崔曉宇，熊正英

(安康學(xué)院 體育學(xué)院，陜西 安康 725000)

生物膜ATPase包括有sodium,potassium-adenine nucleoside triphosphatase(Na+,K+-ATPase，簡稱EⅠ)、calcium-adenine nucleoside triphosphatase(Ca2+-ATPase，簡稱EⅡ)和magnesium-adenine nucleoside triphosphatase(Mg2+-ATPase，簡稱E Ⅲ)，它們參與細(xì)胞內(nèi)外Na+、K+、Ca2+和Mg2+離子的主動轉(zhuǎn)運(yùn)[1]，在跨膜電勢能的產(chǎn)生、調(diào)節(jié)細(xì)胞滲透壓、維維持神經(jīng)和肌肉細(xì)胞的沖動傳導(dǎo)、營養(yǎng)物質(zhì)吸收等方面起著重要作用[2-4]。在大強(qiáng)度運(yùn)動訓(xùn)練時，機(jī)體會產(chǎn)生大量的自由基，對胞膜發(fā)生攻擊，導(dǎo)致細(xì)胞膜氧化損傷，細(xì)胞膜上的ATP酶同樣受到自由基的氧化，使其結(jié)構(gòu)破壞，EⅠ、EⅡ和E Ⅲ活性降低，引起細(xì)胞內(nèi)環(huán)境紊亂，細(xì)胞功能下降，產(chǎn)生運(yùn)動疲勞。多糖尤其是富硒茶多糖具有抗氧化、消除自由基的能力已有研究[5-6]，富硒茶多糖是否可以保護(hù)ATPase活性尚未見報道。本實(shí)驗(yàn)選取陜西省紫陽縣富硒茶葉為原料[7-10]，提取多糖物喂養(yǎng)大強(qiáng)度耐力訓(xùn)練大鼠，測試了不同組織，EⅠ、EⅡ和E Ⅲ活性影響，探討了富硒茶多糖對大鼠運(yùn)動能力影響的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)對象 Sprague-Dawley(SD)雄性健康大鼠30只，體重180～220 g，由西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心提供，同時購入基礎(chǔ)飼料。國家標(biāo)準(zhǔn)嚙齒類動物干燥飼料喂養(yǎng)，自由飲食，動物室溫度23±5 ℃，相對濕度40%～70%，照明時間隨自然變化，分籠適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.1.2 富硒茶多糖的分離提取 茶葉由陜西省紫陽縣盤龍?zhí)烊桓晃G茶有限公司提供，富硒茶多糖提取參照文獻(xiàn)[11]的方法進(jìn)行，富硒茶多糖中多糖含量為53.50%、蛋白質(zhì)含量為3.50%、硒含量為2 μg/g。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)動物模型的建立 實(shí)驗(yàn)動物適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d后，以15 m/min，5 min/d運(yùn)動對照組量，對動物進(jìn)行為期3 d的篩選，淘汰不適應(yīng)跑臺訓(xùn)練的大鼠，將剩余大鼠隨機(jī)分為安靜組(Quiet group，Q組)、運(yùn)動組(Exercise group，E組)、運(yùn)動加藥組(Exercise dosing group，ED組)，每組均為8只。E組、ED組大鼠每天訓(xùn)練前以15 m/min×5 min的適應(yīng)訓(xùn)練組后正式訓(xùn)練，訓(xùn)練模型基于Bedford等[12]模型結(jié)合實(shí)際略加調(diào)整，其中第1～2周的運(yùn)動時間為20 min，運(yùn)動速度分別是15.0、15.2 m/min ，坡度分別為0、5°；第3～5周的運(yùn)動時間為30 min，運(yùn)動速度分別是15.2、26.8、26.8(m/min)，坡度均為5°；第6周的運(yùn)動速度為26.8 m/min，坡度為10°；運(yùn)動強(qiáng)度用最大攝氧量(maximum oxygen uptake，VO2max)表示，第1～6周的運(yùn)動強(qiáng)度分別為58.4±1.7、58.4±1.7、58.4±1.7、74.3±2.9、74.3±2.9、81.0±3.5 mL/(kg·min)。運(yùn)動訓(xùn)練第6周的最后一天進(jìn)行運(yùn)動至力竭時間(min)的測試，力竭判定標(biāo)準(zhǔn)參照文獻(xiàn)[13]。

1.2.2 藥物灌胃 每次運(yùn)動結(jié)束后運(yùn)動加藥組大鼠茶多糖溶液，灌胃劑量為100 mg/(kg·d)，安靜對照組、運(yùn)動對照組大鼠灌胃等體積的生理鹽水[5]，灌胃時間為每天上午8：00，其他兩組灌服給同等量的生理鹽水作為對照，實(shí)驗(yàn)共6周。

1.2.3 取材與測試樣品制備 第6周的最后一天，E組和ED組在力竭運(yùn)動后記錄力竭時間后，3組大鼠分別用20%烏拉坦(0.5 mL/kg體重)腹腔麻醉，斷頭取血，并迅速取大腦、肝臟、股四頭肌、腎臟和心臟5種組織，分別放入(4 ℃)生理鹽水中，洗凈血污，用濾紙吸干后置于-20 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 測試樣品制備 取適量組織(0.2～1.0 g)，按組織塊重量(g)∶勻漿介質(zhì)(mL)=1∶9的比例，加4 ℃的勻漿介質(zhì)(0.9% NaCl溶液)，在冰浴中進(jìn)行勻漿，然后3000 r/min低溫離心10～15 min，取上清液作為各指標(biāo)測試的樣品。

1.2.5 生物化學(xué)指標(biāo)測試 雙縮脲法測定蛋白質(zhì)含量，定磷法測定ATPase活性。蛋白質(zhì)含量和ATPase活性均采用南京建成生物工程研究所研制的試劑盒測定，具體操作按照說明書提供的方法進(jìn)行，蛋白質(zhì)定量和ATPase活性單位(U)計(jì)算按照說明書提供的公式進(jìn)行。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，數(shù)據(jù)用均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，并進(jìn)行t檢驗(yàn)，P<0.05表示具有顯著性差異，P<0.01表示極顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 富硒茶多糖對耐力訓(xùn)練大鼠不同組織Na+,K+-ATPase(EⅠ)活性的影響

由表1可知，與Q組比較：E組大鼠的肝臟、腎臟組織的EⅠ活性差異顯著，心臟、大腦、股四頭肌等組織的EⅠ活性差異極顯著；ED組的肝臟、腎臟等組織EⅠ活性沒有顯著性差異，心臟、大腦、股四頭肌等組織EⅠ活性差異較為顯著。與E組比較：ED組的各組織中的EⅠ活性均有升高，肝臟、股四頭肌等組織的EⅠ活性差異顯著，心臟、大腦、腎臟等組織的EⅠ活性差異極顯著，大腦、肝臟、股四頭肌、腎臟和心臟等組織的EⅠ活性分別升高19.07%、10.87%、11.35%、13.67%和28.26%，其中心臟EⅠ活性升高幅度最大。

表1 不同組織Na+,K+-ATPase(EⅠ)活性的測定結(jié)果

注：與Q組比較，*：P<0.05，**：P<0.01；與E組較，#：P<0.05，##：P<0.01。每組的樣本數(shù)為8，ATPase活性單位：μmol pi/(mg prot·h)，下同。

2.2 富硒茶多糖對耐力訓(xùn)練大鼠不同組織Ca2+-ATPase(EⅡ)活性的影響

由表2可知，與Q組比較：E組大鼠不同組織中的EⅡ活性下降，肝臟、大腦、股四頭肌等組織EⅡ活性差異顯著，心臟、腎臟等組織EⅡ活性差異極顯著；ED組肝臟、腎臟、大腦組織等組織EⅡ活性差異不顯著，心臟、股四頭肌等組織的EⅡ活性差異顯著。與E組比較：ED組大鼠不同組織EⅡ活性均有升高，腎臟、大腦等組織的EⅡ活性差異顯著，心臟、股四頭肌、肝臟等組織EⅡ活性差異極顯著，大鼠大腦、肝臟、股四頭肌、腎臟和心臟等組織的EⅡ活性分別升高6.07%、23.80%、21.31%、16.52%和19.67%，其中肝臟EⅡ活性升高幅度最大。

表2 不同組織Ca2+-ATPase(EⅡ)活性的變化

2.3 富硒茶多糖對訓(xùn)練大鼠不同組織Mg2+-ATPase(EⅢ)活性的影響

由表3可知，與Q組比較：E組大鼠的EⅢ活性下降，腎臟、肝臟等組織EⅢ活性差異顯著，心臟、大腦、股四頭肌等組織EⅢ差異極顯著；ED組5個組織的酶活性下降，均達(dá)到顯著水平。與E組比較：ED組大鼠不同組織EⅢ活性均有升高，其中腎臟、大腦、股四頭肌、肝臟等組織的EⅢ活性差異顯著，心臟的EⅢ活性差異極顯著，大鼠心臟、腎臟、大腦、股四頭肌、肝臟等組織等組織的EⅢ活性分別升高11.01%、7.11%、11.48%、8.65%和29.61%，其中心臟的EⅢ活性升高幅度最大。

表3 不同組織Mg2+-ATPase(EⅢ)活性的變化

2.4 富硒茶多糖對大強(qiáng)度耐力訓(xùn)練大鼠跑臺至力竭時間的影響

測試結(jié)果顯示，運(yùn)動對照組大鼠跑臺運(yùn)動至力竭時間的為91.77±12.55 min，運(yùn)動加藥組為112.45±14.21 min，力竭延緩率為18.39%(P<0.01)。

3 小結(jié)

ATPase是不對稱地鑲嵌在細(xì)胞膜內(nèi)的一種酶[17]，ATPase具有載體和酶的雙重作用，它能促進(jìn)ATP水解，釋放能量。3種ATPase是橫跨細(xì)胞膜運(yùn)輸Na+、K+、Ca2+、Mg2+的的載體，它們可驅(qū)動Na+、K+、Ca2+、Mg2+跨膜運(yùn)輸，使細(xì)胞內(nèi)金屬離子適宜分布，從而維持細(xì)胞內(nèi)外滲透壓平衡；Na+、K+、Ca2+、Mg2+梯度還對維持肌細(xì)胞的收縮與舒張、跨膜電勢能的產(chǎn)生、細(xì)胞滲透壓的維持、營養(yǎng)物質(zhì)的吸收、提高大鼠的運(yùn)動能力等方面有著重要的作用[18-21]。長時間大強(qiáng)度運(yùn)動時，會產(chǎn)生過多的自由基，損傷細(xì)胞膜，導(dǎo)致細(xì)胞膜發(fā)生脂質(zhì)過氧化[22]，膜結(jié)構(gòu)的完整性和流動性降低，甚至喪失，鑲嵌在細(xì)胞膜上的Na+,K+-ATPase、Ca2+-ATPase、Mg2+-ATPase的結(jié)構(gòu)與功能遭到破壞，導(dǎo)致3種ATPase活性下降，以至于影響胞膜Na+、K+、Ca2+、Mg2+的正常交換，從而造成細(xì)胞內(nèi)環(huán)境紊亂，能量釋放障礙，ATP合成減少，輸出功率下降，機(jī)體產(chǎn)生運(yùn)動性疲勞[23-26]。富硒茶多糖具有抗氧化作用，可以抑制上述現(xiàn)象的發(fā)生[27]。

富硒茶多糖對大鼠運(yùn)動能力影響的機(jī)制是通過維持大鼠各組織細(xì)胞膜、線粒體等亞細(xì)胞器結(jié)構(gòu)和功能的完整性，提高各組織Na+,K+-ATPase、Ca2+-ATPase和Mg2+-ATPase的活性，維持細(xì)胞滲透壓、膜電位的平衡，提高機(jī)體能量供應(yīng)，保證神經(jīng)和肌肉細(xì)胞沖動的傳導(dǎo)。服用富硒茶多糖大鼠運(yùn)動至力竭的時間較E組延長，變化率為18.39%，顯示富硒茶多糖具有延緩運(yùn)動性疲的作用。