林學(xué)勇，李東

上海市嘉定區(qū)安亭醫(yī)院外科，上海 201805

膀胱癌好發(fā)于老年男性，發(fā)病率一直居高不下。膀胱癌是世界第四大最常見(jiàn)腫瘤，也是中國(guó)最常見(jiàn)的泌尿生殖系統(tǒng)惡性腫瘤，嚴(yán)重影響患者的生命健康[1]。目前，手術(shù)治療仍然是膀胱癌的主要治療方法，但術(shù)后易復(fù)發(fā)。微小RNA（microRNA，miRNA）是一類(lèi)含有19～22個(gè)核苷酸的內(nèi)源性非編碼RNA，通過(guò)誘導(dǎo)目的基因的信使RNA（messenger RNA，mRNA）降解，從而抑制目的蛋白的表達(dá)，對(duì)原癌基因和抑癌基因均具有調(diào)節(jié)作用。研究表明，miRNA在腫瘤細(xì)胞的增殖、分化和凋亡等基本生物過(guò)程中發(fā)揮重要作用，胃癌、淋巴瘤、乳腺癌、肺癌、結(jié)腸癌和肝癌等惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展中也可檢測(cè)到miRNA的突變和異常調(diào)節(jié)[1-2]。研究顯示，miRNA-137可抑制惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展，其在卵巢癌、胃癌、惡性膠質(zhì)瘤、結(jié)直腸癌和成神經(jīng)細(xì)胞瘤中表達(dá)下調(diào)[3-5]。Shim izu等[6]研究發(fā)現(xiàn)，miRNA-137在膀胱原發(fā)性腫瘤中呈甲基化狀態(tài)，與腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)過(guò)程息息相關(guān)。本研究探討miRNA-137在膀胱癌中的表達(dá)情況及其對(duì)膀胱癌細(xì)胞侵襲和遷移能力的影響，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本收集

選取2015年1月至2017年1月上海市嘉定區(qū)安亭醫(yī)院收治的膀胱癌患者。納入標(biāo)準(zhǔn)：①術(shù)后病理活檢證實(shí)為膀胱癌；②術(shù)前均未接受任何放化療等其他治療。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并心、肝、腎等主要器官病變的患者；②膀胱癌復(fù)發(fā)患者。依據(jù)納入和排除標(biāo)準(zhǔn)，共納入30例膀胱癌患者，其中男16例，女14例；年齡44～78歲，平均年齡為（64.0±5.7）歲；浸潤(rùn)性膀胱癌12例，非浸潤(rùn)性膀胱癌18例；世界衛(wèi)生組織（WHO）/國(guó)際泌尿病理協(xié)會(huì)（International Society of Urological Pathology，ISUP）病理分級(jí)：Ⅰ級(jí)11例，Ⅱ級(jí)8例，Ⅲ級(jí)7例，Ⅳ級(jí)4例。取30例膀胱癌患者的膀胱癌組織和癌旁組織標(biāo)本，癌旁組織取自膀胱癌患者腫瘤組織＞5 cm處的正常組織。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 RT-PCR檢測(cè)miRNA-137的相對(duì)表達(dá)量采用實(shí)時(shí)定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR）試劑盒檢測(cè)膀胱癌組織和癌旁組織中的miRNA-137的相對(duì)表達(dá)量，Trizol法提取膀胱癌組織和癌旁組織中的總RNA。擴(kuò)增條件：95℃預(yù)變性5 min進(jìn)入循環(huán)，95℃變性45 s，54℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，共30個(gè)循環(huán)，72℃最終延伸5 min。以U6作為內(nèi)參，2-ΔΔCt法計(jì)算miRNA-137的相對(duì)表達(dá)量。miRNA-137正向引物：5'-GCGCGCTTATTGCTTAAGAATAC-3'，反向引物：5'-CGGCCCAGTGTTCAGACTAC-3'；U 6 正向引物：5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3'，反向引物：5'-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3'。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染方法 取本實(shí)驗(yàn)室保存的膀胱癌T24細(xì)胞株，采用含10%胎牛血清的RPM I 1640培養(yǎng)基，放置于含5%CO2、37℃的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，以3×105/ml的濃度接種于24孔板，待細(xì)胞融合度為70%～80%時(shí)，在脂質(zhì)體LipofectamineTM2000的介導(dǎo)下將m im ic-NC、miRNA-137 m im ic、miRNA-137 inhibitor質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至膀胱癌T24細(xì)胞，并分別作為空白組、高表達(dá)組和低表達(dá)組，轉(zhuǎn)染48 h后，RT-PCR法檢測(cè)各組細(xì)胞miRNA-137的相對(duì)表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.3 Transwell小室檢測(cè)細(xì)胞的遷移和侵襲能力將基質(zhì)膠加入到24孔的Transwell小室中，加入驅(qū)化劑。取空白組、過(guò)表達(dá)組和低表達(dá)組的細(xì)胞加入Transwell小室，培養(yǎng)24 h后取出，擦除沒(méi)有穿膜的細(xì)胞。采用0.1%的結(jié)晶紫對(duì)通過(guò)小室濾膜的細(xì)胞進(jìn)行染色，再漂洗、固定，在顯微鏡下隨機(jī)選取5個(gè)視野計(jì)數(shù)3組膀胱癌T24細(xì)胞的遷移和侵襲數(shù)目。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 20.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。正態(tài)分布計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，兩組間比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，多組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)；相關(guān)分析采用Spearman相關(guān)分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 膀胱癌組織和癌旁組織中miRNA-137相對(duì)表達(dá)量的比較

浸潤(rùn)性膀胱癌組織中miRNA-137的相對(duì)表達(dá)量為（2.87±0.21），明顯高于非浸潤(rùn)性膀胱癌組織的（1.12±0.19）和癌旁組織的（1.00±0.13），差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=33.85、41.47，P＜0.01）；但非浸潤(rùn)性膀胱癌組織和癌旁組織中miRNA-137的相對(duì)表達(dá)量比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

2.2 膀胱癌組織中miRNA-137的相對(duì)表達(dá)量與膀胱癌患者病理分級(jí)的關(guān)系

病理分級(jí)為Ⅳ級(jí)的膀胱癌患者膀胱癌組織中miRNA-137的相對(duì)表達(dá)量均明顯高于病理分級(jí)為Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ級(jí)的患者，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=8.16、14.91、22.30，P＜0.01）（表1）。Spearman相關(guān)分析顯示，miRNA-137的相對(duì)表達(dá)量與膀胱癌患者病理分級(jí)呈明顯正相關(guān)（r=6.528，P＜0.01）。

表1 不同病理分級(jí)膀-胱癌患者膀胱癌組織中miRNA-137的相對(duì)表達(dá)量（±s）

表1 不同病理分級(jí)膀-胱癌患者膀胱癌組織中miRNA-137的相對(duì)表達(dá)量（±s）

病理分級(jí)Ⅰ（n=11）Ⅱ（n=8）Ⅲ（n=7）Ⅳ（n=4）1.326±0.14 1.942±0.19 2.617±0.23 3.582±0.29 miRNA-137的相對(duì)表達(dá)量

2.3 過(guò)表達(dá)組、空白組和低表達(dá)組膀胱癌T24細(xì)胞中miRNA-137相對(duì)表達(dá)量的比較

將過(guò)表達(dá)組、空白組和低表達(dá)組膀胱癌T24細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h后，RT-PCR法檢測(cè)3組細(xì)胞miRNA-137的相對(duì)表達(dá)量，結(jié)果顯示，過(guò)表達(dá)組細(xì)胞miRNA-137的相對(duì)表達(dá)量為（5.65±0.36），明顯高于空白組的（2.26±0.13），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=48.51，P＜0.01）；且低表達(dá)組細(xì)胞miRNA-137的相對(duì)表達(dá)量為（0.43±0.02），明顯低于空白組細(xì)胞，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=76.21，P＜0.01）。

2.4 過(guò)表達(dá)組、空白組和低表達(dá)組膀胱癌T24細(xì)胞侵襲能力的比較

采用Transwell小室檢測(cè)3組遷移和侵襲細(xì)胞數(shù)目，結(jié)果顯示，過(guò)表達(dá)組遷移和侵襲細(xì)胞數(shù)目均高于空白組細(xì)胞，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；低表達(dá)組遷移和侵襲細(xì)胞數(shù)目均低于空白組細(xì)胞，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。（表2）

表2 過(guò)表達(dá)組、空白組和-低表達(dá)組膀胱癌T24細(xì)胞遷移和侵襲數(shù)目的比較（±s）

表2 過(guò)表達(dá)組、空白組和-低表達(dá)組膀胱癌T24細(xì)胞遷移和侵襲數(shù)目的比較（±s）

注：*與空白組比較，P<0.05

組別低表達(dá)組空白組過(guò)表達(dá)組遷移細(xì)胞數(shù)102±13*166±21 241±28*侵襲細(xì)胞數(shù)63±9*119±16 202±19*

3 討論

目前，手術(shù)切除仍然是膀胱癌的主要治療手段，但術(shù)后復(fù)發(fā)率較高，預(yù)后較差[7-8]。早診斷、早治療可明顯提高膀胱癌患者的生存率，有效避免局部復(fù)發(fā)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，是改善膀胱癌患者預(yù)后的關(guān)鍵。研究顯示，miRNA可在多種惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮調(diào)節(jié)作用[9-11]。

miRNA-137最早是在胃癌、惡性膠質(zhì)瘤和乳腺癌中發(fā)現(xiàn)，隨后，卵巢癌、肺癌、直腸癌和神經(jīng)膠質(zhì)瘤中亦發(fā)現(xiàn)miRNA-137具有抑制腫瘤發(fā)生發(fā)展的作用，但具體的作用機(jī)制仍不明確[12-14]。Shimizu等[6]研究結(jié)果顯示，膀胱癌患者腫瘤組織中可檢測(cè)到miRNA-137的表達(dá)，且miRNA-137大多以甲基化形式存在，并存在異位表達(dá)，但仍需進(jìn)一步探討miRNA-137在膀胱癌中的具體作用機(jī)制。本研究采用RT-PCR法檢測(cè)膀胱癌組織和癌旁組織中miRNA-137的相對(duì)表達(dá)量，結(jié)果顯示，浸潤(rùn)性膀胱癌組織中miRNA-137的相對(duì)表達(dá)量明顯高于非浸潤(rùn)性膀胱癌組織，表明miRNA-137可能與膀胱癌的侵襲和遷移有關(guān)。本研究比較不同病理分級(jí)膀胱癌患者的膀胱癌組織中miRNA-137的相對(duì)表達(dá)量，并進(jìn)行Spearman相關(guān)分析，結(jié)果顯示，病理分級(jí)為Ⅳ級(jí)的膀胱癌患者miRNA-137的相對(duì)表達(dá)量最高，且miRNA-137的相對(duì)表達(dá)量與膀胱癌患者病理分級(jí)呈明顯正相關(guān)，表明miRNA-137的表達(dá)可能與膀胱癌的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。此外，過(guò)表達(dá)組、空白組和低表達(dá)組膀胱癌T24細(xì)胞的遷移和侵襲細(xì)胞數(shù)目均高于空白組細(xì)胞，而低表達(dá)組遷移和侵襲細(xì)胞數(shù)目均低于空白對(duì)照組細(xì)胞，表明miRNA-137的相對(duì)表達(dá)量可能與膀胱癌細(xì)胞的侵襲和遷移能力有關(guān)，miRNA-137表達(dá)上調(diào)可以提高膀胱癌細(xì)胞的侵襲和遷移能力，抑制miRNA-137的表達(dá)可以抑制膀胱癌細(xì)胞的侵襲和遷移能力。

綜上所述，浸潤(rùn)性膀胱癌組織和病理分級(jí)為Ⅳ級(jí)的膀胱癌組織中miRNA-137的相對(duì)表達(dá)量較高，上調(diào)miRNA-137的表達(dá)可以促進(jìn)膀胱癌細(xì)胞侵襲和遷移能力，抑制其表達(dá)可以抑制膀胱癌細(xì)胞的侵襲和遷移能力。