林學勇，李東

上海市嘉定區(qū)安亭醫(yī)院外科，上海 201805

膀胱癌好發(fā)于老年男性，發(fā)病率一直居高不下。膀胱癌是世界第四大最常見腫瘤，也是中國最常見的泌尿生殖系統(tǒng)惡性腫瘤，嚴重影響患者的生命健康[1]。目前，手術(shù)治療仍然是膀胱癌的主要治療方法，但術(shù)后易復(fù)發(fā)。微小RNA（microRNA，miRNA）是一類含有19～22個核苷酸的內(nèi)源性非編碼RNA，通過誘導(dǎo)目的基因的信使RNA（messenger RNA，mRNA）降解，從而抑制目的蛋白的表達，對原癌基因和抑癌基因均具有調(diào)節(jié)作用。研究表明，miRNA在腫瘤細胞的增殖、分化和凋亡等基本生物過程中發(fā)揮重要作用，胃癌、淋巴瘤、乳腺癌、肺癌、結(jié)腸癌和肝癌等惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展中也可檢測到miRNA的突變和異常調(diào)節(jié)[1-2]。研究顯示，miRNA-137可抑制惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展，其在卵巢癌、胃癌、惡性膠質(zhì)瘤、結(jié)直腸癌和成神經(jīng)細胞瘤中表達下調(diào)[3-5]。Shim izu等[6]研究發(fā)現(xiàn)，miRNA-137在膀胱原發(fā)性腫瘤中呈甲基化狀態(tài)，與腫瘤細胞的生物學過程息息相關(guān)。本研究探討miRNA-137在膀胱癌中的表達情況及其對膀胱癌細胞侵襲和遷移能力的影響，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 標本收集

選取2015年1月至2017年1月上海市嘉定區(qū)安亭醫(yī)院收治的膀胱癌患者。納入標準：①術(shù)后病理活檢證實為膀胱癌；②術(shù)前均未接受任何放化療等其他治療。排除標準：①合并心、肝、腎等主要器官病變的患者；②膀胱癌復(fù)發(fā)患者。依據(jù)納入和排除標準，共納入30例膀胱癌患者，其中男16例，女14例；年齡44～78歲，平均年齡為（64.0±5.7）歲；浸潤性膀胱癌12例，非浸潤性膀胱癌18例；世界衛(wèi)生組織（WHO）/國際泌尿病理協(xié)會（International Society of Urological Pathology，ISUP）病理分級：Ⅰ級11例，Ⅱ級8例，Ⅲ級7例，Ⅳ級4例。取30例膀胱癌患者的膀胱癌組織和癌旁組織標本，癌旁組織取自膀胱癌患者腫瘤組織＞5 cm處的正常組織。

1.2 實驗方法

1.2.1 RT-PCR檢測miRNA-137的相對表達量采用實時定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR）試劑盒檢測膀胱癌組織和癌旁組織中的miRNA-137的相對表達量，Trizol法提取膀胱癌組織和癌旁組織中的總RNA。擴增條件：95℃預(yù)變性5 min進入循環(huán)，95℃變性45 s，54℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，共30個循環(huán)，72℃最終延伸5 min。以U6作為內(nèi)參，2-ΔΔCt法計算miRNA-137的相對表達量。miRNA-137正向引物：5'-GCGCGCTTATTGCTTAAGAATAC-3'，反向引物：5'-CGGCCCAGTGTTCAGACTAC-3'；U 6 正向引物：5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3'，反向引物：5'-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3'。實驗重復(fù)3次。

1.2.2 細胞轉(zhuǎn)染方法 取本實驗室保存的膀胱癌T24細胞株，采用含10%胎牛血清的RPM I 1640培養(yǎng)基，放置于含5%CO2、37℃的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。取對數(shù)生長期細胞，以3×105/ml的濃度接種于24孔板，待細胞融合度為70%～80%時，在脂質(zhì)體LipofectamineTM2000的介導(dǎo)下將m im ic-NC、miRNA-137 m im ic、miRNA-137 inhibitor質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至膀胱癌T24細胞，并分別作為空白組、高表達組和低表達組，轉(zhuǎn)染48 h后，RT-PCR法檢測各組細胞miRNA-137的相對表達量。實驗重復(fù)3次。

1.2.3 Transwell小室檢測細胞的遷移和侵襲能力將基質(zhì)膠加入到24孔的Transwell小室中，加入驅(qū)化劑。取空白組、過表達組和低表達組的細胞加入Transwell小室，培養(yǎng)24 h后取出，擦除沒有穿膜的細胞。采用0.1%的結(jié)晶紫對通過小室濾膜的細胞進行染色，再漂洗、固定，在顯微鏡下隨機選取5個視野計數(shù)3組膀胱癌T24細胞的遷移和侵襲數(shù)目。實驗重復(fù)3次。

1.3 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 20.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。正態(tài)分布計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，兩組間比較采用兩獨立樣本t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，多組間兩兩比較采用LSD-t檢驗；相關(guān)分析采用Spearman相關(guān)分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 膀胱癌組織和癌旁組織中miRNA-137相對表達量的比較

浸潤性膀胱癌組織中miRNA-137的相對表達量為（2.87±0.21），明顯高于非浸潤性膀胱癌組織的（1.12±0.19）和癌旁組織的（1.00±0.13），差異均有統(tǒng)計學意義（t=33.85、41.47，P＜0.01）；但非浸潤性膀胱癌組織和癌旁組織中miRNA-137的相對表達量比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

2.2 膀胱癌組織中miRNA-137的相對表達量與膀胱癌患者病理分級的關(guān)系

病理分級為Ⅳ級的膀胱癌患者膀胱癌組織中miRNA-137的相對表達量均明顯高于病理分級為Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ級的患者，差異均有統(tǒng)計學意義（t=8.16、14.91、22.30，P＜0.01）（表1）。Spearman相關(guān)分析顯示，miRNA-137的相對表達量與膀胱癌患者病理分級呈明顯正相關(guān)（r=6.528，P＜0.01）。

表1 不同病理分級膀-胱癌患者膀胱癌組織中miRNA-137的相對表達量（±s）

表1 不同病理分級膀-胱癌患者膀胱癌組織中miRNA-137的相對表達量（±s）

病理分級Ⅰ（n=11）Ⅱ（n=8）Ⅲ（n=7）Ⅳ（n=4）1.326±0.14 1.942±0.19 2.617±0.23 3.582±0.29 miRNA-137的相對表達量

2.3 過表達組、空白組和低表達組膀胱癌T24細胞中miRNA-137相對表達量的比較

將過表達組、空白組和低表達組膀胱癌T24細胞轉(zhuǎn)染48 h后，RT-PCR法檢測3組細胞miRNA-137的相對表達量，結(jié)果顯示，過表達組細胞miRNA-137的相對表達量為（5.65±0.36），明顯高于空白組的（2.26±0.13），差異有統(tǒng)計學意義（t=48.51，P＜0.01）；且低表達組細胞miRNA-137的相對表達量為（0.43±0.02），明顯低于空白組細胞，差異有統(tǒng)計學意義（t=76.21，P＜0.01）。

2.4 過表達組、空白組和低表達組膀胱癌T24細胞侵襲能力的比較

采用Transwell小室檢測3組遷移和侵襲細胞數(shù)目，結(jié)果顯示，過表達組遷移和侵襲細胞數(shù)目均高于空白組細胞，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；低表達組遷移和侵襲細胞數(shù)目均低于空白組細胞，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。（表2）

表2 過表達組、空白組和-低表達組膀胱癌T24細胞遷移和侵襲數(shù)目的比較（±s）

表2 過表達組、空白組和-低表達組膀胱癌T24細胞遷移和侵襲數(shù)目的比較（±s）

注：*與空白組比較，P<0.05

組別低表達組空白組過表達組遷移細胞數(shù)102±13*166±21 241±28*侵襲細胞數(shù)63±9*119±16 202±19*

3 討論

目前，手術(shù)切除仍然是膀胱癌的主要治療手段，但術(shù)后復(fù)發(fā)率較高，預(yù)后較差[7-8]。早診斷、早治療可明顯提高膀胱癌患者的生存率，有效避免局部復(fù)發(fā)和遠處轉(zhuǎn)移，是改善膀胱癌患者預(yù)后的關(guān)鍵。研究顯示，miRNA可在多種惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮調(diào)節(jié)作用[9-11]。

miRNA-137最早是在胃癌、惡性膠質(zhì)瘤和乳腺癌中發(fā)現(xiàn)，隨后，卵巢癌、肺癌、直腸癌和神經(jīng)膠質(zhì)瘤中亦發(fā)現(xiàn)miRNA-137具有抑制腫瘤發(fā)生發(fā)展的作用，但具體的作用機制仍不明確[12-14]。Shimizu等[6]研究結(jié)果顯示，膀胱癌患者腫瘤組織中可檢測到miRNA-137的表達，且miRNA-137大多以甲基化形式存在，并存在異位表達，但仍需進一步探討miRNA-137在膀胱癌中的具體作用機制。本研究采用RT-PCR法檢測膀胱癌組織和癌旁組織中miRNA-137的相對表達量，結(jié)果顯示，浸潤性膀胱癌組織中miRNA-137的相對表達量明顯高于非浸潤性膀胱癌組織，表明miRNA-137可能與膀胱癌的侵襲和遷移有關(guān)。本研究比較不同病理分級膀胱癌患者的膀胱癌組織中miRNA-137的相對表達量，并進行Spearman相關(guān)分析，結(jié)果顯示，病理分級為Ⅳ級的膀胱癌患者miRNA-137的相對表達量最高，且miRNA-137的相對表達量與膀胱癌患者病理分級呈明顯正相關(guān)，表明miRNA-137的表達可能與膀胱癌的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。此外，過表達組、空白組和低表達組膀胱癌T24細胞的遷移和侵襲細胞數(shù)目均高于空白組細胞，而低表達組遷移和侵襲細胞數(shù)目均低于空白對照組細胞，表明miRNA-137的相對表達量可能與膀胱癌細胞的侵襲和遷移能力有關(guān)，miRNA-137表達上調(diào)可以提高膀胱癌細胞的侵襲和遷移能力，抑制miRNA-137的表達可以抑制膀胱癌細胞的侵襲和遷移能力。

綜上所述，浸潤性膀胱癌組織和病理分級為Ⅳ級的膀胱癌組織中miRNA-137的相對表達量較高，上調(diào)miRNA-137的表達可以促進膀胱癌細胞侵襲和遷移能力，抑制其表達可以抑制膀胱癌細胞的侵襲和遷移能力。