動態(tài)檢測和無偏向檢測等特點[4]，通過對體液、組織或糞便等生物樣品進行測定，得到體內(nèi)小分子代謝物的豐富信息，已成為代謝組學中強有力的研究工具[8]?；诤舜殴舱竦拇x組學技術(shù)可以最大程度揭示生物體所產(chǎn)生的整體性的代謝變化，已被廣泛應(yīng)用在中藥藥效評價[9]、中藥藥理[10]和中藥毒理機制[11]等方面。胡永勝等[13]采用核磁共振代謝組學方法研究了雷公藤紅素對大鼠糖尿病潰瘍促愈合作用的機制。糞便是腸道菌群和宿主的共代謝產(chǎn)物[13]，糞便代謝作為研究機體代謝的一個重要方面，可以反映出腸道菌群對藥物、食物等的代謝情況[14，15]，為藥物研究提供重要信息。

本研究利用NMR代謝組學方法研究狼毒大戟根部醇提物對大鼠糞便代謝物的變化，篩選造成腸道菌群紊亂的相關(guān)的潛在生物標志物，初步從分子水平對狼毒大戟毒性作用機制進行研究，為狼毒大戟的毒性及毒性機制的探討提供了實驗依據(jù)，并為研究腸道菌群和機體代謝的緊密關(guān)系提供新思路。

2?實驗部分

2.1?儀器與試劑

Heraeus Multifuge X1R臺式離心機（美國Thermo公司）; BSA124S-CW分析天平（德國Sartorius公司）; 600 MHz Varian VNMRS核磁共振波譜儀（美國Varian公司）; Rotavapor R-220中型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（瑞士Buchi 公司）、Cascada Bio Mk2超純水機（美國PALL公司）。

狼毒大戟干燥根部（河北安國義全中藥有限公司）經(jīng)首都師范大學王英鋒教授鑒定為狼毒科（Euporbiaceae）大戟屬（Euphorbia ）植物狼毒大戟（Euphorbia Fischeriana Steud ）的根。NaH2PO4（99.5%）、K2HPO4（98%），購于美國Amresco公司; 吐溫80（化學純，天津市光復(fù)精細化工研究所）; 重水（D2O，99.9%氘代，美國Cambridge Isotope Laboratories公司）; 2，2，3，3-氘代三甲基硅烷丙酸鈉（TSP，98%氘代，美國Cambridge Isotope Laboratories公司）; 疊氮化鈉（NaN3，分析純，天津福晨化學試劑廠）。

SPF級SD雄性大鼠購于斯貝福（北京）實驗動物科技有限公司。

2.2?狼毒大戟醇提物的制備

按照課題組前期提取方法，取1.5 kg狼毒大戟干燥根部，粉碎，按質(zhì)量體積比1∶9加入70%乙醇，浸泡過夜（>12 h），60℃加熱提取2次，每次1.5 h。藥液靜置，冷卻至室溫后減壓回收乙醇，水浴蒸干，真空冷凍干燥，得到狼毒大戟根部醇提物。取狼毒大戟根部醇提物溶解在含有3%（V/V）吐溫80的生理鹽水中，其中，吐溫80用于增大狼毒大戟醇提物的溶解度。將混合液超聲30 min，配制成相應(yīng)濃度的狼毒大戟醇提物溶液。

2.3?動物實驗

動物飼養(yǎng)條件為室溫（25±5）℃，濕度60%±10%，12 h晝夜循環(huán)模擬自然光照，自由飲水攝食。實驗劑量設(shè)置參考前期小鼠急性毒性實驗，小鼠給藥最高劑量為0.13 g/kg，換算到大鼠實驗高劑量為0.10 g/kg。

36只SPF級SD雄性大鼠，體重280～320 g。隨機分為3組，其中高劑量組14只、低劑量組12只、對照組10只。每組劑量等比級數(shù)為1∶0.5，劑量設(shè)置為0.10和0.05 g/kg，對照組為含有3%吐溫80的生理鹽水。適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，在每次收集糞便時，需在給藥前禁食不禁水12 h。每天8：00～9：00腹腔注射給藥一次，注射體積為0.5 mL/100 g體重。連續(xù)給藥15天，依據(jù)大鼠體重變化隨時調(diào)整藥量。第16天起停止給藥，恢復(fù)15天。給藥前一天記為第0天，給藥期間每隔一天收集9：00～15：00的大鼠糞便樣品，恢復(fù)期間每隔4天收集9：00～15：00的大鼠糞便樣品。即第0、1、3、5…15、20、25、29天收集糞便樣品，糞樣收集后立即以液氮速凍，于80℃保存。

2.4?樣品處理

稱取50 mg大鼠糞樣于2 mL離心管中，加入500 μL磷酸鹽緩沖液（NaH2PO4-K2HPO4，0.1 mol/L，pH=7.4），緩沖液使用50% D2O配制，其中含有0.002% （w/V） TSP和0.1% （w/V） NaN3，分別作為化學位移內(nèi)標和防腐劑。渦旋充分混勻后， 用液氮反復(fù)凍融3次。凍融物進行勻漿（20 Hz，90 s），勻漿液于4℃，10000 g離心10 min。取出上清液，剩余沉淀物用相同方法再提取2次，將3次操作所得到的所有上清液混合后再離心（4℃，16000 g，10 min），取上清液550 μL轉(zhuǎn)移至5 mm NMR樣品管中， 進行NMR檢測。

2.5?核磁共振數(shù)據(jù)的采集

25℃下，在Varian VNMRS 600 MHz核磁共振波譜儀上采用預(yù)飽和的1D-?NOESY脈沖序列測定糞便水溶樣的1H-NMR譜，1H的共振頻率為599.808 MHz。實驗參數(shù)為：譜寬12000 Hz，采樣點數(shù)64 K，信號累加128次，混合時間（tm）為100 ms，在弛豫延遲期間采用預(yù)飽和方式壓制水峰信號。為進一步對1D譜中的信號進行歸屬，選取具有代表性的樣品， 采集一系列的2D NMR譜，如1H-1H COSY、1H-1H TOCSY、1H-13C HSQC和1H-13C HMBC等。

2.6?數(shù)據(jù)處理

譜圖使用MestReNova軟件（Version 7.1.2，西班牙Mestrelab Research公司）進行手動相位、基線校正后，用內(nèi)標TSP的單峰定標（δ 0.00）。對δ 0.5～9.5區(qū)域的圖譜進行分段積分，積分區(qū)間寬為0.002 ppm。為了消除殘余水峰信號的影響，剪掉譜圖中δ 4.7～5.2區(qū)間。對積分后的數(shù)據(jù)進行總面積歸一化處理，然后導(dǎo)入SIMCA-P+（Version 12.0， 瑞典Umetrics公司）進行多變量統(tǒng)計分析。主成分分析（PCA）使用中心化換算（Ctr）的數(shù)據(jù)標度換算方式，它可以反映樣品整體的分布趨勢，同時可以觀察到組內(nèi)有無異常點，分析結(jié)果以得分圖（Scores plots）顯示。歸一化所得數(shù)據(jù)經(jīng)單位方差換算（UV）標度化處理后，進行偏最小二乘法判別分析（PLS-DA）和正交偏最小二乘法判別分析（OPLS-DA）。其中，PLS-DA用于分析NMR數(shù)據(jù)與分組變量之間的關(guān)系，同時得到變量投影重要性（VIP）>1的代謝物信息。用舍一法對模型進行交叉驗證，參數(shù)R2和Q2分別表示模型擬合情況和預(yù)測能力，然后通過排列實驗驗證模型的有效性。最后以O(shè)PLS-DA最大化凸顯組別之間的差異，并利用MATLAB R2012a軟件（Version 7.1， 美國 Mathworks 公司）結(jié)合自編程序作出相關(guān)系數(shù)圖，圖中顏色沿著右側(cè)越接近紅色，表示相應(yīng)代謝物對組間差異的貢獻越大。根據(jù)兩組中較小的樣本數(shù)，查閱皮爾森相關(guān)系數(shù)臨界值表，當某代謝物信號的相關(guān)系數(shù)絕對值|r|>r臨界值時，認為該代謝物的變化對模型的區(qū)分有意義。本研究中，相關(guān)系數(shù)的臨界值分別為0.291（n=45，給藥15天）和0.532（n=13，恢復(fù)15天）。為進一步驗證差異代謝物的顯著性，對代謝物對應(yīng)的積分面積數(shù)據(jù)導(dǎo)入SPSS軟件（Version 17.0，美國SPSS公司）進行獨立樣本t檢驗，顯著性閾值設(shè)置為p<0.05。當3個標準同時得到滿足時，即VIP>1，P<0.05，|r|≥r臨界值，相應(yīng)的代謝物即可被選為差異代謝物。

3?結(jié)果與討論

3.1?糞便樣品代謝物譜圖分析

圖1為高劑量組（High）、低劑量組（Low）和對照組（Control）大鼠糞便樣品中具有代表性的1H-NMR譜。根據(jù)代謝物文獻[11，12，16～19]、已有的經(jīng)驗及Chenomx NMR Suite 數(shù)據(jù)庫（Version 7.5，加拿大Chenomx公司）和代謝組學相關(guān)數(shù)據(jù)庫（HMDB， http：//www.hmdb.ca/），對譜圖的代謝物進行準確歸屬。結(jié)合相關(guān)二維譜圖（如1H-1H COSY、1H-1H TOCSY、1H-13C HSQC和1H-13C HMBC等）對歸屬的代謝物進行確認。本研究從圖譜中歸屬出35種代謝物。肉眼可分辨出一些特征性差異代謝物，如給藥組中具有較低濃度的尿嘧啶和較高濃度的葡萄糖等。

3.2?多元統(tǒng)計分析

為了觀察樣本的聚類情況以及排除異常點，對連續(xù)給藥15天和停藥恢復(fù)15天后所有大鼠糞便樣品的NMR數(shù)據(jù)進行PCA分析。連續(xù)給藥15天所有大鼠糞便樣品的PCA得分如圖2A所示，PC1=55.1%; PC2=16.2%，劑量組與對照組之間雖有部分重疊，但依然能看出分離趨勢。由圖2C中PLS-DA得分圖（R2Y=0.776; Q2=0.759）更清晰地顯示出組別之間的分離，其中高劑量組與對照組區(qū)分更明顯。表明了給藥后大鼠體內(nèi)環(huán)境出現(xiàn)顯著變化，且藥物對機體的影響與劑量呈正相關(guān)。圖2B和2D分別為停藥恢復(fù)后劑量組與對照組的PCA（PC1=52.2%; PC2=13.4%）和PLS-DA（R2Y=0.747; Q2=0.597）得分圖，圖中依然可以觀察到劑量組與對照組的區(qū)分，表明在停藥恢復(fù)15天后，給藥組與對照組大鼠仍存在代謝差異。

為了動態(tài)觀察狼毒大戟對大鼠的影響隨時間的變化情況，對不同時間得到的大鼠糞便樣品進行時間-軌跡分析（圖3），圖3中每個點代表一組大鼠在同一天的平均位置。在給藥初期，劑量組即與對照組存在明顯差異，此后均在一定范圍內(nèi)波動，且高劑量組與對照組的差異較低劑量組更為明顯。停藥恢復(fù)階段，兩劑量組的變化趨勢趨于一致，但仍與對照組保持一定差異。

采用PLS-DA對給藥期間和恢復(fù)期間高劑量組和對照組所有大鼠糞便樣品的NMR數(shù)據(jù)進行分析。圖4A為連續(xù)給藥15天高劑量組和對照組大鼠糞便樣品的1H-NMR譜得到的PLS-DA得分圖（R2Y=0.869; Q2=0.848），圖4C為停藥恢復(fù)15天高劑量組和對照組大鼠糞便樣品的1H-NMR譜得到的PLS-DA得分圖（R2Y=0.794; Q2=0.666）。模型的排列驗證（200次）結(jié)果如圖4B和4D所示，Q2回歸線與y軸交點在負半軸，R2回歸線與y軸交點在正半軸，且R2和Q2的數(shù)值在最右端接近，表明建立的糞便樣品數(shù)據(jù)模型成立，即兩組大鼠糞便樣品中的代謝物存在顯著的差異。