程于夢(mèng),楊夢(mèng)艷,于潤(rùn)浩,李德喜

(河南農(nóng)業(yè)大學(xué) 牧醫(yī)工程學(xué)院,河南 鄭州 450046)

葡萄球菌(Staphylococci)是一種化膿性革蘭氏陽(yáng)性球菌,在自然界中普遍存在,能夠產(chǎn)生外毒素(腸毒素),可能導(dǎo)致家禽出現(xiàn)敗血癥等多種病癥,在豬身上表現(xiàn)為出現(xiàn)滲出性皮炎等癥狀,是引起人類食物中毒和動(dòng)物細(xì)菌感染的重要微生物。近年來(lái),人們治療細(xì)菌感染的首選藥物就是抗生素,在抗生素的壓力下,細(xì)菌產(chǎn)生了耐藥性,甚至出現(xiàn)了“超級(jí)細(xì)菌”。2011年,世界衛(wèi)生組織將“控制抗生素耐藥性”作為世界衛(wèi)生日的主題,這標(biāo)志著細(xì)菌耐藥性將成為21世紀(jì)面臨的最嚴(yán)重的問(wèn)題之一。

利奈唑胺(linezolid)是美國(guó)FDA在2000年新批準(zhǔn)的惡唑烷酮類藥物,該藥物的作用機(jī)制獨(dú)特,細(xì)菌對(duì)其的耐藥比例較低[1-3]。在細(xì)菌對(duì)利奈唑胺耐藥的機(jī)制中,除了核糖體L3、L4和23S rRNA突變外,質(zhì)粒介導(dǎo)的cfr基因?qū)υ擃愃幬锏哪退幰舶l(fā)揮了重要作用[4]。目前cfr基因在葡萄球菌和腸球菌中的流行情況越來(lái)越嚴(yán)重,因此應(yīng)該逐步加強(qiáng)對(duì)cfr基因的監(jiān)測(cè)與防控。

cfr基因是Schwarz等在2000年從呼吸道感染的小牛鼻腔拭子中分離的松鼠葡萄球菌上首次發(fā)現(xiàn)的。通過(guò)質(zhì)粒分析試驗(yàn)和抗生素敏感性測(cè)定，發(fā)現(xiàn)該菌株攜帶1個(gè)17.1 kb的質(zhì)粒pSCFS1[5]；該質(zhì)粒包含1個(gè)編碼349個(gè)氨基酸序列的開放閱讀框,能夠介導(dǎo)氯霉素和氟苯尼考耐藥,因此將之命名為cfr(Chloramphenieol florlenicol resistance)[6]；cfr基因主要通過(guò)基因編碼修飾RNA甲基轉(zhuǎn)移酶23S rRNA基因第2503位的腺嘌呤殘基引起細(xì)菌核糖體甲基化,阻止作用于肽基轉(zhuǎn)移酶中心的許多抗生素的結(jié)合,減少或消除抗生素的功能，實(shí)現(xiàn)對(duì)藥物產(chǎn)生抗性[7]。

本研究發(fā)現(xiàn)了1株耐多藥的葡萄球菌株,該菌株對(duì)四環(huán)素、酰胺醇類和惡唑烷酮類藥物耐藥。本文主要探究了何種耐藥機(jī)制導(dǎo)致該菌株多重耐藥的形成。

1 材料與方法

1.1 工程菌株、實(shí)驗(yàn)藥品和試劑

金黃色葡萄球菌RN4220，由本實(shí)驗(yàn)室保存；氟苯尼考，購(gòu)自浙江海翔藥業(yè)有限公司；利奈唑胺，購(gòu)自美侖藥業(yè)公司；四環(huán)素，購(gòu)自湖北恒碩制藥有限公司；環(huán)丙沙星，購(gòu)自山東金太陽(yáng)制藥有限公司；慶大霉素，購(gòu)自江蘇漣水制藥有限公司；氯霉素、紅霉素，購(gòu)自中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所； Premix Taq酶，購(gòu)自寶生生物有限公司； DL2000 DNA Marker，購(gòu)自北京百泰克生物技術(shù)有限公司；細(xì)菌DNA提取試劑盒，購(gòu)自天根生化科技有限公司；質(zhì)粒中提提取純化試劑盒，購(gòu)自德國(guó)Qiagen公司。

1.2 野生菌株的分離與鑒定

將本實(shí)驗(yàn)室于-80 ℃保存的野生株在顯色培養(yǎng)基瓊脂板上畫線,置于37 ℃恒溫箱培養(yǎng)24 h；用無(wú)菌接種環(huán)挑取培養(yǎng)長(zhǎng)出的白色或粉色單菌落，重新接種于顯色培養(yǎng)基瓊脂板上進(jìn)行純化增菌培養(yǎng)；從培養(yǎng)基上挑取白色或粉色的葡萄球菌單菌落,接種于2 mL的氯化鈉肉湯中,放置于37 ℃恒溫?fù)u床上，以210 r/min震蕩培養(yǎng)過(guò)夜,然后保存菌液，及時(shí)進(jìn)行細(xì)菌DNA基因組的制備。

從NCBI Genbank中調(diào)出cfr、tet(M)、erm(B)基因序列,采用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)引物,對(duì)野生株STR-9進(jìn)行16S rRNA細(xì)菌種屬鑒定。將引物送至北京六合華大基因科技有限公司進(jìn)行合成。用于PCR擴(kuò)增的引物序列見表1。

表1 cfr與tet(M)的PCR擴(kuò)增引物序列

1.3 藥物敏感性試驗(yàn)

細(xì)菌對(duì)藥物的敏感性試驗(yàn)采用微量肉湯稀釋法,以金黃色葡萄球菌工程菌RN4200為質(zhì)控菌。藥敏試驗(yàn)需要的藥物包括氯霉素、氟苯尼考、利奈唑胺、四環(huán)素、紅霉素、沃尼妙林、慶大霉素、環(huán)丙沙星、鏈霉素、利福平等。藥物敏感性的判定按照美國(guó)臨床微生物藥敏試驗(yàn)判定標(biāo)準(zhǔn)[8]執(zhí)行。當(dāng)?shù)?2孔陰性對(duì)照無(wú)菌落生長(zhǎng),而第11孔陽(yáng)性對(duì)照有明顯生長(zhǎng)時(shí),讀取該次藥敏試驗(yàn)結(jié)果。

1.4 電轉(zhuǎn)化試驗(yàn)

提取野生菌株STR-9的質(zhì)粒:使用德國(guó)Qiagen公司的試劑盒提取質(zhì)粒DNA；將培養(yǎng)菌液1 mL接種于300 mL BHI肉湯中，于37 ℃恒溫?fù)u床中培養(yǎng)過(guò)夜。

制備感受態(tài)細(xì)胞:將金黃色葡萄球菌RN4200接種于BHI肉湯中,于37 ℃恒溫?fù)u床中培養(yǎng)；在培養(yǎng)2 h后,每隔15～20 min在578 nm波長(zhǎng)處測(cè)定1次菌液的OD值,當(dāng)OD值達(dá)到0.5～0.6時(shí)開始制備感受態(tài)細(xì)胞[9]；在制備完成后，將RN4220感受態(tài)細(xì)胞按照100 μL等份分裝于1.5 mL離心管中,保存于-80 ℃冰箱，備用。

電轉(zhuǎn)化試驗(yàn)[9]:將轉(zhuǎn)化后的菌株涂布于含有氟苯尼考(終濃度為10 mg/L)的BHI瓊脂中，于37 ℃恒溫箱中培養(yǎng)24～48 h,觀察電轉(zhuǎn)子的生長(zhǎng)情況。

2 結(jié)果與分析

對(duì)野生株STR-9進(jìn)行16S rRNA細(xì)菌種屬鑒定,測(cè)序結(jié)果顯示該野生株為松鼠葡萄球菌。從圖1和圖2擴(kuò)增結(jié)果可以看出在STR-9的基因組中存在cfr與tet(M)[10]耐藥基因。從表2藥敏試驗(yàn)結(jié)果[8]可以看出,標(biāo)示為野生株的松鼠葡萄球菌STR-9對(duì)氯霉素、氟苯尼考、利奈唑胺、四環(huán)素、沃尼妙林、慶大霉素和鏈霉素表現(xiàn)耐藥；根據(jù)STR-9對(duì)利福平、紅霉素表現(xiàn)出高度耐藥的試驗(yàn)結(jié)果，其可能含有相應(yīng)的erm(B)耐藥基因；對(duì)STR-9的基因組進(jìn)行erm(B)耐藥基因的PCR擴(kuò)增,試驗(yàn)結(jié)果顯示為陽(yáng)性。

M, Marker; 1, STR-9。

獲得的電轉(zhuǎn)子DT-9對(duì)氟苯尼考、沃尼妙林、四環(huán)素和利奈唑胺等抗生素表現(xiàn)耐藥,對(duì)鏈霉素、環(huán)丙沙星和利福平表現(xiàn)為敏感,表示未攜帶上述抗生素的耐藥基因。對(duì)電轉(zhuǎn)子DT-9進(jìn)行cfr、tet(M)與erm(B)基因擴(kuò)增,cfr、tet(M)結(jié)果均為陽(yáng)性,而erm(B)基因并未檢出,說(shuō)明cfr、tet(M)耐藥基因位于STR-9的質(zhì)粒上,而erm(B)基因可能位于該野生株的染色體上,且cfr與tet(M)耐藥基因可以隨質(zhì)粒的移動(dòng)進(jìn)行轉(zhuǎn)移。測(cè)序結(jié)果分析發(fā)現(xiàn),cfr和tet(M)基因共存于同一質(zhì)粒,質(zhì)粒結(jié)構(gòu)見圖3。

M, Marker; 1, STR-9。

表2 cfr陽(yáng)性葡萄球菌和電轉(zhuǎn)子藥敏試驗(yàn)結(jié)果

注: CHL,氯霉素; FFC,氟苯尼考; LZD,利奈唑胺; TET,四環(huán)素; ERY,紅霉素; VAL,沃尼妙林; GEN,慶大霉素; CIP,環(huán)丙沙星; STR,鏈霉素; RIF,利福平。

圖3 全質(zhì)粒測(cè)序分析結(jié)果

3 討論

通過(guò)對(duì)cfr基因的研究現(xiàn)已證實(shí),cfr基因至少可以導(dǎo)致5類藥物(酰胺醇類、惡唑烷酮類、截短側(cè)耳素類、林可胺類、鏈陽(yáng)菌素A類)耐藥。本研究發(fā)現(xiàn)了1株對(duì)多種藥物耐藥的葡萄球菌,經(jīng)PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)其含有cfr基因；電轉(zhuǎn)化試驗(yàn)及藥敏試驗(yàn)結(jié)果證明,該菌不僅對(duì)上述5類化學(xué)結(jié)構(gòu)不同的藥物耐藥,并同時(shí)含有四環(huán)素的耐藥表型,且tet(M)結(jié)果為陽(yáng)性；分析發(fā)現(xiàn)其cfr基因和四環(huán)素耐藥基因tet(M)共存于同一質(zhì)粒,在遺傳元件的參與下容易擴(kuò)散轉(zhuǎn)移,并且該菌株的質(zhì)粒通過(guò)電轉(zhuǎn)化試驗(yàn)可以轉(zhuǎn)移到金黃色葡萄球菌RN4200感受態(tài)細(xì)胞中,證明了該質(zhì)粒的可移動(dòng)性,這種現(xiàn)象可能是在抗生素的選擇壓力下促成的,因此,我們要加強(qiáng)多藥耐藥基因cfr的監(jiān)測(cè)與防控。

據(jù)相關(guān)研究報(bào)道,cfr基因大多位于質(zhì)粒上,易于在動(dòng)物源、環(huán)境和人之間進(jìn)行水平傳播并轉(zhuǎn)移擴(kuò)散,cfr基因陸續(xù)在多種動(dòng)物中被發(fā)現(xiàn),如雞、鴨、豬的葡萄球菌,豬、牛等動(dòng)物的腸球菌[11]。在腸球菌和芽孢桿菌中分離得到了cfr基因[12-15],發(fā)現(xiàn)了與cfr基因共存于同一質(zhì)粒的其他基因,如cfr與erm(A)、cfr與erm(A)基因共存于芽孢桿菌同一質(zhì)粒中；erm(A)表現(xiàn)出對(duì)大環(huán)內(nèi)酯類抗生素耐藥,而且它很可能發(fā)生變異,因而會(huì)加大治療細(xì)菌感染的難度。已有報(bào)道證明具有可轉(zhuǎn)移性的基因cfr和optrA共存于葡萄球菌質(zhì)粒中[16],如果這種現(xiàn)象擴(kuò)散到人醫(yī)臨床,必將嚴(yán)重影響臨床治療的效果。

綜上所述,如何減少cfr耐藥基因在葡萄球菌的出現(xiàn),從而延長(zhǎng)酰胺醇類與惡唑烷酮類抗生素的使用壽命已經(jīng)成為一個(gè)全球關(guān)注的熱點(diǎn)問(wèn)題,同時(shí)對(duì)其耐藥機(jī)制進(jìn)行深入研究,開發(fā)新型抗生素等迫在眉睫。為了減少多重耐藥基因cfr的進(jìn)一步擴(kuò)散,我們要加強(qiáng)對(duì)該基因的監(jiān)測(cè)與防控。