王文廉，萬(wàn)里新，屈中玉，劉越，吳艷林，趙德堡，劉揚(yáng)帆

南陽(yáng)市中心醫(yī)院腫瘤內(nèi)科，河南 南陽(yáng) 473009

乳腺癌是女性常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，近年來(lái)，隨著手術(shù)治療、內(nèi)分泌治療和靶向治療等技術(shù)的不斷發(fā)展，雖然乳腺癌患者的病死率有所下降，但其仍是導(dǎo)致患者死亡的重要原因之一，且乳腺癌的發(fā)病率呈逐漸上升趨勢(shì)[1-3]。乳腺癌的發(fā)生發(fā)展是一個(gè)多種基因、多個(gè)步驟、多種信號(hào)通路相互作用的復(fù)雜過(guò)程，目前，乳腺癌的發(fā)病機(jī)制尚未明確。X染色體連鎖的凋亡抑制蛋白（X-linked inhib-itor of apoptosis protein，XIAP）是從人胚胎組織腦中克隆出來(lái)的一種細(xì)胞凋亡抑制蛋白，是近年來(lái)新發(fā)現(xiàn)的抑制細(xì)胞凋亡的最強(qiáng)蛋白因子，與很多腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[4]。乳腺癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致患者術(shù)后預(yù)后較差、病死率較高的重要原因，而細(xì)胞上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）是此過(guò)程中的重要環(huán)節(jié)。轉(zhuǎn)化生 長(zhǎng)因 子-β1（transforming grow th factor-β1，TGF-β1）是EMT發(fā)生的重要誘導(dǎo)因子，波形蛋白（vimentin）的表達(dá)上調(diào)是EMT發(fā)生的標(biāo)志，因此，TGF-β1與vimentin在乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中起著重要的作用[5-6]，但 XIAP、TGF-β1和 vimentin在乳腺癌發(fā)生發(fā)展中作用機(jī)制的報(bào)道較少。本研究主要對(duì)XIAP、TGF-β1和vimentin在乳腺癌組織中的表達(dá)情況及臨床意義進(jìn)行探討，旨在為乳腺癌的臨床治療提供理論依據(jù)，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2015年11月至2017年11月南陽(yáng)市中心醫(yī)院收治的行手術(shù)切除術(shù)的乳腺癌患者的乳腺癌組織標(biāo)本。乳腺癌患者的納入標(biāo)準(zhǔn)：經(jīng)組織病理學(xué)檢查確診為乳腺癌；臨床資料和隨訪資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：既往接受過(guò)放療、化療和生物細(xì)胞免疫治療；炎性乳腺癌；哺乳期乳腺癌。根據(jù)納入和排除標(biāo)準(zhǔn)，本研究共納入82例乳腺癌患者，年齡為43～71歲，中位年齡為55.6歲；＜50歲44例，≥50歲38例；腫瘤直徑≥5.0 cm者36例，腫瘤直徑＜5.0 cm者46例；TNM分期：Ⅰ期18例，Ⅱ期19例，Ⅲ期20例，Ⅳ期25例；腫瘤分化程度：高分化17例，中分化20例，低分化45例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移45例，無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移37例。另外選取82例乳腺癌患者的癌旁正常組織（距離腫瘤組織5 cm以上）標(biāo)本作為對(duì)照。

1.2 主要試劑與儀器

兔抗人XIAP、TGF-β1和vimentin多克隆抗體均購(gòu)于美國(guó)Abcam公司，二氨基聯(lián)苯胺（diaminobenzidine，DAB）顯色試劑盒、免疫組織化學(xué)試劑盒均購(gòu)于武漢博士德生物技術(shù)有限公司，RM I128切片機(jī)購(gòu)于德國(guó)萊卡公司，BH-2顯微鏡購(gòu)于日本OLYMPUS公司。

1.3 免疫組織化學(xué)染色方法

術(shù)后采用免疫組織化學(xué)染色方法檢測(cè)XIAP、TGF-β1和vimentin蛋白在乳腺癌組織和癌旁正常組織中的表達(dá)。石蠟標(biāo)本均經(jīng)二甲苯Ⅰ、Ⅱ脫蠟，梯度乙醇脫水，蠟塊切片后于3%雙氧水滅活，后在枸櫞酸鈉緩沖液中于微波爐加熱進(jìn)行抗原修復(fù)，然后根據(jù)免疫組織化學(xué)染色試劑盒采用鏈霉菌抗生物素蛋白-過(guò)氧化物酶連接（streptavidin-perosidase，SP）法對(duì)石蠟標(biāo)本進(jìn)行一抗（兔抗人XIAP、TGF-β1和vimentin多克隆抗體）、二抗室溫孵育1～2 h，并染色，最后在光鏡下觀察XIAP、TGF-β1和vimentin蛋白的染色情況。選取磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）代替一抗作為陰性對(duì)照。

1.4 免疫組織化學(xué)染色結(jié)果評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)及觀察指標(biāo)

免疫組織化學(xué)結(jié)果判定：XIAP、TGF-β1、vimentin蛋白的陽(yáng)性著色表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)，均呈現(xiàn)棕黃色或棕褐色顆粒狀。每張切片選取5個(gè)高倍視野對(duì)染色細(xì)胞進(jìn)行觀察并計(jì)數(shù)，采用半定量法判定陽(yáng)性結(jié)果。根據(jù)細(xì)胞的著色程度進(jìn)行評(píng)分：未染色計(jì)0分，淺黃色計(jì)1分，棕黃色計(jì)2分，棕褐色計(jì)3分。根據(jù)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目所占百分比進(jìn)行評(píng)分：無(wú)陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)0分，陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目所占百分比為1～24%計(jì)1分，陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目所占百分比為25%～49%計(jì)2分，陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目所占百分比為50%～74%計(jì)3分，陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目所占百分比為75%～100%計(jì)4分。兩種積分相乘，0～2分為陰性（-），3～4分為弱陽(yáng)性（+），5～8分為中等陽(yáng)性（++），9～12分為強(qiáng)陽(yáng)性（+++）?？偡帧?分表示細(xì)胞陽(yáng)性表達(dá)，總分＜3分表示細(xì)胞陰性表達(dá)。觀察XIAP、TGF-β1和vimentin在乳腺癌組織和癌旁正常組織中的表達(dá)情況，并分析乳腺癌組織中XIAP、TGF-β1和vimentin表達(dá)與乳腺癌患者臨床特征的關(guān)系以及乳腺癌組織中XIAP、TGF-β1和vimentin表達(dá)的相關(guān)性。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 17.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)數(shù)資料以例數(shù)和率（%）表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)；相關(guān)性分析采用Pearson相關(guān)性分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同組織中XIAP、TGF-β1和vimentin表達(dá)情況的比較

XIAP、TGF-β1、vimentin在乳腺癌組織中的陽(yáng)性表達(dá)率均明顯高于癌旁正常組織，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。（表1）

表1 不同組織中XIAP、TGF-β1和vimentin表達(dá)情況的比較[n（%）]

2.2 不同臨床特征乳腺癌患者乳腺癌組織中XIAP、TGF-β1和vimentin陽(yáng)性表達(dá)情況的比較

TNM分期為Ⅲ～Ⅳ期乳腺癌患者乳腺癌組織中XIAP、TGF-β1及vimentin陽(yáng)性表達(dá)率均高于TNM分期為Ⅰ～Ⅱ期的乳腺癌患者，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=7.043、5.961、10.478，P＜0.05）；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移乳腺癌患者乳腺癌組織中XIAP、TGF-β1及vimentin陽(yáng)性表達(dá)率均高于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的乳腺癌患者，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=7.043、5.961、14.417，P＜0.05）。不同年齡、腫瘤直徑、腫瘤分化程度乳腺癌患者乳腺癌組織中XIAP、TGF-β1和vimentin的陽(yáng)性表達(dá)率比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。（表2）

表2 82例不同臨床特征乳腺癌患者乳腺癌組織中XIAP、TGF-β1和vimentin的陽(yáng)性表達(dá)情況

2.3 乳腺癌組織中XIAP、TGF-β1和vimentin表達(dá)的相關(guān)性

經(jīng)Pearson相關(guān)性分析，乳腺癌組織中XIAP與TGF-β1的表達(dá)呈正相關(guān)（r=0.543，P＜0.01），XIAP與vimentin的表達(dá)呈正相關(guān)（r=0.584，P＜0.01），TGF-β1與vimentin的表達(dá)呈正相關(guān)（r=0.657，P＜0.01）。

3 討論

Crook最早于桿狀病毒中發(fā)現(xiàn)了凋亡抑制蛋白（inhibitor of apoptosis protein，IAP）家族，并發(fā)現(xiàn)IAP能夠明顯抑制由病毒感染引起的細(xì)胞凋亡。XIAP是1996年P(guān)eter通過(guò)聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）和Southern技術(shù)從人胚胎腦組織中克隆出來(lái)的一種IAP，是IAP家族中最強(qiáng)的凋亡抑制蛋白和最有效的caspase家族抑制劑。XIAP能夠通過(guò)直接與caspase 9起始因子和caspase 3、caspase 9效應(yīng)因子結(jié)合，進(jìn)而抑制caspase家族引起的細(xì)胞凋亡。XIAP在機(jī)體中除了在外周血淋巴細(xì)胞以外的組織中均有表達(dá)，其在胃癌、結(jié)腸癌、卵巢癌、肺癌等多種腫瘤組織中呈陽(yáng)性表達(dá)，因此，關(guān)于XIAP在腫瘤組織中的抗凋亡機(jī)制的研究越來(lái)越深入，并成為腫瘤基因治療的研究熱點(diǎn)[4,7]。本研究結(jié)果顯示，XIAP在乳腺癌組織中的陽(yáng)性表達(dá)率明顯高于癌旁正常組織（P＜0.01）。另外，TNM分期為Ⅲ～Ⅳ期、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移乳腺癌患者乳腺癌組織中XIAP的陽(yáng)性表達(dá)率均高于TNM分期為Ⅰ～Ⅱ期、無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的乳腺癌患者（P＜0.05），說(shuō)明XIAP在乳腺癌的發(fā)生及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的過(guò)程中具有重要的作用。

具有極性的、排列整齊的上皮細(xì)胞喪失了黏附性而轉(zhuǎn)化形成能夠移動(dòng)的、不穩(wěn)定的間質(zhì)細(xì)胞的過(guò)程稱為EMT。在EMT的過(guò)程中，間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物vimentin的表達(dá)水平升高，上皮細(xì)胞標(biāo)志物E-cadherin的表達(dá)水平降低[8]。vimentin是一種能夠下調(diào)細(xì)胞表面黏附因子表達(dá)的腫瘤蛋白，能夠?yàn)槟[瘤細(xì)胞發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移提供有利的條件。vimentin在多種腫瘤組織中呈高表達(dá)，特別是在有轉(zhuǎn)移灶的腫瘤組織中的表達(dá)水平最高[6,9]。另外，TGF-β1等細(xì)胞因子能夠誘導(dǎo)EMT的發(fā)生。TGF-β1屬于TGF-β超家族，此家族包括TGF-β、骨形態(tài)蛋白和激活素等。哺乳動(dòng)物中含有3個(gè)TGF-β亞基，分別為T(mén)GF-β1、TGF-β2、TGF-β3。TGF-β1在上游細(xì)胞因子的刺激下，能夠特異性地識(shí)別其下游信使分子Smad2/3，并使Smad2/3磷酸化與Smad4形成寡聚體，并轉(zhuǎn)入細(xì)胞核內(nèi)，與目的基因啟動(dòng)子結(jié)合，促使靶基因轉(zhuǎn)錄。研究顯示，TGF-β1在眾多腫瘤組織中呈高表達(dá)，并與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[5,10-11]。本研究結(jié)果顯示，TGF-β1、vimentin在乳腺癌組織中的陽(yáng)性表達(dá)率均明顯高于癌旁正常組織，同時(shí)TNM分期為Ⅲ～Ⅳ期、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移乳腺癌患者乳腺癌組織中TGF-β1、vimentin的陽(yáng)性表達(dá)率均高于TNM分期為Ⅰ～Ⅱ期、無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的乳腺癌患者（P＜0.05），而不同年齡、腫瘤直徑、腫瘤分化程度乳腺癌患者乳腺癌組織中TGF-β1和vimentin的陽(yáng)性表達(dá)率比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），說(shuō)明TGF-β1、vimentin在乳腺癌的發(fā)生發(fā)展及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移過(guò)程中起重要作用。另外，本研究通過(guò)相關(guān)性分析還證實(shí)了乳腺癌組織中XIAP、TGF-β1、vimentin的表達(dá)兩兩呈正相關(guān)，表明三者在乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中起著協(xié)同作用。有研究表明，敲除TGF-β1能明顯下調(diào)HepG2肝癌細(xì)胞中PCNA、XIAP、survivin等蛋白的表達(dá)，進(jìn)而抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)[12]。亦有研究發(fā)現(xiàn)，TGF-β1能夠促進(jìn)腫瘤細(xì)胞EMT的形成[13-15]。因此，TGF-β1可以成為乳腺癌基因治療的靶點(diǎn)。

綜上所述，XIAP、TGF-β1、vimentin在乳腺癌組織中的表達(dá)水平較高，并與乳腺癌患者的TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移可能有關(guān)，而與乳腺癌患者的年齡、腫瘤直徑、腫瘤分化程度可能無(wú)關(guān)，同時(shí)三者的表達(dá)兩兩呈正相關(guān)，可作為判斷乳腺癌發(fā)生和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的參考指標(biāo)。