畢海林,吳永斌,楊洪濤,楊燕林,楊正松,和文佳*

(1.云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 高山經(jīng)濟(jì)植物研究所,云南 麗江 674199;2.云南麗江藍(lán)瑪生物科技開(kāi)發(fā)有限責(zé)任公司,云南 麗江 674199)

硬齒獼猴桃(ActinidiacallosaLindl.),是獼猴桃科(Actinidiaceae)獼猴桃屬(ActinidiaLindl)一種大型落葉藤本。該種是一個(gè)龐雜的大類(lèi)群,形態(tài)多樣,其共同點(diǎn)是近全體無(wú)毛,僅部分的脈腋和花序花萼等處被毛。硬齒獼猴桃為原變種,共有6個(gè)變種,分別為臺(tái)灣獼猴桃、尖葉獼猴桃、毛葉硬齒獼猴桃、京梨獼猴桃、異色獼猴桃、駝齒獼猴桃。硬齒獼猴桃分布于中國(guó)長(zhǎng)江以南各省區(qū),西起云貴高原和四川內(nèi)陸,東至臺(tái)灣省,云南文山、漾濞、景東、鳳慶、富寧、屏邊等地均有分布,此外,印度、不丹和印度北部地區(qū)也有分布[1]。獼猴桃的質(zhì)地柔軟,口感酸甜，味道被描述為草莓、香蕉、菠蘿三者的混合。獼猴桃除含有獼猴桃堿、蛋白水解酶、單寧果膠和糖類(lèi)等有機(jī)物,以及鈣、鉀、硒、鋅、鍺等微量元素和人體所需的17種氨基酸外,還含有豐富的維生素C、葡萄酸、果糖、檸檬酸、蘋(píng)果酸、脂肪。1顆獼猴桃能提供1個(gè)人一日維生素C需求量的兩倍多,被譽(yù)為“水果之王”。獼猴桃還含有良好的可溶性膳食纖維以及具有出眾抗氧化性能的植物性化學(xué)物質(zhì)SOD。獼猴桃還具有穩(wěn)定情緒、降膽固醇、幫助消化、預(yù)防便秘、止渴利尿和保護(hù)心臟等作用。我國(guó)是獼猴桃的原產(chǎn)地,有著豐富的獼猴桃遺傳資源[2]。獼猴桃大多是雌雄異株,采用種子繁育,周期長(zhǎng),且較難鑒別幼株性別,不易獲得大批雌株群體;而利用扦插、嫁接的育苗方法,存活率較低。與其他育苗方式相比,組織培養(yǎng)不但能周年供苗,高效快速，而且成本低廉。 1975年Hirsch首次以獼猴桃莖段為材料,進(jìn)行離體培養(yǎng),為獼猴桃組織培養(yǎng)的研究工作揭開(kāi)了序幕；從此,國(guó)內(nèi)外利用組織培養(yǎng)技術(shù)快速繁殖獼猴桃受到了廣泛的重視[3-8]。國(guó)內(nèi)外有關(guān)獼猴桃栽培品種組織培養(yǎng)的研究報(bào)道較多,有關(guān)獼猴桃野生種組織培養(yǎng)的研究報(bào)道也不少見(jiàn),而有關(guān)硬齒獼猴桃的組培快繁技術(shù)尚未見(jiàn)報(bào)道。我們對(duì)硬齒獼猴桃進(jìn)行了組織培養(yǎng)、快速繁殖技術(shù)的研究,以期為硬齒獼猴桃野生資源的開(kāi)發(fā)和利用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

硬齒獼猴桃果實(shí)、枝條，取自云南滄怒分水嶺。

1.2 方法

1.2.1 外植體消毒及初代培養(yǎng) 以硬齒獼猴桃的干種子、帶腋芽莖段作為外植體。9月下旬取硬齒獼猴桃的成熟果實(shí)和枝條進(jìn)行處理,干種子為從成熟果實(shí)中洗出并晾干的當(dāng)年種子。將種子、莖段均用洗衣粉液浸泡5 min,用流水沖洗2 h,然后放入超凈臺(tái),用70%乙醇消毒30 s,用無(wú)菌水浸洗2次,再用0.1%升汞溶液分別消毒2、8 min,最后用無(wú)菌水浸洗5次后供接種使用。將種子、莖段直接接種在以下5種誘導(dǎo)培養(yǎng)基上:MS基本培養(yǎng)基、MS+0.5 mg/L 6-BA+0.2 mg/L IBA、MS+0.5 mg/L 6-BA+0.5 mg/L IBA、MS+0.5 mg/L ZT+0.2 mg/L IBA、MS+0.5 mg/L ZT+0.5 mg/L IBA。培養(yǎng)溫度為(25±2)℃,光照強(qiáng)度為3000 lx,光照時(shí)間為12 h/d,培養(yǎng)基pH值均為5.8。每瓶培養(yǎng)基接種10粒種子或1個(gè)莖段,以60粒種子或60個(gè)莖段為1個(gè)組合,分別重復(fù)3次,觀察記錄種子及莖段的變化情況,對(duì)種子培養(yǎng)150 d以后的生長(zhǎng)情況、莖段培養(yǎng)45 d以后的生長(zhǎng)情況進(jìn)行統(tǒng)計(jì)及分析。

1.2.2 繼代增殖培養(yǎng) 培養(yǎng)基均為MS培養(yǎng)基。 將初代培養(yǎng)萌發(fā)的種子苗和腋芽新枝剪成約1 cm的莖段,接種到含不同激素配比的6種增殖培養(yǎng)基上,增殖培養(yǎng)基分別為MS+1.0 mg/L 6-BA、MS+1.0 mg/L 6-BA+0.1 mg/L IBA、MS+1.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L IBA、MS+2.0 mg/L 6-BA、MS+2.0 mg/L 6-BA+0.1 mg/L IBA、MS+2.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L IBA。培養(yǎng)條件與初代培養(yǎng)相同,每瓶接4個(gè)莖段,培養(yǎng)45 d后測(cè)量苗的高度及統(tǒng)計(jì)新轉(zhuǎn)接的培養(yǎng)瓶數(shù),每種配方統(tǒng)計(jì)測(cè)量6瓶。

1.2.3 生根培養(yǎng)及煉苗移栽 將試管苗剪去基部愈傷組織,并剪成約長(zhǎng)2 cm的莖段,接種在以下5種生根培養(yǎng)基上：1/2MS、1/2MS+0.5 mg/L IBA、1/2MS+1.0 mg/L IBA、1/2MS+1.5 mg/L IBA、1/2MS+2.0 mg/L IBA。培養(yǎng)條件與初代培養(yǎng)及繼代培養(yǎng)相同；在培養(yǎng)第45天觀察統(tǒng)計(jì)生根情況,每種配方統(tǒng)計(jì)測(cè)量6瓶。將試管苗進(jìn)行煉苗,即把培養(yǎng)瓶微開(kāi)蓋,3 d后將瓶蓋打開(kāi)1/3左右,再過(guò)3 d將瓶蓋去除,2 d之后進(jìn)行移栽,以草炭土和珍珠巖(10∶1)作為苗床基質(zhì),用消毒劑將苗床進(jìn)行消毒,移栽時(shí)盡量剪去葉片；移栽后要注意保持空氣濕度,并遮蔭養(yǎng)護(hù)。

將試管苗剪去基部愈傷組織,并剪成約長(zhǎng)2 cm的莖段,蘸1000 mg/L IBA后分別扦插在細(xì)沙+珍珠巖(20∶1)、草炭土+珍珠巖(20∶1)、椰糠+珍珠巖(20∶1)、松針?lè)?珍珠巖(20∶1)4種基質(zhì)中,將基質(zhì)分別盛放在70孔穴盤(pán)中；扦插以后放入大棚里的塑料小拱棚內(nèi),觀察生根情況,每種基質(zhì)觀察3盤(pán),并在第45天統(tǒng)計(jì)生根情況;在第75～90天將穴盤(pán)苗上營(yíng)養(yǎng)缽或進(jìn)行大田移栽。

2 結(jié)果與分析

2.1 硬齒獼猴桃外植體初代培養(yǎng)生長(zhǎng)情況

由表1和圖1可以看出,硬齒獼猴桃種子在培養(yǎng)基中需要很長(zhǎng)時(shí)間才能萌發(fā),普遍需要4個(gè)月以上才開(kāi)始萌發(fā),且在5個(gè)月后觀察統(tǒng)計(jì)時(shí),發(fā)現(xiàn)種子萌發(fā)率普遍不高,其萌發(fā)率在60%～75%。加了激素6-BA、ZT、IBA的培養(yǎng)基與不加激素的培養(yǎng)基相比,無(wú)論是種子萌發(fā)時(shí)間,還是種子萌發(fā)率均差異不明顯。在MS基本培養(yǎng)基中,種子萌發(fā)后苗長(zhǎng)高較快,基部不形成愈傷組織,最后統(tǒng)計(jì)時(shí)苗最高;而在加了不同濃度的6-BA、IBA、ZT或IBA的培養(yǎng)基上,種子萌發(fā)后基部均逐漸膨大形成或多或少的淡綠色致密的愈傷組織,但在形成的愈傷組織上沒(méi)有分化出叢生芽,苗長(zhǎng)得較慢。由此說(shuō)明,一定濃度的激素6-BA、ZT、IBA對(duì)硬齒獼猴桃種子的萌發(fā)無(wú)促進(jìn)作用,不加激素的MS基本培養(yǎng)基是硬齒獼猴桃最佳的種子啟動(dòng)培養(yǎng)基。

由表1和圖1還可見(jiàn),硬齒獼猴桃?guī)б秆康那o段腋芽萌發(fā)較快,在加有一定濃度的激素6-BA、ZT或IBA的培養(yǎng)基中一般培養(yǎng)1周腋芽就開(kāi)始萌發(fā);在不加激素的培養(yǎng)基中腋芽萌發(fā)較緩慢,需要2周多才能萌發(fā)。另外,在加有一定濃度的激素6-BA、ZT或IBA的培養(yǎng)基中腋芽的萌發(fā)率較高,基本在90%以上,而且腋芽萌發(fā)后伸長(zhǎng)較多,在45 d統(tǒng)計(jì)測(cè)量時(shí),伸長(zhǎng)的腋芽枝條平均長(zhǎng)度普遍超過(guò)3 cm;在不加激素的培養(yǎng)基中腋芽萌發(fā)較緩慢,且腋芽萌發(fā)后伸長(zhǎng)極少。另外,對(duì)比加有激素的4種培養(yǎng)基發(fā)現(xiàn)：當(dāng)細(xì)胞分裂素6-BA、ZT的濃度相同時(shí),較低濃度的生長(zhǎng)素IBA更有利于腋芽枝條的生長(zhǎng);而當(dāng)生長(zhǎng)素IBA的濃度相同時(shí),一定濃度的細(xì)胞分裂素6-BA、ZT均有利于腋芽枝條的生長(zhǎng),且6-BA和ZT差別不明顯。故MS+0.5 mg/L 6-BA+0.2 mg/L IBA可作為硬齒獼猴桃較佳的莖段腋芽的初代培養(yǎng)啟動(dòng)培養(yǎng)基。

表1 2種硬齒獼猴桃外植體在MS基本培養(yǎng)基上初代培養(yǎng)的生長(zhǎng)情況

A,種子開(kāi)始萌發(fā); B,腋芽生長(zhǎng)狀態(tài); C,繼代培養(yǎng)第45天時(shí)的增殖狀態(tài);D，培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)生根培養(yǎng)第45天時(shí)的生根狀態(tài); E，瓶外生根培養(yǎng)第45天時(shí)的生長(zhǎng)情況。

2.2 不同激素對(duì)硬齒獼猴桃不定芽分化和增殖的影響

由表2可以看出,在培養(yǎng)45 d后,不同濃度的6-BA和IBA對(duì)硬齒獼猴桃的增殖影響較顯著。當(dāng)細(xì)胞分裂素6-BA的濃度為1.0 mg/L時(shí),不加生長(zhǎng)素IBA的培養(yǎng)基中苗長(zhǎng)得也較高,只是苗的基部基本上沒(méi)有愈傷組織形成,形成的叢生芽極少,其增殖系數(shù)最低,但也達(dá)到了4.6;而在加較低濃度生長(zhǎng)素IBA的培養(yǎng)基中苗長(zhǎng)得最高,苗的基部有較少的愈傷組織形成,但叢生芽分化較少,增殖系數(shù)稍高;在加較高濃度生長(zhǎng)素IBA的培養(yǎng)基中苗長(zhǎng)得較高,苗的基部有較多的愈傷組織形成,叢生芽分化也較多,增殖系數(shù)較高。當(dāng)細(xì)胞分裂素6-BA的濃度為2.0 mg/L時(shí),在不加生長(zhǎng)素IBA的培養(yǎng)基中苗長(zhǎng)得較高,只是苗的基部基本上沒(méi)有愈傷組織形成,形成的叢生芽極少,其增殖系數(shù)較低;而在加較低濃度生長(zhǎng)素IBA的培養(yǎng)基中苗長(zhǎng)得稍高一些,苗的基部有較少的愈傷組織形成,叢生芽分化較少,增殖系數(shù)也較低;在加較高濃度生長(zhǎng)素IBA的培養(yǎng)基中苗長(zhǎng)得最矮,但苗的基部有較多的愈傷組織形成,此時(shí)叢生芽分化最多,增殖系數(shù)最高,達(dá)到7.4。由此可見(jiàn),較高濃度的生長(zhǎng)素IBA有利于硬齒獼猴桃愈傷組織的形成,而且較高濃度的細(xì)胞分裂素6-BA的協(xié)同作用有利于其叢生芽的分化。培養(yǎng)基MS+2.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L IBA較有利于硬齒獼猴桃的增殖。

表2 不同激素對(duì)硬齒獼猴桃不定芽分化和增殖的影響

2.3 生根培養(yǎng)及煉苗移栽

2.3.1 不同濃度生長(zhǎng)素IBA對(duì)硬齒獼猴桃培養(yǎng)基內(nèi)生根的影響 由表3可以看出,無(wú)論加不加生長(zhǎng)素IBA,所有培養(yǎng)基中苗基部或多或少均形成愈傷組織,根原基形成一般均需1周左右。在不加生長(zhǎng)素IBA的培養(yǎng)基中，根基部愈傷組織較小,生根率達(dá)到100%;而在加有生長(zhǎng)素IBA的培養(yǎng)基中,根基部愈傷組織均較大,且濃度越高,愈傷組織通常越大,極少量的苗只有愈傷組織但不長(zhǎng)根,生根率略有降低;在不加生長(zhǎng)素IBA或加有較高濃度 IBA的培養(yǎng)基中，苗長(zhǎng)得較高,平均根長(zhǎng)也較長(zhǎng);隨著IBA濃度的增高,生根數(shù)逐漸增多,在加較高濃度IBA的培養(yǎng)基中苗最高,平均根長(zhǎng)最長(zhǎng),根數(shù)也最多。綜合來(lái)看,1/2MS基本培養(yǎng)基是硬齒獼猴桃較佳的生根培養(yǎng)基。

表3 IBA濃度對(duì)硬齒獼猴桃培養(yǎng)基內(nèi)生根的影響

2.3.2 不同基質(zhì)對(duì)硬齒獼猴桃培養(yǎng)瓶外生根的影響 由表4可以看出：當(dāng)細(xì)沙+珍珠巖作為基質(zhì)時(shí),硬齒獼猴桃的生根率較低,開(kāi)始生根的時(shí)間也較長(zhǎng),生根后苗也長(zhǎng)高較少;而在草炭+珍珠巖、椰糠+珍珠巖、松針?lè)?珍珠巖3種基質(zhì)中，硬齒獼猴桃長(zhǎng)根較快,生根率也較高,生根后苗也長(zhǎng)高較多,其中在草炭+珍珠巖、椰糠+珍珠巖基質(zhì)上生根率稍高,在椰糠+珍珠巖上苗生根后長(zhǎng)高最多。綜合來(lái)看,椰糠+珍珠巖(20∶1)是硬齒獼猴桃較好的培養(yǎng)瓶外生根基質(zhì)。

表4 不同基質(zhì)對(duì)硬齒獼猴桃培養(yǎng)瓶外生根的影響

3 討論與結(jié)論

在本實(shí)驗(yàn)中,一定濃度的細(xì)胞分裂素6-BA、ZT與較低濃度的生長(zhǎng)素IBA協(xié)同作用有利于硬齒獼猴桃腋芽枝條的萌發(fā)及生長(zhǎng);當(dāng)IBA的濃度相同時(shí),一定濃度的6-BA、ZT均有利于腋芽枝條的生長(zhǎng)。因?yàn)橛衩姿豘T是一種價(jià)格非常昂貴的激素,而6-BA又比較便宜,因此在今后硬齒獼猴桃初代培養(yǎng)腋芽萌發(fā)及生長(zhǎng)時(shí),宜選用6-BA而不用ZT,這樣能有效降低硬齒獼猴桃組培苗的生產(chǎn)成本,有利于其下一步產(chǎn)業(yè)化發(fā)展。

在硬齒獼猴桃培養(yǎng)基內(nèi)生根誘導(dǎo)時(shí),加了生長(zhǎng)素IBA以后,苗基部形成了較大的愈傷組織,這會(huì)對(duì)今后的煉苗移栽造成一定程度的影響,甚至?xí)档蜔捗缫圃缘拇婊盥省?/p>

另外,培養(yǎng)基內(nèi)誘導(dǎo)生根和瓶外基質(zhì)內(nèi)扦插均能使硬齒獼猴桃高效生根,但兩種方式各有優(yōu)缺點(diǎn)。在培養(yǎng)基內(nèi)誘導(dǎo)生根,當(dāng)試管苗開(kāi)始生根以后,苗迅速長(zhǎng)高,在第45天統(tǒng)計(jì)時(shí),苗長(zhǎng)高了2～3倍,但整個(gè)過(guò)程需在超凈工作臺(tái)上無(wú)菌操作完成,費(fèi)時(shí)費(fèi)力,且需要進(jìn)行后期的基質(zhì)內(nèi)煉苗移栽。在瓶外基質(zhì)內(nèi)扦插,苗長(zhǎng)根后生長(zhǎng)較緩慢,但整個(gè)過(guò)程無(wú)需超凈工作臺(tái),可以聘請(qǐng)大量工人在短時(shí)間內(nèi)完成扦插,且生根后養(yǎng)護(hù)一段時(shí)間后可直接上營(yíng)養(yǎng)缽或進(jìn)行大田移栽,即將“生根”與“煉苗移栽”同步進(jìn)行。因此,瓶外基質(zhì)內(nèi)扦插更有利于硬齒獼猴桃的工廠化育苗及其產(chǎn)業(yè)化開(kāi)發(fā)。

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),雖然硬齒獼猴桃在松針?lè)?珍珠巖上生根率較低,但是松針?lè)鄣某杀据^低,因此在一些松針較豐富的地方,可以選用松針?lè)?珍珠巖作為硬齒獼猴桃的生根基質(zhì)。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：在初代培養(yǎng)階段,一定濃度的激素6-BA、ZT、IBA對(duì)硬齒獼猴桃的種子萌發(fā)無(wú)促進(jìn)作用,不加激素的MS基本培養(yǎng)基是硬齒獼猴桃最佳的種子啟動(dòng)培養(yǎng)基; MS+0.5 mg/L 6-BA+0.2 mg/L IBA可作為硬齒獼猴桃較佳的莖段初代培養(yǎng)啟動(dòng)培養(yǎng)基；在繼代培養(yǎng)階段, MS+2.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L IBA較有利于硬齒獼猴桃的增殖；在生根階段,1/2MS基本培養(yǎng)基是硬齒獼猴桃較佳的生根培養(yǎng)基;椰糠+珍珠巖(20∶1)是硬齒獼猴桃較好的培養(yǎng)瓶外生根基質(zhì)。