陳夢迪 楊雁婷 鄧治楊 徐洪燕 鄧吉楠 楊忠 胡寧 楊軍

摘?要?設計并制作了一款由兩種大小不同微球層疊堆積的微通道與毛細通道陣列組合而成的微流控芯片裝置，可以在全血樣本流經微通道過程中，通過微球堆積層過濾、吸附其中的細胞組分，快速分離出血漿。采用負壓進樣方式在微通道中緊密堆積微球，并采用蛋白封閉液包被的方法增加微球表面親水性，在毛細作用下，芯片烘干冷卻后滴入的全血在微通道中前進，進而分離出血漿。測試了直徑分別為10、15、20、23和40 μm的不同微球對血漿分離速度的影響，當使用直徑為10 μm的微球堆積通道時，血漿分離速率最快?？疾炝硕逊e通道局部加寬設計等對血漿分離的影響，結果表明，相較于長直型通道，局部加寬通道的血漿分離速率大大增加，最快可達0.16 μL/min，可在短時間內收集得到足量血漿，滿足大多數臨床血液檢測等相關要求。利用本方法收集的血漿樣本在芯片上進行血液凝集實驗，可快速分析待測血液血型，具有良好的實際應用價值。

關鍵詞?血漿; 微流控芯片; 全血; 毛細作用; 過濾

1?引 言

全血由紅細胞、白細胞、血小板等血細胞和血漿組成[1]，血細胞占全血的40%～45%，血漿占55%～60%。血漿成分復雜，主要包括蛋白質、脂類、無機鹽、糖等，很多成分與人體的各種生命活動直接相關，因此， 檢測分析血漿成分對基礎生物醫(yī)學研究及臨床檢測都有重要意義[2]。由于血細胞及其所含物質常會干擾血漿成分分析，在相關檢測中，需提前去除血細胞。在傳統(tǒng)的實驗室分析方法中，分離血漿最常用的方式是對全血進行離心操作，取上清液即可得到血漿。但是，血液即時檢測（Point-of-care testing， POCT）設備得到越來越廣泛的應用，基于離心的血漿制備方法由于所需裝置較大、成本較高，難以滿足實際檢測要求[3]。

微流控芯片因其結構尺寸小、成本低、通量高、試劑消耗少、反應快等優(yōu)勢，已被廣泛用于各種POCT設備中[4]。對于全血中血漿的分離，微流控技術同樣具有巨大應用潛力，因此成為目前該領域的研究熱點，已有多種不同的微流控裝置被用于血漿分離研究中[5～14]。其中，具有天然多孔結構的纖維薄膜、濾紙等材料較多用于微流控血漿分離，對血液的操作可采用類似傳統(tǒng)生化試紙的側向流層析方法，如目前常見的紙質芯片結構[5]。此外，也有研究利用紅細胞的側向位移，在靠近壁的一側形成一層無細胞區(qū)域以分離血漿[6]。另一類方法則較多依賴于多孔薄膜的過濾作用[7，8]。這些裝置結構簡單、成本低廉，但是所得到的血漿量通常較少，而且是吸附在多孔結構中或薄膜表面上。同時，這類結構的濾孔也易被堵塞，實際應用范圍有限。由于微流控技術已經廣泛應用于細胞分離領域[9]，因而又陸續(xù)出現了多種微流控結構及操作方法以實現血漿分離?；阱e流過濾的微流控血漿分離方法[10，11]，利用單一通道尺寸小于血細胞的微通道陣列限制血細胞的流動，從而實現血細胞和血漿在平行通道中的分配，達到分離血漿的目的。模仿體內毛細血管中細胞流動的Zweifach-Fung效應（即分支毛細血管結構中血細胞傾向于流入流速更高通道的一種效應）也被用于血漿分離芯片的構建[12，13]，血液流經微通道的分叉處時，由于受到較強壓力梯度的作用，絕大多數血細胞傾向于流入流速高的微通道中，從而實現血漿在低速分支通道中的分離。在微流控芯片中，還可利用一些特殊幾何結構構成的陣列，如通道中突起的斜紋結構陣列，改變血細胞的流動方向，并向特定方位富集，從而實現血漿分離[14]。除了各種微結構，流體的特殊微流控操作也可用于血漿分離。如在慣性微流過濾中，利用微通道中細胞所受慣性升力的平衡點，可使血細胞穩(wěn)定在通道橫截面中某個位置形成聚焦流動，從而完成血細胞的分離[15]。相比于傳統(tǒng)的多孔介質的血液滲流及過濾分離方法，基于特殊微結構或者微流控操作技術的血漿分離方法速度更快，所得到的血漿量也更多，更適于POCT分析。但是，在微通道中加工各種微結構的工藝復雜，造價昂貴; 而各種微流控操作方法對加工及流動控制精度的要求也較高; 同時，很多血漿分離都需對血液做稀釋等預處理，不適合直接對全血進行操作，限制了其推廣應用。

Shim等[16]利用不同尺寸的微球在微流控芯片的進樣池與微通道連接處堆積形成一個過濾系統(tǒng)，通過微球間間隙對血細胞的阻擋作用及血液的毛細作用，選擇性地使血漿更快流到后端微流控通道中，實現血漿的快速分離。該方法依賴于微流控結構中的毛細作用，不需外加驅動裝置，結構和制作簡單，分離速度也較快。但是，該設計在實際應用中還存在一些問題，如微球僅依靠相互粘結固定在微通道入口位置，抵抗外力干擾能力弱，容易脫落、移位。血漿分離完全依靠毛細作用驅動，流動通道尺寸不能太大，這也導致單一通道設計很難將足夠分離血漿輸送到后端尺寸較大的檢測微腔室等結構中（這些結構中毛細作用很弱）。由于光學檢測技術等要求，較大檢測腔室在微芯片生化檢測及免疫分析等應用中廣泛使用[17]; 同時，較小尺寸的微通道中單次分離血漿量少（一次最多102 nL），也限制了其應用范圍。由于微球堆積層厚度較薄，延長分離時間會導致部分紅細胞穿過微球堆積層，污染已經分離的血漿。

本研究構建了一種基于微球堆積微通道和毛細微通道陣列的微流控芯片結構，利用特定微通道約束不同尺寸的微球，使血液在通過層疊微球過程中實現血細胞和血漿的分離。血漿分離過程中，無需借助外力作用。通過填裝大量微球于微通道中，可以提高分離的血漿量; 同時，微球層疊通道下游的陣列化微通道結構相比單一微通道更有利于大量血漿的收集。探究了微球尺寸和芯片結構對血漿分離過程的影響。相較于同類型微球堆積血漿分離裝置，本裝置分離血漿速度更快，血漿收集量更大。

2?實驗部分

2.1?儀器與試劑

LSP10-1B實驗室十通道注射泵（保定蘭格恒流泵有限公司）; URE-2000/25型紫外光刻機（中國科學院光電技術研究所）; PDC-MG等離子清洗機（成都銘恒科技發(fā)展有限公司）; IX73顯微鏡（日本奧林巴斯公司）; EOS 600D照相機（日本佳能公司）

磷酸鹽緩沖液（Phosphate buffer saline，PBS）干粉（北京索萊寶科技有限公司）; 吐溫20（合肥博美生物科技有限責任公司）; 封閉蛋白干粉（美國博士德生物工程有限公司）; 聚二甲基硅氧烷（Polydimethylsiloxane，PDMS，美國Dow Corning公司）; SU8 3050（美國MicroChem公司）; 二氧化硅微球（直徑分別為10、15、20、23和40 μm，中國知益微球科技有限公司）。

2.2?芯片設計及加工

血漿分離的目的是將血液中的血細胞與血漿有效分開。血細胞中絕大多數都是紅細胞，約占血液體積50%。因此，血漿分離的主要目的就是去掉紅細胞。紅細胞呈兩面中央凹的圓餅狀，直徑約8 μm， 厚度約2 μm， 具有極強的變形性，可形變通過小于其幾何尺寸的孔道，但壓力過大時也可能破裂。芯片（圖1）中設計了一條填充微球的微通道，通過微球之間的孔隙一定程度上阻滯紅細胞運動，同時通過毛細作用使血漿快速流經微通道，從而實現血漿的分離。

微流控芯片由上下兩層結構組成（圖1A），上層為PDMS層，下層為玻璃基底層。芯片中的流動網絡主要由全血進樣腔、微球層疊通道、血漿分離通道陣列、血漿收集腔等部分組成。其中，進樣腔直徑為4 mm。微球層疊通道的尺寸為14.8 mm（長） 4 mm（寬） ?220 μm（高），用以容納微球。通道一側刻有刻度標志（相鄰刻度間距為1 mm），方便確定微球堆積數量。微球層疊通道后端與18條尺寸分別為1.5 mm（長） ?100 μm（寬） ?85 μm（高）的血漿分離通道相連（圖1B）。分離的血漿最后流入尺寸為4.6 mm（長） ?2.1 mm（寬） ?220 μm（高）的血漿收集腔。在微球裝填過程中，先將較大尺寸微球填充到微球層疊通道中，擋住其進入血漿分離通道的入口，避免隨后堆積的尺寸較小微球進入分離通道中。通過表面處理使微球表面具有較強的親水性。由于毛細作用與毛細管的半徑成反比，因此可以通過選擇微球尺寸調節(jié)毛細作用[18]。微球相互堆積形成孔隙，起到了毛細管的作用，此處將孔隙模擬為一根長直的毛細管，在毛細管的一端添加液體，不施加其它力的作用，模擬液體在毛細管內的前進。采用COMSOL Multiphysics 4.4軟件進行仿真。當毛細管直徑變小時，液體在毛細管中前進的速率明顯加快。

芯片加工時，首先采用二次光刻法在硅片上制備由兩層不同高度（220 μm/85 μm）的微結構構成的母版： （1）在洗凈烘干的硅片上旋涂一層光刻膠SU8 3050（1500 r/min，1 min）; （2）前烘45 min后曝光（27 s）; （3）后烘，顯影得到第一層結構（高85 μm）; （4）重復操作得到第二層結構（SU8 2050，500 r/min，1 min， 所得光刻膠高220 μm），最終得到有雙層結構的硅片母版。將PDMS倒入固定母版的模具中，除盡氣泡后，在80℃的烘箱中加熱30 min，脫模即可得到具有預定微結構的PDMS膠塊，然后在PDMS膠塊上進樣腔和收集腔氣孔位置打出相應尺寸通孔。芯片采用玻璃作為基底材料，玻璃基底具有良好親水性，有利于微球溶液的進入。將玻璃基底和PDMS膠塊等離子處理3 min后鍵合，并在150℃熱壓10 min即得到實驗芯片（圖1C）。待芯片冷卻后，盡快加入蛋白封閉液（0.065 g/mL），以包被通道表面，增加其親水性。蛋白封閉液由封閉蛋白干粉溶于吐溫20-PBS緩沖液（1∶2000，V/V）。

2.3?實驗過程

2.3.1?微球堆積?在芯片中，起過濾作用的主要是小尺寸的微球。在微球堆積通道中填充微球時，為避免尺寸小的微球從分離微通道中流失，芯片內共堆積兩種尺寸的微球，先堆積直徑100 μm的微球，再堆積較小尺寸的微球。將實驗所用的二氧化硅實心微球加入去離子水中，形成微球懸液，從進樣腔入口加入后，在收集腔出口一端抽氣形成負壓，可使微球在通道內堆積。通過芯片上的刻度標志可以判斷并控制不同微粒堆積量。

在微球堆積過程中，微球始終浸潤在蛋白封閉液中，蛋白在微球表面吸附，可將其表面從疏水性改變?yōu)橛H水性，顯著提高毛細作用強度。堆積微球的微芯片如圖2A所示。將填充好微球的芯片中的蛋白封閉液盡量抽盡后， 于75℃烘烤至水分全部蒸發(fā)，冷卻后，于4℃放置過夜，備用。

2.3.2?血漿分離實驗?血液樣本采用作者本人血液，由重慶大學醫(yī)院采集，經重慶大學醫(yī)院同意，可用于實驗。將20 μL血液樣本加入進樣腔中觀察并記錄血漿分離情況（圖2B）。由于毛細作用，血液會自動在通道內前進。微球與通道壁及微球間的狹窄縫隙有助于產生較大的毛細作用力，推動血液中的血漿流動。較小縫隙對以紅細胞為主的血細胞則有較大阻礙作用。血液在進入芯片一段時間后，紅細胞和血漿運動前沿會出現一定程度的分離。

3?結果與討論

3.1?血漿的分離

參考文獻[16]的研究結果，在實驗中先選擇直徑分別為100 μm和15 μm的兩種尺寸的微球，其中大微球的填充量約0.88 μL（占據1 mm長的通道），小微球的填充量約12.32 μL（占據14 mm長通道）。當血液從進樣腔加入芯片后，血漿在毛細作用下向前運動，而血液中的紅細胞由于微球的阻礙而逐漸滯后。經過一段時間后，血漿（圖3中的透明部分）運動的前沿明顯超越紅細胞（紅色部分）的運動前沿，表明部分血漿成分逐漸從血液中分離出來。從微球區(qū)域流出的血漿在下游的分離通道陣列中快速流動，隨后進入收集腔逐漸積累。芯片中收集腔和微粒堆積通道高度均為220 μm，而中間的分離通道高度為85 μm，當血漿從不同分離通道進入收集腔時，不同分離通道流入的血漿逐漸匯流到一起，從收集腔的角落處開始慢慢積累（圖3C）。最后，收集腔中得到淡黃色透明血漿，說明在整個分離過程中基本沒有紅細胞被擠壓破裂。

相對于Shim等[16]設計的芯片結構，本研究中的芯片更厚的微球堆積層可實現更多的血漿分離; 同時，由18條分離通道構成的陣列可同時輸送更多的血漿進入收集腔室。實驗中還發(fā)現，由于血漿的不斷分離，剩余血液中血細胞濃度不斷增加，粘度也不斷加大，流速減慢，導致最終未分離的血液（主要是紅細胞）會停留在微通道的某一位置。因此，可以選擇合適的微球填充量，在保證血清分離效果的同時，提高分離速度。影響血漿分離的主要因素在于填充微球的尺寸，在隨后的研究中，探討了不同微球尺寸的影響。

3.2?不同小微球尺寸的影響

直徑100 μm的大微球主要用于阻止較小微球進入分離通道，對整個血漿分離過程無明顯影響。因此，實驗中大微球的尺寸及填充量保持不變，只考察直徑分別為10、15、20、23和40 μm的5種小微球對血漿分離的影響。微球尺寸的選擇主要參考紅細胞大小以及可選擇的商業(yè)化微球尺寸。小微球在微通道中的填充尺寸保持一致。

針對不同尺寸的微粒均進行5次重復實驗。實驗中，當微球尺寸較大（40 μm）時，微球間的孔隙不足以阻礙血細胞隨液體成分的運動，不能觀察到血細胞和血漿之間有明顯的分離。因此，在后面的分析討論中，主要討論尺寸較小的4種微球的影響。血液在微球中前進，分成血漿和血細胞兩部分，形成前后兩條運動前沿，記下不同時刻血漿和血細胞運動前沿離微球堆積邊緣的距離，當運動前沿不規(guī)則時，取血漿和紅細胞移動前沿左右邊緣差的中點處作為前沿，繪制血漿和血細胞前進距離與時間線圖（圖4）。

實驗結果表明，當通道中填充尺寸分別為10、15、20和23 μm的較小微球后，血液中血漿和血細胞的前進速度出現了不同程度的差異（圖4），血細胞的運動滯后于血漿。經過一定時間后，多數微球填充通道中，血細胞會停留在某一位置不再繼續(xù)運動，血細胞停止運動的位置和血液剛進入微球堆積區(qū)之間距離為血細胞前進距離。

實驗中，直徑10 μm微球填充的微通道中血漿流速明顯更快，只需9.8 min，血漿即可通過全部微球填充區(qū)。對于直徑分別為15和23 μm的微球，血漿流過微球填充區(qū)的時間差別不大，約在2225 min，而直徑20 μm微球填充的微通道中血漿流速最慢，需要近100 min血漿才能流出。而對于直徑分別為10、15和20 μm的微球，血漿和紅細胞前進的速度差異明顯，血漿容易分離; 前兩種微球填充通道中血細胞前進距離約為8 mm（分別為（8.50±1.29） mm、（9.10±1.29） mm）的位置，而直徑20 μm的微球堆積通道中，血細胞前進距離為（11.38±0.75） mm。在直徑23 μm的微球填充的通道中，血漿和紅細胞的運動速度差異不大，分離困難，而且紅細胞可以流過微球堆積層。

血液在微通道中運動的驅動力主要源自毛細作用和由液面差引起的靜壓力，阻力主要來自微通道的流阻。而對于血液中的細胞，驅動力主要是血液運動對細胞的粘性力，阻力則主要是微球間隙對細胞的阻礙作用。對于較小的空隙，毛細作用更強，但是流阻也更大。由于血液是非牛頓流體，而且血細胞與微球的相互作用會對空隙幾何形態(tài)及流體運動本身產生很大影響，要準確計算各種條件下血液的流動情況很困難。就實驗結果而言，在直徑10 μm微球填充的通道中，毛細作用的影響更為明顯，血漿流動速度（（1.54±0.60）mm/min）比更大微球填充的通道快很多。在直徑>15 μm微球填充的通道中，微球間隙增加導致毛細作用減弱，但同時流阻也在減小。在微球直徑<20 μm時，毛細作用減弱的影響更大，因而血漿流動速度逐漸減慢; 在微球直徑>20 μm（如23 μm）時，較大的微球間隙產生的阻力很小，血漿的流動速度又增加。對于紅細胞，較大微球間縫隙的增加更有利于紅細胞變形通過，因此紅細胞在微球堆積通道中的前進距離也隨微球尺寸的增加而逐漸增大。對于目前采用的芯片結構，直徑>23 μm的微球不能將紅細胞完全停留在微球堆積通道中，長時間分離操作會導致紅細胞進入下游的分離通道及收集腔，影響分離效果。因此，為了保證血漿分離效果及血漿獲取量，需在微通道中填充足夠長度的微球堆積層。對于本研究所測試的微球，在通道中填充直徑10 μm微球是較好的選擇。一方面，血漿分離速度更快，有利于快速的POCT操作; 另一方面，紅細胞移動距離更短，實際應用中需要的微球堆積量相對更少。

3.3?微球堆積通道結構的影響

為了提高血漿分離速度，本研究對微球堆積通道結構做了改進。文獻[16]表明，堆積于通道口的微球層厚度越大，外圍面積也越大，從而可以提高血漿分離量和分離速度。因此，本研究加寬了芯片的微球堆積通道的中部，希望通過提高微球堆積的數量及橫截面尺寸提高血漿分離速度。新的芯片結構如圖5A所示，微球堆積通道最寬處增加到7.5 mm，通道變寬部分總長度為8.5 mm。此結構由于通道寬度較寬且通道結構不規(guī)則，在用負壓進行通道內微球堆積時， 會出現微球堆積邊界與流動方向不完全垂直的情況（圖5A），但是對實際分離實驗的影響有限。

為了考察不同芯片結構下血漿分離速度的差異，比較了兩種芯片中血漿的流量大小。由于兩種芯片中通道深度相同，實驗中只需比較兩種芯片中血漿單位時間擴展面積的差異，流速單位mm2/s指平均每秒血漿前進所覆蓋的微球面積，如血漿在100 s內通過了面積為60 mm2的微球填充區(qū)，則流速為0.6 mm2/s。當在芯片進樣腔滴加20 μL血液時，新設計的通道結構中血漿流速比直通道都大（圖5B），其中直徑10 μm微球填充的通道差別最為明顯。在新設計的結構中，由于通道部分加寬，血液與微球接觸面更大，通道加寬部分相當于增加了更多的微小毛細管，更有利于血漿的運動。當采用直徑10 μm微球填充時，血漿的分離速率可達到0.16 μL/min，短時間內分離產生的血漿量即可滿足多數分析的要求。

3.4?不同小微球尺寸對血漿積累速率的影響

當血漿穿過全部微球堆積區(qū)域，進入血漿分離通道陣列并在后續(xù)的出口腔堆積，記錄從血漿開始在出口腔堆積直到血漿鋪滿整個出口腔的時間，計算出不同微球填充芯片的血漿積累速率。在微球填充區(qū)域，不同直徑的微球形成不同粗細的孔隙，因而血漿在其中的前進速度也不同，即血漿的產出速度不同。在芯片中填充不同尺寸（直徑分別為10、15、20、23 μm）、但填充量相同的微球，探究微球尺寸對血漿積累速率的影響。每個尺寸微球分別進行3次重復實驗并統(tǒng)計結果。其中，只有直徑10和15 μm微球填充的芯片能夠在出口腔積滿血漿，即收集到3.29 μL血漿; 20 μm微球填充芯片收集血漿速率極緩慢，產出血漿量不足以將出口腔填滿; 23 μm芯片由于孔隙較大，有部分紅細胞進入出口腔，所收集血漿純度不高。統(tǒng)計得出直徑10和15 μm微球填充的芯片中血漿積累速率分別為（0.160±0.025） μL/min和 （0.030±0.007） μL/min。10 μm微球填充的芯片中血漿堆積速度遠快于15 μm， 這與3.2節(jié)中所討論的血漿在10 μm微球填充通道的前進速度遠大于在15 μm微球的現象相符合。將血漿視為無數個體積元，在10 μm填充通道中，每個體積元穿過微球間孔隙的速度大于在15 μm微球中的速度。當血漿體積元通過全部微球填充區(qū)，進入血漿分離通道陣列，到達出口腔并開始積累，微球的尺寸對體積元的前進和積累速率不再有影響。本研究尚未考慮血漿分離通道陣列的尺寸對血漿積累速率的影響，可以在后續(xù)實驗中進一步探究。

3.5?凝集實驗分析

血漿分離是生物醫(yī)學檢測的重要環(huán)節(jié)，分離得到的血漿可用于多種檢測，如常見的免疫及生化分析[17]。本研究為了驗證分離得到的血漿是否能夠滿足一般的測試要求，以分離得到的血漿作為樣本，與另一個血液樣本進行凝集實驗。凝集實驗是一種常見的臨床血液分析手段，常用于血型鑒定和交叉配血實驗（Blood cross-matching test）[19]等。基于微球層疊通道的血漿分離方法結構簡單，分離速度快，血漿純度高，血漿量大，在交叉配血實驗等對檢測方便性和速度要求很高的應用中極具潛力。

凝集實驗中，不同血型的血液中紅細胞表面抗原不同，血漿中含有與之兼容的抗體，如A型血紅細胞表面抗原是凝集原A，其血漿含抗B凝集素。通過將待測血液中的紅細胞和已知標準血漿混合，根據紅細胞是否出現凝集分析待測紅細胞表面含有何種抗原，從而判斷待測血液的血型[20，21]。實驗中，收集腔中積滿血漿后，將1 μL待測血液樣本用微量進樣器加入收集腔，輕輕擠壓芯片，使血液和血漿樣本混合，觀察出口腔情況。當待測血液和血漿發(fā)生凝集時，待測血液紅細胞在進入血漿后不會分散，反而聚集成團。在擠壓混合后，出現絮狀的紅細胞團塊（圖6A）。在顯微鏡下觀察，收集腔中紅細胞呈團塊，出現凝集現象（圖6B）。如未發(fā)生凝集，待測血液紅細胞進入血漿后，分散并在收集腔室內鋪開，呈淡紅色均勻分布，擠壓混合后沒有變化（圖6C）。紅細胞均勻分布，無凝集現象（圖6D）。

4?結 論

本研究設計了一種全血過濾芯片，通過微通道中填充的微球過濾分離血漿。不同尺寸微球的分析結果表明，在微通道中填充直徑10 μm的微球，血漿分離速度最快，而且微球需要量最低。實驗結果表明，局部擴大微球填充通道尺寸，有助于血漿的快速分離，也可收集到更多的血漿。通過凝集實驗表明芯片收集血漿技術可應用于臨床檢測。相對于現有的入口微球填充方法，新設計的芯片可得到更多血漿，并收集到一個檢測腔室中，適用范圍更廣。而且，微球固定更加穩(wěn)定，更有利于實際應用。因此，基于微球填充通道的血漿分離裝置有望成為POCT設備中的關鍵器件。

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