劉祿，楊娜，劉智

遂寧市中心醫(yī)院1病理科，2檢驗(yàn)科，四川 遂寧 629000

宮頸上皮內(nèi)瘤變（cervical intraepithelial neoplasia，CIN）是一組與宮頸浸潤(rùn)癌密切相關(guān)的特異性癌前病變，常提示正常宮頸上皮組織發(fā)展為宮頸浸潤(rùn)癌的過(guò)程。從宮頸癌前病變發(fā)展為宮頸癌需要約10年時(shí)間，而85%的CINⅢ級(jí)病變最終發(fā)展為宮頸浸潤(rùn)癌[1]。如能早期發(fā)現(xiàn)癌前病變，并在癌前病變階段就進(jìn)行醫(yī)學(xué)干預(yù)，可明顯提高宮頸癌的治愈率。目前，宮頸薄層液基細(xì)胞學(xué)檢測(cè)（thinprep liquid-based cytology test，TCT）是篩查CIN及宮頸癌的主要方法之一，但TCT方法存在諸多缺陷，如受主觀因素的影響較大、靈敏度較低等。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)子宮頸TCT結(jié)果為陰性，而組織活檢結(jié)果為CIN，導(dǎo)致臨床細(xì)胞學(xué)診斷結(jié)果為假陰性[2-3]。因此，提高CIN的檢出率顯得尤為重要。人乳頭瘤病毒（human papilloma virus，HPV）感染是宮頸癌和CIN發(fā)生的重要危險(xiǎn)因素[4]，持續(xù)感染高危型HPV與宮頸癌的發(fā)病密切相關(guān)。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)近130種HPV亞型，其中，單一感染HPV高危亞型主要為HPV16、18、26、31、33、35、39、45、52、56、58、59、66、68、82，這15種HPV高危亞型主要引起CINⅡ～Ⅲ級(jí)病變以及宮頸癌的發(fā)生[5]。中國(guó)不同區(qū)域的宮頸高度病變及宮頸癌多以感染高危型HPV16和HPV18為主[6]。本研究探索TCT陰性的CINⅢ級(jí)病變患者的HPV感染情況和感染亞型特點(diǎn)，以輔助宮頸癌前病變的篩查，降低假陽(yáng)性率，同時(shí)為HPV疫苗接種提供一定的參考依據(jù)，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象

選取2015年7月至2016年6月于遂寧市中心醫(yī)院診治的100例TCT檢測(cè)結(jié)果為陰性且經(jīng)陰道鏡活檢判定為CINⅢ級(jí)的患者為研究組。TCT檢測(cè)時(shí)，使用特定的宮頸刷，按照相關(guān)操作規(guī)程在宮頸管和宮頸口旋轉(zhuǎn)數(shù)圈，將收集的宮頸脫落細(xì)胞送往病理科進(jìn)行檢測(cè)。陰道鏡活檢在電子陰道鏡引導(dǎo)下，多點(diǎn)采樣。納入標(biāo)準(zhǔn)：①無(wú)宮頸側(cè)切或?qū)m頸全切病史；②距離研究開(kāi)始的1個(gè)月內(nèi)未進(jìn)行宮頸病變相關(guān)的藥物治療；③采樣及活檢前3天未使用陰道內(nèi)藥物；④均有性生活史，且采樣前3天未發(fā)生過(guò)性行為。排除標(biāo)準(zhǔn)：①妊娠期或者哺乳期婦女；②存在急性生殖道炎癥；③近期內(nèi)使用過(guò)性激素；④依從性差，不配合本研究。研究組患者的年齡為25～60歲，平均年齡為（38.89±4.31）歲；漢族75例，其他民族25例；有服藥史92例，無(wú)服藥史8例。同期另選取100例子宮頸浸潤(rùn)性鱗狀細(xì)胞癌（squemous cell carcinoma，SCC）患者為對(duì)照組。對(duì)照組患者的年齡為23～62歲，平均年齡為（39.15±3.90）歲；漢族80例，其他民族20例；有服藥史87例，無(wú)服藥史13例。兩組患者的年齡、民族和服藥史比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性。所有患者均對(duì)本研究知情同意并簽署知情同意書(shū)，且本研究經(jīng)過(guò)本院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審核通過(guò)（L/SCSN-L023）。收集兩組患者的石蠟包埋病灶組織。

1.2 儀器與試劑

Bioer Life-Express PCR擴(kuò)增儀由博日科技有限公司提供，生物恒溫雜交儀、DNA提取試劑和HPV基因分型檢測(cè)試劑均由深圳亞能生物有限公司提供。

1.3 HPV-DNA提取

無(wú)菌棉拭子插入被檢查者宮頸口，勻速用力旋轉(zhuǎn)5周后取出，置于試管中。HPV DNA采用單管多重聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）-反向點(diǎn)雜交（reverse dot blot，RDB）技術(shù)檢測(cè)。單管PCR反應(yīng)管中含有21種特異性引物，可以同時(shí)擴(kuò)增21種HPV基因型的目的片段，再將擴(kuò)增產(chǎn)物與固定在膜條上的分型探針進(jìn)行雜交，依據(jù)雜交信號(hào)的有無(wú)來(lái)判斷有無(wú)HPV DNA的存在。

1.4 HPV分型檢測(cè)

1.4.1 片段擴(kuò)增 將無(wú)核水、PCR M ix、Taq酶、特異性引物與DNA樣本充分混勻，制備成25μl的反應(yīng)體系。PCR反應(yīng)條件：預(yù)變性95℃5 s；變性95℃ 20 s，退火55℃ 30 s，延伸72℃ 20 s，共進(jìn)行40個(gè)循環(huán)。嚴(yán)格按照標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程（standard operation procedure，SOP）進(jìn)行操作。

1.4.2 導(dǎo)流雜交 將PCR產(chǎn)物加熱變性，之后冰上冷卻10 min。將含有特定核酸探針的薄膜固定在生物恒溫雜交儀上，生物恒溫雜交儀溫度控制溫度為45℃，將冷卻后的PCR產(chǎn)物置于薄膜上，使其流入膜內(nèi)進(jìn)行雜交反應(yīng)，同時(shí)除去未結(jié)合的DNA。

1.4.3 結(jié)果判讀 將導(dǎo)流雜交的PCR產(chǎn)物加封閉液孵育5 min，重復(fù)2次并用封阻膜進(jìn)行封阻。除去封閉液，加入酶標(biāo)液后于25℃孵育3～4 min。采用緩沖液清洗掉多余的酶標(biāo)液，加入底物顯色5 min，并于1 h內(nèi)判讀顯色結(jié)果，紫色實(shí)心點(diǎn)即為HPV對(duì)應(yīng)亞型陽(yáng)性。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 19.0軟件對(duì)數(shù)-據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以例數(shù)和率（%）表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HPV感染情況的比較

研究組中29例患者發(fā)生HPV感染，對(duì)照組中78例患者發(fā)生HPV感染。研究組患者HPV的總感染率為29.0%（29/100），明顯低于對(duì)照組患者的78.0%（78/100），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=48.256，P＜0.01）。兩組HPV陽(yáng)性患者中均是單一感染所占比例最高，二重感染所占比例次之，三重感染所占比例和四重感染所占比例最低。研究組與對(duì)照組HPV陽(yáng)性患者的上述各感染所占比例比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。（表1）

表1 兩組HPV陽(yáng)性患者HPV感染情況的比較[n（%）]

2.2 兩組HPV陽(yáng)性患者基線特征的比較

兩組HPV陽(yáng)性患者的年齡、民族、性生活史、婚姻狀況、職業(yè)比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。（表2）

表2 兩組HPV陽(yáng)性患者基線特征的比較

2.3 HPV高危亞型感染情況的比較

研究組與對(duì)照組HPV陽(yáng)性患者中HPV16、HPV58、HPV52、HPV33和HPV18高危亞型的感染情況比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。（表3）

表3 兩組HPV陽(yáng)性患者HPV高危亞型的感染情況

3 討論

隨著病毒的變異和女性社交觀念的改變，宮頸癌是中國(guó)女性婦科腫瘤中的高發(fā)疾病。由于宮頸癌的早期篩查在臨床上應(yīng)用廣泛，因此，近年來(lái)宮頸癌的發(fā)病率和病死率有所下降。CIN是宮頸癌的特異性癌前病變，能夠預(yù)示宮頸癌的發(fā)生，同時(shí)盡早地對(duì)CIN進(jìn)行干預(yù)能夠逆轉(zhuǎn)宮頸癌的發(fā)生[7]。因此，早期診斷對(duì)于預(yù)防宮頸癌的發(fā)生，降低宮頸癌的發(fā)病率和病死率具有重要意義。TCT檢測(cè)是目前臨床上應(yīng)用最廣泛的宮頸癌篩查方式，能夠通過(guò)鏡檢發(fā)現(xiàn)癌前病變細(xì)胞，區(qū)分炎癥與感染[8-9]。但有文獻(xiàn)報(bào)道，TCT檢測(cè)對(duì)于CINⅢ級(jí)病變的檢出率不高，具有較高的假陽(yáng)性率，可達(dá)49.60%[10]。因此，僅依靠TCT檢測(cè)難以達(dá)到早期篩查宮頸癌的作用。高危型HPV持續(xù)感染是宮頸癌發(fā)病的最主要的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。國(guó)內(nèi)外多篇文獻(xiàn)報(bào)道TCT檢測(cè)聯(lián)合HPV亞型檢測(cè)能夠提高宮頸癌的早期診斷率[11-13]。因此，本研究探討了TCT陰性的CINⅢ級(jí)患者HPV感染情況及感染亞型特點(diǎn)。

Xu等[6]分析了30 165例中國(guó)女性HPV陽(yáng)性的宮頸癌標(biāo)本，發(fā)現(xiàn)高危型HPV16感染是導(dǎo)致中國(guó)宮頸癌發(fā)生的最優(yōu)勢(shì)型別，HPV18、HPV52、HPV58在中國(guó)西部地區(qū)的感染率相對(duì)較高。本研究探究了TCT檢測(cè)結(jié)果為陰性的CINⅢ級(jí)患者感染HPV病毒亞型的特點(diǎn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，TCT陰性的CINⅢ級(jí)患者HPV的感染率為29.0%，其中，TCT陰性的CINⅢ級(jí)患者的HPV感染亞型以高危型HPV16為主，提示TCT陰性CINⅢ級(jí)漏檢HPV16的可能性更大。同時(shí)，HPV16的基因多態(tài)性較高，E7的高度突變對(duì)瘤變細(xì)胞的內(nèi)在生物代謝具有重要的影響，進(jìn)而在CINⅢ級(jí)和宮頸癌的發(fā)生中發(fā)揮著重要的作用[14]，而這些改變?cè)诩?xì)胞形態(tài)學(xué)方面的差異難以被發(fā)現(xiàn)。其他高危型HPV依次為HPV58、HPV52、HPV33、HPV18，這與Xu等[6]的研究結(jié)果相符。HPV18在中國(guó)西南部地區(qū)的感染率僅次于HPV16，但本研究中TCT陰性的CINⅢ級(jí)患者HPV18的感染比例較低，提示TCT陰性CINⅢ級(jí)患者不易漏檢HPV18。因此，HPV16基因的高突變可能是引起TCT陰性的原因。進(jìn)一步提示TCT陰性患者仍有存在HPV感染的風(fēng)險(xiǎn)，因此，應(yīng)聯(lián)合使用TCT與HPV亞型檢測(cè)，以進(jìn)一步降低CINⅢ級(jí)患者的漏檢率。

近年來(lái)，許多HPV病毒多態(tài)性新位點(diǎn)被發(fā)現(xiàn)[14-16]。病毒多態(tài)性的產(chǎn)生原因可能是由于機(jī)體自身免疫系統(tǒng)對(duì)病毒的自然選擇，也可能是來(lái)源于多重感染過(guò)程中病毒的相互競(jìng)爭(zhēng)。本研究發(fā)現(xiàn)TCT陰性的CINⅢ級(jí)患者的HPV感染以單一亞型感染為主，而HPV16亞型感染是單一亞型感染的主體，這與以往關(guān)于CINⅢ級(jí)患者HPV感染情況的報(bào)道結(jié)果類似[17]。在TCT陰性的CINⅢ級(jí)患者的HPV多重感染中，主要以二重感染為主，其中，HPV16聯(lián)合其他亞型感染是二重感染的主要特點(diǎn)。上述結(jié)果提示HPV16可能通過(guò)某種途徑誘發(fā)CIN形成，但TCT出現(xiàn)假陰性。

綜上所述，TCT陰性的CINⅢ級(jí)患者的HPV感染以單一亞型感染為主，HPV16單一感染或聯(lián)合其他亞型的多重感染是TCT陰性的CINⅢ級(jí)患者的主要特點(diǎn)，并推測(cè)HPV16可能因其具有病毒多態(tài)性而誘發(fā)CINⅢ級(jí)及宮頸癌的發(fā)生，造成了TCT檢測(cè)的漏診。盡管本研究發(fā)現(xiàn)了CINⅢ級(jí)患者的主要HPV感染亞型，但仍有不足之處，如本研究未明確不同HPV分型對(duì)CINⅢ級(jí)發(fā)生和發(fā)展的誘導(dǎo)機(jī)制，仍需進(jìn)一步分析與探討，才能有效地預(yù)防、診斷及治療CINⅢ級(jí)，可將其作為下一步的研究方向。本研究提示臨床上應(yīng)更加關(guān)注TCT檢測(cè)聯(lián)合HPV亞型檢測(cè)對(duì)CINⅢ級(jí)及宮頸癌的早期診斷，尤其應(yīng)該注重HPV16亞型感染的早期預(yù)防和早期診斷。