王文廉，萬里新，屈中玉，劉越，吳艷林，趙德堡，劉揚帆

南陽市中心醫(yī)院腫瘤內(nèi)科，河南 南陽 473009

乳腺癌是女性常見的惡性腫瘤之一，近年來，隨著手術治療、內(nèi)分泌治療和靶向治療等技術的不斷發(fā)展，雖然乳腺癌患者的病死率有所下降，但其仍是導致患者死亡的重要原因之一，且乳腺癌的發(fā)病率呈逐漸上升趨勢[1-3]。乳腺癌的發(fā)生發(fā)展是一個多種基因、多個步驟、多種信號通路相互作用的復雜過程，目前，乳腺癌的發(fā)病機制尚未明確。X染色體連鎖的凋亡抑制蛋白（X-linked inhib-itor of apoptosis protein，XIAP）是從人胚胎組織腦中克隆出來的一種細胞凋亡抑制蛋白，是近年來新發(fā)現(xiàn)的抑制細胞凋亡的最強蛋白因子，與很多腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關[4]。乳腺癌細胞的轉移是導致患者術后預后較差、病死率較高的重要原因，而細胞上皮-間充質(zhì)轉化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）是此過程中的重要環(huán)節(jié)。轉化生 長因 子-β1（transforming grow th factor-β1，TGF-β1）是EMT發(fā)生的重要誘導因子，波形蛋白（vimentin）的表達上調(diào)是EMT發(fā)生的標志，因此，TGF-β1與vimentin在乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展過程中起著重要的作用[5-6]，但 XIAP、TGF-β1和 vimentin在乳腺癌發(fā)生發(fā)展中作用機制的報道較少。本研究主要對XIAP、TGF-β1和vimentin在乳腺癌組織中的表達情況及臨床意義進行探討，旨在為乳腺癌的臨床治療提供理論依據(jù)，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2015年11月至2017年11月南陽市中心醫(yī)院收治的行手術切除術的乳腺癌患者的乳腺癌組織標本。乳腺癌患者的納入標準：經(jīng)組織病理學檢查確診為乳腺癌；臨床資料和隨訪資料完整。排除標準：既往接受過放療、化療和生物細胞免疫治療；炎性乳腺癌；哺乳期乳腺癌。根據(jù)納入和排除標準，本研究共納入82例乳腺癌患者，年齡為43～71歲，中位年齡為55.6歲；＜50歲44例，≥50歲38例；腫瘤直徑≥5.0 cm者36例，腫瘤直徑＜5.0 cm者46例；TNM分期：Ⅰ期18例，Ⅱ期19例，Ⅲ期20例，Ⅳ期25例；腫瘤分化程度：高分化17例，中分化20例，低分化45例；有淋巴結轉移45例，無淋巴結轉移37例。另外選取82例乳腺癌患者的癌旁正常組織（距離腫瘤組織5 cm以上）標本作為對照。

1.2 主要試劑與儀器

兔抗人XIAP、TGF-β1和vimentin多克隆抗體均購于美國Abcam公司，二氨基聯(lián)苯胺（diaminobenzidine，DAB）顯色試劑盒、免疫組織化學試劑盒均購于武漢博士德生物技術有限公司，RM I128切片機購于德國萊卡公司，BH-2顯微鏡購于日本OLYMPUS公司。

1.3 免疫組織化學染色方法

術后采用免疫組織化學染色方法檢測XIAP、TGF-β1和vimentin蛋白在乳腺癌組織和癌旁正常組織中的表達。石蠟標本均經(jīng)二甲苯Ⅰ、Ⅱ脫蠟，梯度乙醇脫水，蠟塊切片后于3%雙氧水滅活，后在枸櫞酸鈉緩沖液中于微波爐加熱進行抗原修復，然后根據(jù)免疫組織化學染色試劑盒采用鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶連接（streptavidin-perosidase，SP）法對石蠟標本進行一抗（兔抗人XIAP、TGF-β1和vimentin多克隆抗體）、二抗室溫孵育1～2 h，并染色，最后在光鏡下觀察XIAP、TGF-β1和vimentin蛋白的染色情況。選取磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）代替一抗作為陰性對照。

1.4 免疫組織化學染色結果評分標準及觀察指標

免疫組織化學結果判定：XIAP、TGF-β1、vimentin蛋白的陽性著色表達于細胞質(zhì)，均呈現(xiàn)棕黃色或棕褐色顆粒狀。每張切片選取5個高倍視野對染色細胞進行觀察并計數(shù)，采用半定量法判定陽性結果。根據(jù)細胞的著色程度進行評分：未染色計0分，淺黃色計1分，棕黃色計2分，棕褐色計3分。根據(jù)陽性細胞數(shù)目所占百分比進行評分：無陽性細胞計0分，陽性細胞數(shù)目所占百分比為1～24%計1分，陽性細胞數(shù)目所占百分比為25%～49%計2分，陽性細胞數(shù)目所占百分比為50%～74%計3分，陽性細胞數(shù)目所占百分比為75%～100%計4分。兩種積分相乘，0～2分為陰性（-），3～4分為弱陽性（+），5～8分為中等陽性（++），9～12分為強陽性（+++）?？偡帧?分表示細胞陽性表達，總分＜3分表示細胞陰性表達。觀察XIAP、TGF-β1和vimentin在乳腺癌組織和癌旁正常組織中的表達情況，并分析乳腺癌組織中XIAP、TGF-β1和vimentin表達與乳腺癌患者臨床特征的關系以及乳腺癌組織中XIAP、TGF-β1和vimentin表達的相關性。

1.5 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 17.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。計數(shù)資料以例數(shù)和率（%）表示，組間比較采用χ2檢驗；相關性分析采用Pearson相關性分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 不同組織中XIAP、TGF-β1和vimentin表達情況的比較

XIAP、TGF-β1、vimentin在乳腺癌組織中的陽性表達率均明顯高于癌旁正常組織，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。（表1）

表1 不同組織中XIAP、TGF-β1和vimentin表達情況的比較[n（%）]

2.2 不同臨床特征乳腺癌患者乳腺癌組織中XIAP、TGF-β1和vimentin陽性表達情況的比較

TNM分期為Ⅲ～Ⅳ期乳腺癌患者乳腺癌組織中XIAP、TGF-β1及vimentin陽性表達率均高于TNM分期為Ⅰ～Ⅱ期的乳腺癌患者，差異均有統(tǒng)計學意義（χ2=7.043、5.961、10.478，P＜0.05）；有淋巴結轉移乳腺癌患者乳腺癌組織中XIAP、TGF-β1及vimentin陽性表達率均高于無淋巴結轉移的乳腺癌患者，差異均有統(tǒng)計學意義（χ2=7.043、5.961、14.417，P＜0.05）。不同年齡、腫瘤直徑、腫瘤分化程度乳腺癌患者乳腺癌組織中XIAP、TGF-β1和vimentin的陽性表達率比較，差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。（表2）

表2 82例不同臨床特征乳腺癌患者乳腺癌組織中XIAP、TGF-β1和vimentin的陽性表達情況

2.3 乳腺癌組織中XIAP、TGF-β1和vimentin表達的相關性

經(jīng)Pearson相關性分析，乳腺癌組織中XIAP與TGF-β1的表達呈正相關（r=0.543，P＜0.01），XIAP與vimentin的表達呈正相關（r=0.584，P＜0.01），TGF-β1與vimentin的表達呈正相關（r=0.657，P＜0.01）。

3 討論

Crook最早于桿狀病毒中發(fā)現(xiàn)了凋亡抑制蛋白（inhibitor of apoptosis protein，IAP）家族，并發(fā)現(xiàn)IAP能夠明顯抑制由病毒感染引起的細胞凋亡。XIAP是1996年Peter通過聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR）和Southern技術從人胚胎腦組織中克隆出來的一種IAP，是IAP家族中最強的凋亡抑制蛋白和最有效的caspase家族抑制劑。XIAP能夠通過直接與caspase 9起始因子和caspase 3、caspase 9效應因子結合，進而抑制caspase家族引起的細胞凋亡。XIAP在機體中除了在外周血淋巴細胞以外的組織中均有表達，其在胃癌、結腸癌、卵巢癌、肺癌等多種腫瘤組織中呈陽性表達，因此，關于XIAP在腫瘤組織中的抗凋亡機制的研究越來越深入，并成為腫瘤基因治療的研究熱點[4,7]。本研究結果顯示，XIAP在乳腺癌組織中的陽性表達率明顯高于癌旁正常組織（P＜0.01）。另外，TNM分期為Ⅲ～Ⅳ期、有淋巴結轉移乳腺癌患者乳腺癌組織中XIAP的陽性表達率均高于TNM分期為Ⅰ～Ⅱ期、無淋巴結轉移的乳腺癌患者（P＜0.05），說明XIAP在乳腺癌的發(fā)生及淋巴結轉移的過程中具有重要的作用。

具有極性的、排列整齊的上皮細胞喪失了黏附性而轉化形成能夠移動的、不穩(wěn)定的間質(zhì)細胞的過程稱為EMT。在EMT的過程中，間質(zhì)細胞標志物vimentin的表達水平升高，上皮細胞標志物E-cadherin的表達水平降低[8]。vimentin是一種能夠下調(diào)細胞表面黏附因子表達的腫瘤蛋白，能夠為腫瘤細胞發(fā)生遠處轉移提供有利的條件。vimentin在多種腫瘤組織中呈高表達，特別是在有轉移灶的腫瘤組織中的表達水平最高[6,9]。另外，TGF-β1等細胞因子能夠誘導EMT的發(fā)生。TGF-β1屬于TGF-β超家族，此家族包括TGF-β、骨形態(tài)蛋白和激活素等。哺乳動物中含有3個TGF-β亞基，分別為TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3。TGF-β1在上游細胞因子的刺激下，能夠特異性地識別其下游信使分子Smad2/3，并使Smad2/3磷酸化與Smad4形成寡聚體，并轉入細胞核內(nèi)，與目的基因啟動子結合，促使靶基因轉錄。研究顯示，TGF-β1在眾多腫瘤組織中呈高表達，并與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關[5,10-11]。本研究結果顯示，TGF-β1、vimentin在乳腺癌組織中的陽性表達率均明顯高于癌旁正常組織，同時TNM分期為Ⅲ～Ⅳ期、有淋巴結轉移乳腺癌患者乳腺癌組織中TGF-β1、vimentin的陽性表達率均高于TNM分期為Ⅰ～Ⅱ期、無淋巴結轉移的乳腺癌患者（P＜0.05），而不同年齡、腫瘤直徑、腫瘤分化程度乳腺癌患者乳腺癌組織中TGF-β1和vimentin的陽性表達率比較，差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），說明TGF-β1、vimentin在乳腺癌的發(fā)生發(fā)展及淋巴結轉移過程中起重要作用。另外，本研究通過相關性分析還證實了乳腺癌組織中XIAP、TGF-β1、vimentin的表達兩兩呈正相關，表明三者在乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展過程中起著協(xié)同作用。有研究表明，敲除TGF-β1能明顯下調(diào)HepG2肝癌細胞中PCNA、XIAP、survivin等蛋白的表達，進而抑制腫瘤細胞的生長[12]。亦有研究發(fā)現(xiàn)，TGF-β1能夠促進腫瘤細胞EMT的形成[13-15]。因此，TGF-β1可以成為乳腺癌基因治療的靶點。

綜上所述，XIAP、TGF-β1、vimentin在乳腺癌組織中的表達水平較高，并與乳腺癌患者的TNM分期、淋巴結轉移可能有關，而與乳腺癌患者的年齡、腫瘤直徑、腫瘤分化程度可能無關，同時三者的表達兩兩呈正相關，可作為判斷乳腺癌發(fā)生和淋巴結轉移的參考指標。