吳岑，鄭志雄，黃志揚，伍伯聰，呂聯(lián)輝，張巍，張文彬

福建醫(yī)科大學(xué)附屬泉州第一醫(yī)院/泉州市第一醫(yī)院泌尿外科，福建 泉州 362000

膀胱癌是泌尿系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤，具有惡性程度高、復(fù)發(fā)率高、病死率高等特點，其中遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移是造成膀胱癌患者死亡的主要原因，近年來其總體發(fā)病率和病死率均呈逐年上升趨勢[1]。研究發(fā)現(xiàn)，約30%的早期膀胱癌可發(fā)生轉(zhuǎn)移，近50%的肌層浸潤性膀胱癌確診時已存在微轉(zhuǎn)移灶[2]。循環(huán)腫瘤細(xì)胞（circulating tumor cell，CTC）是能夠逃避免疫監(jiān)視進入外周血中的存活的腫瘤細(xì)胞[3]，與腫瘤的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，是腫瘤進行血行轉(zhuǎn)移的前提[4]。作為一種重要的中間轉(zhuǎn)移過程，CTC可以反映膀胱癌實時轉(zhuǎn)移狀態(tài)，檢測外周血中的CTC對判斷發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的風(fēng)險、預(yù)后及選擇治療手段等具有重要意義[5]。目前國內(nèi)外關(guān)于膀胱癌CTC的研究均處于起始階段。本研究擬選擇CTC免疫芯片分選法檢測膀胱癌患者外周血中的CTC，研究其在膀胱癌復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移早期監(jiān)測、療效評價及預(yù)后判斷等方面的意義。

1 對象與方法

1.1 研究對象

選取2016年1月至2017年6月在福建醫(yī)科大學(xué)附屬泉州第一醫(yī)院泌尿外科首診的87例膀胱癌患者作為研究對象。納入標(biāo)準(zhǔn)：①經(jīng)術(shù)后病理確診為膀胱癌，其中非肌層浸潤性膀胱癌為中、高危患者；②美國麻醉醫(yī)師協(xié)會（American Society of Anesthesiologists，ASA）術(shù)前分級≤Ⅲ級。排除標(biāo)準(zhǔn)：①不能耐受全部4個療程的化療而中途退出者；②因其他原因放棄治療或轉(zhuǎn)院者。根據(jù)腫瘤浸潤深度將87例膀胱癌患者進一步分為非肌層浸潤組（55例）和肌層浸潤組（32例），另選取40例膀胱良性病變患者設(shè)為對照組，3組患者的基線特征比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）（表1），具有可比性。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會審核批準(zhǔn)，且所有研究對象均簽署了知情同意書。

表1 3組患者的基線特征

1.2 治療方案

膀胱癌患者參考《中國泌尿外科疾病診斷治療指南（2014版）》[6]進行治療：非肌層浸潤組患者采用經(jīng)尿道膀胱腫瘤電切術(shù)聯(lián)合吡柔比星膀胱灌注，吡柔比星溶于5%葡萄糖溶液，濃度500～1000μg/ml，注入膀胱內(nèi)保持1～2 h，每周1次，共8周，之后維持灌注，每月1次，維持8個月。肌層浸潤組患者采用根治性膀胱切除術(shù)+尿流改道+淋巴結(jié)清掃術(shù)，術(shù)后采用吉西他濱+順鉑（GC）方案化療，第1、8、15天給予吉西他濱1000 mg/m2，第2天給予順鉑70 mg/m2，每28天為一個療程，共4個療程。治療過程中監(jiān)測患者血常規(guī)和肝腎功能。

1.3 CTC檢測

1.3.1 樣本采集 分別在3組患者接受治療前、非肌層浸潤組患者和肌層浸潤組患者治療后每4周后抽取患者外周血5～8 ml，注意棄去前2 ml血液，以免混入表皮細(xì)胞導(dǎo)致假陽性，0～4℃枸櫞酸鹽抗凝劑下保存，24 h內(nèi)送檢。

1.3.2 CTC分離和染色 ①密度梯度離心：用磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）將抗凝全血稀釋50%，取50 ml無菌離心管加入20 ml Ficoll細(xì)胞分離液，再沿管壁緩慢注入稀釋全血，室溫下1200 r/min離心15 min。棄除上層的血漿和PBS混合液，將單個核細(xì)胞層傾倒至另一50 ml無菌離心管中，再加入20 ml PBS重新混勻，4℃400 r/min離心10 min，棄上清。②孵育捕獲抗體：加入4～5滴PBS重懸細(xì)胞，混勻后倒入1.5 ml無菌離心管。加入兔抗人上皮細(xì)胞黏附分子（epithelial cell adhesion molecule，EpCAM）抗體，室溫孵育1 h后，加入800μl PBS輕柔混勻，400 r/min離心5 min，棄上清，再加入200μl PBS重懸細(xì)胞。③CTC分離：將上一步獲得的細(xì)胞懸液注入EpCAM芯片進行細(xì)胞分離，流速為200μl/h。④免疫染色：將芯片拆開置于平皿上，依次用固定劑和透膜劑各處理15 min，然后加入CK8/18/19和CD45一抗，4℃避光孵育24 h。然后用PBS泡洗芯片3次，每次5 min。再加入Alexa488、Alexa555和Hochest33342標(biāo)記的二抗，室溫避光孵育40 min，加入4'，6-二脒基-2-苯基吲哚進行核染色，保持20 min。最后用PBS泡洗3次，每次5 min。

1.3.3 芯片鏡檢、鑒定及計數(shù) 在400倍高倍鏡下觀察芯片上捕獲的細(xì)胞，計算CTC陽性細(xì)胞數(shù)。

1.4 隨訪

治療1年內(nèi)，對所有患者進行每月1次的電話隨訪。非肌層浸潤組患者出院后3個月復(fù)查1次膀胱鏡，肌層浸潤組患者每3個月門診隨訪，每6個月復(fù)查腹部及盆腔CT，計算復(fù)發(fā)率。

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 21.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)-據(jù)分析，正態(tài)分布的計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用t檢驗，連續(xù)測量數(shù)據(jù)比較采用重復(fù)測量方差分析；計數(shù)資料以例數(shù)及率（%）表示，組間比較采用χ2檢驗或Fisher精確概率法，有序分類變量采用秩和檢驗；以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 治療前CTC檢出數(shù)的比較

治療前，對照組患者外周血中未檢出CTC，非肌層浸潤組患者CTC檢出數(shù)為（9.38±11.35）/10 ml，明顯少于肌層浸潤組患者的（23.28±11.74）/10 ml，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=5.439，P＜0.01）。將CTC按數(shù)量分層，非肌層浸潤組與肌層浸潤組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（Z=4.725，P＜0.01）（表2）。

2.2 治療前及治療過程中CTC檢出數(shù)的比較

治療過程中非肌層浸潤組和肌層浸潤組患者CTC檢出數(shù)均逐漸減少，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。（表3）

表2 治療前兩組膀胱癌患者的CTC檢出情況[n（%）]

表3 治療前及治療-過程中兩組膀胱癌患者CTC檢出數(shù)的比較（/10 ml，±s）

表3 治療前及治療-過程中兩組膀胱癌患者CTC檢出數(shù)的比較（/10 ml，±s）

時間治療前第1個療程后第2個療程后第3個療程后第4個療程后F值P值9.38±11.35 6.51±8.31 5.69±7.58 4.55±6.37 2.53±4.33 32.515 0.000 23.28±11.74 17.16±10.13 12.31±12.07 6.88±12.53 4.06±9.59 98.337 0.000非肌層浸潤組（n=55） 肌層浸潤組（n=32）

2.3 復(fù)發(fā)情況的比較

未檢出CTC的非肌層浸潤組患者1年復(fù)發(fā)率為8.00%（2/25），低于檢出CTC的非肌層浸潤組患者的 53.33%（16/30），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=12.729，P＜0.05）；CTC檢出數(shù)為（0～20）/10 ml及≥21/10 ml的肌層浸潤組患者的1年復(fù)發(fā)率分別為53.85%（7/13）與68.42%（13/19），差異無統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=0.216，P＞0.05）。

3 討論

外周血中CTC的檢測分析主要包括富集、分選和鑒別等過程[7]，本研究利用腫瘤細(xì)胞密度的特性，使用密度梯度離心法將其富集于單核細(xì)胞、淋巴細(xì)胞等單個核細(xì)胞層中，提高了CTC檢測的靈敏度[8]。分選技術(shù)種類較多，CellSearch系統(tǒng)是目前唯一通過美國食品藥品管理局（FDA）批準(zhǔn)用于臨床CTC檢測的技術(shù)[9]，其主要原理是將帶有磁珠的EpCAM單克隆抗體與CTC結(jié)合，置于強大磁場中，從而準(zhǔn)確高效地分選出CTC。然而，約30%的膀胱癌細(xì)胞發(fā)生了間充質(zhì)轉(zhuǎn)化，EpCAM分子缺失或下調(diào)，從而降低了該技術(shù)檢測CTC的靈敏度[10]。CTC芯片分選法基于微流體學(xué)檢測技術(shù)，在芯片上裝有78 000個由EpCAM抗體包被的顯微位點，研究顯示，CTC捕獲率高達(dá)99%[11]。

膀胱癌生物學(xué)行為復(fù)雜、多變，現(xiàn)有的預(yù)后判斷標(biāo)志物對預(yù)后判斷效率十分低下[12]，許多膀胱癌患者在被診斷時，腫瘤僅局限于黏膜層或黏膜下層[13]。本研究顯示，治療前54.55%（30/55）的非肌層浸潤膀胱癌患者和96.88%（31/32）的肌層浸潤膀胱癌患者外周血中檢出了CTC，提示膀胱癌早期血行轉(zhuǎn)移是十分普遍的[14]。但是，Raimondi等[15]研究認(rèn)為將CTC作為膀胱癌早期診斷指標(biāo)尚不可取，一是檢測費用高，二是靈敏度低于膀胱鏡檢查。本研究結(jié)果還顯示，非肌層浸潤組患者CTC檢出數(shù)為（9.38±11.35）/10 ml，明顯少于肌層浸潤組患者的（23.28±11.74）/10 ml，提示隨著腫瘤原發(fā)灶的進展，CTC的數(shù)量也會進一步上升，與Busetto等[16]的研究結(jié)果類似。

Abrahamsson等[17]研究發(fā)現(xiàn)，≥1/10 ml的 CTC是膀胱癌患者預(yù)后不良的獨立危險因素。由于CTC可視為微轉(zhuǎn)移灶及預(yù)后的預(yù)測指標(biāo)，美國癌癥聯(lián)合委員會（American Joint Comm ittee on Cancer，AJCC）已將檢出CTC的乳腺癌作為AJCC分期標(biāo)準(zhǔn)——cM0，指沒有臨床或影像學(xué)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移證據(jù)，而存在分子標(biāo)志物或顯微鏡觀察到的轉(zhuǎn)移腫瘤細(xì)胞[18]。對檢出CTC的膀胱癌患者行全身化療是否可獲益仍缺乏大樣本研究支持。Yin等[19]研究顯示，對侵襲性膀胱癌行新輔助化療有助于延長患者的無進展生存時間。本研究結(jié)果顯示，肌層浸潤性膀胱癌患者的GC化療方案和非肌層浸潤患者的膀胱灌注化療均能減少CTC數(shù)量。提示全身化療很可能使浸潤深度較淺的CTC陽性患者受益。CTC數(shù)量變化及能否轉(zhuǎn)陰亦可成為膀胱癌患者治療效果和預(yù)后判斷的重要指標(biāo)[20]。

Gazzaniga等[21]研究報道，44例非肌層浸潤膀胱癌患者中，CTC陽性與陰性患者中位無進展生存時間分別為6.5個月和21.7個月，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。本研究中，未檢出CTC的非肌層浸潤組患者1年復(fù)發(fā)率為8.00%（2/25），明顯低于檢出CTC的非肌層浸潤組患者的53.33%（16/30），與以上結(jié)果一致。更加有力地證明了CTC與患者預(yù)后的關(guān)系。然而，CTC檢出數(shù)為（0～20）/10 ml及≥21/10 ml的肌層浸潤組患者的1年復(fù)發(fā)率分別為53.85%（7/13）與68.42%（13/19），差異無統(tǒng)計學(xué)意義。可能是由于現(xiàn)有的一線化療方案并不能完全清除體內(nèi)殘余的腫瘤細(xì)胞[22]。

綜上所述，外周血CTC是膀胱癌預(yù)后不良的重要標(biāo)志，對膀胱癌臨床療效評價、預(yù)后判斷有重要價值，應(yīng)盡快進行相應(yīng)的大規(guī)模臨床試驗，評價全身化療對膀胱癌患者的價值，使患者受益。