余坤　周永春

昆明醫(yī)科大學(xué)第三附屬醫(yī)院分子診斷中心/肺癌研究重點實驗室云南省腫瘤醫(yī)院分子診斷中心/肺癌研究重點實驗室云南省癌癥中心分子診斷中心/肺癌研究重點實驗室，云南昆明650118

[摘要]3D培養(yǎng)模型的引入是細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的一個里程碑，隨著新型支架、基質(zhì)的發(fā)明與應(yīng)用及細(xì)胞成像和分析系統(tǒng)的日新月異，三維細(xì)胞培養(yǎng)可模擬體內(nèi)微環(huán)境而獲得傳統(tǒng)2D細(xì)胞培養(yǎng)所沒有的優(yōu)勢，已在基礎(chǔ)研究、干細(xì)胞及組織工程等領(lǐng)域嶄露頭角。本文通過回顧3D細(xì)胞培養(yǎng)在藥敏實驗、藥物篩選、藥物研發(fā)、臨床應(yīng)用中的貢獻，從藥物效應(yīng)、藥物代謝及藥物敏感性著手，枚舉3D細(xì)胞培養(yǎng)通過改變基因/蛋白質(zhì)差異表達來進行藥物研發(fā)，并對其應(yīng)用趨勢、潛在優(yōu)勢和不足作一綜述，為基礎(chǔ)研究和臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。

[關(guān)鍵詞]3D細(xì)胞培養(yǎng)（TDCC）;藥物研發(fā);藥物效應(yīng);藥物代謝;藥物敏感性

[中圖分類號]R917

[文獻標(biāo)識碼]A

[文章編號]2095-0616（2019）03-36-04

新靶標(biāo)的發(fā)現(xiàn)及發(fā)揮作用的分子與化合物的合成是藥物研發(fā)的基礎(chǔ)與重中之重，藥代動力學(xué)和毒性效應(yīng)是它們的作用機制[1-2]。技術(shù)的進步和學(xué)科之間的交叉滲透，使藥物發(fā)現(xiàn)過程變得不那么繁瑣反而更加簡易。生物信息學(xué)的發(fā)展使得藥物在體內(nèi)的代謝、作用及預(yù)后等方面可進行體外模擬，進而確定潛在的藥物靶點成為可能。應(yīng)用生物信息學(xué)（結(jié)構(gòu)建模）結(jié)合藥物化學(xué)和細(xì)胞培養(yǎng)進行的體外藥物檢測已成為初期藥物研發(fā)的主要方式，這種方法不僅有助于節(jié)省時間和成本，還有助于發(fā)現(xiàn)針對患者治療的正誤和有效與否。近年，對三維細(xì)胞培養(yǎng)（three-dimensional cell culture，TDCC）技術(shù)最新進展的報道層出不窮，主要描述了該模型中癌細(xì)胞生長的不同物理特性和信號調(diào)控，癌細(xì)胞對藥物的敏感性和如何使藥物滲透至細(xì)胞，還報道了細(xì)胞對抗癌藥物的敏感性受到基質(zhì)性質(zhì)和使用的細(xì)胞類型的影響[3-5]。業(yè)已證明，TDCC模型結(jié)合微陣列和生物信息學(xué)對于藥物發(fā)現(xiàn)和篩選具有潛在的應(yīng)用前景[6-8]。

1 TDCC誘導(dǎo)的基因表達和藥物效應(yīng)

候選藥物在靶細(xì)胞中誘導(dǎo)的損傷程度是藥物研發(fā)的價值體現(xiàn)，而安全性檢測為副作用的發(fā)現(xiàn)提供了可能，是藥物篩選的基礎(chǔ)。與單層細(xì)胞培養(yǎng)相比，TDCC會誘導(dǎo)細(xì)胞基因和蛋白的差異表達，對識別新的藥物靶標(biāo)更具實際意義[9]。

Li等[10]對人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞SH-SY5Y進行了3D細(xì)胞培養(yǎng)，使用微陣列和RT-PCR分析了1766個基因的表達變化，發(fā)現(xiàn)不同基質(zhì)特性誘導(dǎo)的TDCC可發(fā)生特征性變化，并強調(diào)了該研究可直接應(yīng)用于藥物劑量、代謝途徑、藥效等的檢測，為個體化精準(zhǔn)醫(yī)療提供最佳治療結(jié)果。另一項關(guān)于TDCC誘導(dǎo)的基因表達差異的綜合研究是使用了對血管平滑肌細(xì)胞的9600個基因的微陣列分析。顯示在3D培養(yǎng)物（也稱為球體）中超過77種與藥物重新定位的相關(guān)基因發(fā)生過表達。Peyton團隊[12]將TDCC技術(shù)引入平滑肌細(xì)胞的培養(yǎng)，結(jié)果顯示TDCC中細(xì)胞外基質(zhì)的力學(xué)特性可調(diào)節(jié)RhoA表達和活化，對細(xì)胞增殖具有顯著影響，有助于改善抗增殖藥物的使用。

Wang等[13]使用膠原蛋白作為TDCC生長基質(zhì)培養(yǎng)嗅鞘細(xì)胞（OECs）已顯示獲得與體內(nèi)細(xì)胞相似的包括形態(tài)學(xué)、凋亡、增殖等在內(nèi)與自然微環(huán)境生存相關(guān)的若干特性。Debeb團隊的研究[14]表明應(yīng)用TDCC技術(shù)培養(yǎng)的人類胚胎腎細(xì)胞（293T細(xì)胞）可用于提高藥物測試的效用，對藥物靶向具有啟示意義，包括基因TA1，RhoC，N-鈣黏素（N-cathedrin），vimentin，Notch1，β-catenin，zeb1，slug和snail都存在過表達，有望成為新的藥物靶標(biāo)。無獨有偶，將人惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞作為3D培養(yǎng)物生長時，具有DNA修復(fù)作用的O6-甲基鳥嘌呤DNA甲基轉(zhuǎn)移酶（MGMT）和谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶（GST）顯示出差異表達，3D較2D培養(yǎng)更能充分證明MGMT和GST表達不能預(yù)測成膠質(zhì)細(xì)胞瘤細(xì)胞對烷化劑的敏感性，而烷基化劑與GST抑制劑的組合揭示了加和效應(yīng)，進一步提出了在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤治療中應(yīng)考慮抑制GST以獲得更好的有效性[15]。人卵巢癌細(xì)胞SKOV3在微流體芯片上作為3D工程組織培養(yǎng)時，具有上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（Epithelial-MesenchymalTransition，EMT）能力，這些細(xì)胞獲得了間充質(zhì)成纖維細(xì)胞的形態(tài)，表達了纖連蛋白和N-cadherin的下調(diào)，具有低氧特性，并表達了上皮腫瘤標(biāo)志物波形蛋白和CD362/EpCAM，這些不同的表達可用于探究靶向細(xì)胞凋亡和轉(zhuǎn)移的藥物[16]。Ghosh團隊通過寡核苷酸微陣列分析在多甲基丙烯酸甲酯包被的平板上生長為多細(xì)胞球狀體的黑色素瘤細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)超過20，000個基因的表達，包括IL-8、CXCL1、CXCL2、CXCL3、ICCL20和ANG等基因顯著過表達，而CD49d和FGF基因的表達減少，這些結(jié)果提示研發(fā)腫瘤轉(zhuǎn)移、血管生成和癌癥進展的靶向藥物成為可能[17]。Debnath和Brugge的研究[18]為形態(tài)建模提供了管腔形成、細(xì)胞極性和細(xì)胞侵入等性質(zhì)的重要特征，有助于發(fā)現(xiàn)3D培養(yǎng)中基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP）的過表達和受體酪氨酸激酶（RTKs）、集落刺激因子1（CSF1）、表皮生長因子受體（EGFR）的功能以及導(dǎo)致EMT的途徑及其與腫瘤發(fā)生和發(fā)展相關(guān)的機制，為將3D細(xì)胞培養(yǎng)用于更現(xiàn)實相關(guān)的藥物研發(fā)是有利的提供有力的理論依據(jù)。這項研究還確定了新的分子在腫瘤進展中的作用，從而提出精準(zhǔn)治療的潛在靶標(biāo)。

2 高新技術(shù)助力3D培養(yǎng)和藥物代謝

TDCC技術(shù)能更加切合體內(nèi)實際地了解藥物在體外的代謝。早在1994年，Boxberger團隊[19]就表明，當(dāng)使用藻酸鹽對人類膀胱癌細(xì)胞RT112進行3D多細(xì)胞球體培養(yǎng)時，能夠形成良好的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體，從而增強細(xì)胞發(fā)育、功能反應(yīng)以及體外代謝活動。Lan等[20]研究組采用藻酸鹽構(gòu)建三維支架，測定單層和3D培養(yǎng)物中包封細(xì)胞的I期/II期細(xì)胞活力和代謝特征，使用掃描電子顯微鏡（SEM）和激光掃描共聚焦顯微鏡（LSCM）評估了用肝癌細(xì)胞HepG2包裹的超無菌藻酸鹽水凝膠在高通量藥物篩選中的應(yīng)用。結(jié)果 包裹細(xì)胞的增殖速率保持穩(wěn)定，14天后仍具有>80%的高細(xì)胞活力，并產(chǎn)生CYP1A1和CYP3A4肝特異性酶，表明細(xì)胞的存活力和功能性良好，且能持續(xù)保持II期細(xì)胞的谷胱甘肽活性。Labonia團隊[21]用3D打印流體裝置新型體外平臺來評估藥物的滲透和代謝。其允許三維細(xì)胞培養(yǎng)物進行動態(tài)給藥，用MALDI成像質(zhì)譜法（IMS）檢查化療藥物伊立替康對結(jié)腸癌HCT116球狀體的滲透。還檢測到伊立替康的活性代謝物SN-38經(jīng)24小時的治療后，被濃縮到球狀體細(xì)胞分裂活躍區(qū)（即外圍），表明這種獨特的體外平臺是評估3D細(xì)胞培養(yǎng)物中藥物滲透和代謝的有效手段。由于其成本效益和高通量，該創(chuàng)新系統(tǒng)可對候選藥物的臨床前評估產(chǎn)生重大轉(zhuǎn)變性影響。Feng等[22]利用聚己內(nèi)酯（PCL）和羥基磷灰石（HAp）制成具有生物相容性，且平均孔徑167μm的近場靜電紡絲（NFES）復(fù)合支架，有效提高細(xì)胞的增殖和分化，并可根據(jù)PCL與HAp的比例控制降解速率，有效解決了3D系統(tǒng)不易分離細(xì)胞的缺陷。Choi團隊[23]研究發(fā)現(xiàn)TDCC技術(shù)培養(yǎng)的肝細(xì)胞樣細(xì)胞（HLCs）藥物代謝酶和肝轉(zhuǎn)運蛋白的基因表達顯著高于在2D培養(yǎng)的HLCs。此外，3D培養(yǎng)的細(xì)胞顯現(xiàn)特異性功能，包括白蛋白分泌和膽小管形成增加。特別地，3D球形培養(yǎng)物增加了編碼肝酯酶的CES1和BCHE的表達。通過膽堿酯酶活性測定得知HLC對奧司他韋的易感性增加，證實了這些肝酯酶的活性增強。多項研究證實，3D球形培養(yǎng)可增強細(xì)胞的成熟和藥物代謝，有助于優(yōu)化藥物篩選及毒性檢測。

3 改變藥物對3D細(xì)胞培養(yǎng)的敏感性

TDCC技術(shù)給藥效研究領(lǐng)域帶來了福音。它的出現(xiàn)已經(jīng)極大地改變了藥物誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性，基因毒性，抗增殖和類似作用的典型“劑量反應(yīng)”的觀點。Castillo等[24]利用TDCC對60個肺癌細(xì)胞球狀體進行Gefitinib的敏感性探究，發(fā)現(xiàn)EGFR與hedgehog信號通路的G蛋白偶聯(lián)受體SMO是其敏感性相關(guān)的基因，并證實了吉非替尼與SMO抑制劑Cyclopamine和GDC0449具有潛在的協(xié)同作用。3D細(xì)胞培養(yǎng)物用于直接測試不同終點或化合物對藥物誘導(dǎo)的調(diào)節(jié)效應(yīng)，大多數(shù)都針對不同終點的藥物測試，具有顯著基因表達變化，且可用于藥物發(fā)現(xiàn)的3D細(xì)胞培養(yǎng)研究枚舉于表1[25-28]。

4 結(jié)論

細(xì)胞培養(yǎng)是藥物研發(fā)、干細(xì)胞和腫瘤研究領(lǐng)域不可或缺的實驗對象。三維細(xì)胞培養(yǎng)已成為藥物研發(fā)的寶貴工具，為細(xì)胞的體外藥物研發(fā)模擬體內(nèi)微環(huán)境，較2D培養(yǎng)更接近體內(nèi)真實情況，有助于彌合體外和體內(nèi)系統(tǒng)之間的差距，并可減少在早期發(fā)現(xiàn)階段使用動物的實驗次數(shù)，以減少藥效等方面的誤差。在諸如“組學(xué)”工具，納米技術(shù)和生物打印等高新領(lǐng)域的進步與融合，勢必增強3D細(xì)胞培養(yǎng)在藥物研發(fā)中的實用性。近年來，研究者們已經(jīng)探索了自動化，微流體、芯片及NASA研發(fā)改進的微重力旋轉(zhuǎn)三維培養(yǎng)體系，盡管顯現(xiàn)出較2D培養(yǎng)的優(yōu)越性，然而，大多數(shù)3D培養(yǎng)物利用凝膠基質(zhì)，但由于其固體和不透明性以及細(xì)胞暴露于外源信號的不一致性而限制了應(yīng)用。在沒有凝膠基質(zhì)的3D培養(yǎng)中，細(xì)胞傾向于彼此粘附并在中心形成具有壞死區(qū)的團塊，使得它們不易于分析，因此，TDCC在納入藥物研發(fā)、個體化精準(zhǔn)診療等領(lǐng)域的共識及標(biāo)準(zhǔn)前，還有很多荊棘與坎坷亟待攻關(guān)和解決。

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