李小玲，韓 潔，侯 瑤，華智銳

(商洛學(xué)院 生物醫(yī)藥與食品工程學(xué)院，陜西 商洛 726000)

植物在其生長發(fā)育過程中常常遭受生物因子及各種非生物因子的脅迫，其中非生物因子是主要的危害因素。近年來，頻繁的人類活動排放了大量的溫室氣體，致使全球氣溫不斷上升，隨著全球氣候變暖，極端天氣的頻繁發(fā)生，如局部地區(qū)的異常干旱、高溫等已成為影響植物生長發(fā)育的重要環(huán)境因子。研究發(fā)現(xiàn)，在干旱、高溫互作下，植物體內(nèi)積累大量的有害物質(zhì)，如活性氧，引起膜質(zhì)過氧化作用，抑制植物的光合作用，降低植物體內(nèi)水分利用效率，最終導(dǎo)致植物生長發(fā)育受阻和形態(tài)發(fā)生變化。為了抵御干旱高溫對植物體的傷害，植物通過自身保護機制以降低逆境對其造成的傷害[1]。干旱、高溫不僅影響植物的生理生態(tài)過程，還成為限制植物的分布、生長和生產(chǎn)力的重要生態(tài)因子[2]。

杜鵑花是杜鵑花屬(Rhododendron)植物的統(tǒng)稱，屬于世界三大高山野生花卉之一，具有極高的觀賞及園林應(yīng)用價值[3]。據(jù)調(diào)查，世界杜鵑花屬植物約有967種，我國作為世界杜鵑花資源最為豐富的地區(qū)，分布有原生種571種，其中特有種約409種，占國有種的71.6%[4]。而秦嶺地區(qū)的野生杜鵑花屬植物共有28種，占我國杜鵑花種類的5.1%[5]。秦嶺是我國杜鵑花分布的重要區(qū)域之一，且單種蘊藏量較大，耐寒性較強。秦嶺野生的杜鵑花植物作為西北地區(qū)急需開發(fā)的野生資源之一，其花朵鮮艷、枝葉繁茂，且能藥食兩用，具有極高的觀賞價值和開發(fā)利用價值[5]。杜鵑花屬植物常叢生為密不可分的灌木林，因其密集的枝條、發(fā)達(dá)的根系，在耐受極端的高山氣候環(huán)境、保持高山土壤、防止山體滑坡等方面起到作用，著稱優(yōu)良的山地水土保持植物[6]。地處商洛市鎮(zhèn)安縣的國家木王林場中分布有秀雅杜鵑(R.concinnum)、美容杜鵑(R.calophytum)、頭花杜鵑(R.capitatum)、照山白(R.micranthum)等，其中美容杜鵑的數(shù)量最多并且分布面積最廣[7]。杜鵑花生態(tài)習(xí)性為喜冷涼、多霧、濕潤氣候，忌高溫干旱，較耐陰，光照過強常引起植株失水、葉片黃化，甚至造成日灼；光照不足影響光合作用和開花結(jié)果數(shù)量。故此，開展高山杜鵑干旱高溫互作機理的研究能為杜鵑的引種栽培提供理論參考。

目前對高山杜鵑抗逆性方面的研究大多集中于耐寒或耐高溫等單一逆境因子方面[8-11]，而對于干旱高溫雙重脅迫研究尚未見報道。鑒于此，本研究以秦嶺高山杜鵑為材料，探討其在干旱高溫互作下的生長表現(xiàn)及葉片相應(yīng)生理生化指標(biāo)的變化，從理論上揭示高山杜鵑對高溫脅迫的生理生態(tài)適應(yīng)機制，豐富杜鵑花的生理研究內(nèi)容，并通過對干旱高溫互作下生理生化指標(biāo)響應(yīng)的研究及主因子的分析，為耐干旱高溫種質(zhì)的遺傳改良和人工引種栽培提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗材料試驗所用高山杜鵑幼苗于2017年3月上旬采自商洛市鎮(zhèn)安縣國家木王林場海拔1500 m左右的杜鵑花景區(qū)。

1.2 試驗方法

1.2.1 杜鵑幼苗的預(yù)培養(yǎng) 將采集的大小一致、生長狀態(tài)良好的兩年生高山杜鵑實生苗移栽到直徑20 cm的花盆中，每盆栽兩株，培養(yǎng)基質(zhì)為腐葉土∶松針土=1∶2，每天傍晚適時噴灑0.1%～0.5%的硫酸亞鐵保持70%～80%的相對濕潤，在人工氣候箱中25～27 ℃培養(yǎng)1周。

1.2.2 試驗設(shè)計 配制濃度為10%、15%、20%聚乙二醇(PEG-6000)溶液，設(shè)輕度干旱脅迫 (10% PEG)、中度干旱脅迫 (15% PEG)、重度干旱脅迫 (20% PEG)處理。在人工氣候箱中進(jìn)行溫度處理?？諝庀鄬穸葹?5%，光照時間為12 h/d，光照強度為3級；設(shè) 25 ℃(對照)、33 ℃(輕度高溫脅迫)、40 ℃(重度高溫脅迫)3個溫度梯度。干旱與溫度交叉結(jié)合對高山杜鵑幼苗進(jìn)行脅迫處理(表1)，每天下午18：00對高山杜鵑幼苗葉片噴灑PEG-6000進(jìn)行干旱脅迫，以室溫栽培和噴灑蒸餾水的植物為對照(CK)。每處理3次重復(fù)，每次重復(fù)3株苗。處理后隔天采樣，立即剪下適宜的葉片，洗凈，用蒸餾水沖洗，除去葉脈后剪碎，用于測定MDA含量、脯氨酸含量、可溶性蛋白含量等生理指標(biāo)。

表1 干旱高溫互作試驗設(shè)計

1.2.3 生理指標(biāo)的測定脯氨酸含量的測定參照李小方[12]的茚三酮法，相對電導(dǎo)率的測定參照陳建勛等[13]的浸泡法，MDA含量的測定參照張志良等[14]的硫代巴比妥酸法，SOD活性的測定參照李合生[15]的氮藍(lán)四唑(NBT)光還原法，POD活性的測定參照郝再彬等[16]的愈創(chuàng)木酚顯色法，CAT活性的測定參照高俊風(fēng)等[17]的紫外光譜法，可溶性蛋白含量的測定參照高俊風(fēng)等[17]的考馬斯亮藍(lán)G-250法。

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有處理每次重復(fù)測定3次，數(shù)據(jù)為3次測定值的平均值，用Excel 2010進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計，用SPSS 17.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 干旱高溫互作對高山杜鵑幼苗脯氨酸含量的影響

由圖1可知，與對照組相比，干旱高溫互作下各處理組的脯氨酸含量隨脅迫時間的延長而持續(xù)升高，但是各處理組的脯氨酸含量有明顯差異。與CK相比，T1、T2、T3的脯氨酸含量變化不顯著(P>0.05)；而在其它濃度的處理下脯氨酸含量有顯著性差異(P<0.05)，脯氨酸含量隨著脅迫時間的延長呈現(xiàn)逐漸增大的趨勢。其中在40 ℃高溫下，用20%的PEG處理下影響最大，其脯氨酸含量平均高達(dá)對照組的283.3%。

圖1 干旱高溫互作對高山杜鵑幼苗脯氨酸含量的影響

2.2 干旱高溫互作對高山杜鵑幼苗相對電導(dǎo)率的影響

相對電導(dǎo)率是衡量細(xì)胞膜透性的重要指標(biāo)。由圖2可以看出，對照組的相對電導(dǎo)率變化不顯著；隨著干旱高溫脅迫時間的延長，各處理的相對電導(dǎo)率均有較大幅度的增加。對照組葉片的相對電導(dǎo)率為31.5%，在脅迫處理9 d后，各處理的相對電導(dǎo)率分別比對照組增加了96.2%、99.4%、108.9%、109.5%、120.0%、131.4%、134.3%、145.1%、163.8%。相對電導(dǎo)率的值越大，電解質(zhì)的滲漏量越多，細(xì)胞膜受害程度越重。

圖2 干旱高溫互作對高山杜鵑幼苗相對電導(dǎo)率的影響

2.3 干旱高溫互作對高山杜鵑幼苗POD、SOD和CAT活性的影響

由圖3可知，與對照組相比，SOD的活性呈先升后降的趨勢，SOD活性在第7天時達(dá)到最大以后逐漸下降，T1、T2處理的SOD活性變化不顯著(P>0.05)；而T6處理的SOD活性差異最為顯著(P<0.05)，與對照組相比增加了15.4%，說明干旱高溫互作顯著影響了杜鵑葉片SOD的活性。由圖4、圖5可知，干旱高溫互作下高山杜鵑的POD和CAT活性均隨著脅迫天數(shù)的增加呈上升趨勢，T1、T2、T3處理的POD活性變化不顯著(P>0.05)，而T9處理的POD活性差異最為顯著(P<0.05)，比對照組增長了71.9%。T1、T2處理的CAT活性變化不顯著(P>0.05), 而T9處理的CAT活性差異最為顯著(P<0.05)，比對照組增長了22.9%，說明脅迫程度越大，杜鵑葉片的POD、CAT活性也逐漸增大以達(dá)到減少干旱高溫傷害的保護目的。

圖3 干旱高溫互作對高山杜鵑幼苗SOD活性的影響

圖4 干旱高溫互作對高山杜鵑幼苗POD活性的影響

2.4 干旱高溫互作對高山杜鵑幼苗MDA含量的影響

由圖6可知，與對照組的MDA含量相比，干旱高溫互作下各處理組的MDA含量隨脅迫時間的延長而持續(xù)升高，但是各處理組的MDA含量有明顯差異。T1、T2處理的MDA含量變化不顯著(P>0.05)；而T9處理的MDA含量差異最為顯著(P<0.05)，與對照組相比增加了178.1%。丙二醛含量隨著脅迫時間的延長而升高，說明高溫干旱互作下細(xì)胞質(zhì)膜發(fā)生了過氧化作用，引起質(zhì)膜正常的生理功能發(fā)生紊亂。

圖5 干旱高溫互作對高山杜鵑幼苗CAT活性的影響

圖6 干旱高溫互作對高山杜鵑幼苗MDA含量的影響

2.5 干旱高溫互作對高山杜鵑幼苗可溶性蛋白含量的影響

可溶性蛋白質(zhì)是植物體內(nèi)的重要滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)。由圖7可知，對照組的可溶性蛋白含量相對穩(wěn)定，而在干旱高溫互作下高山杜鵑葉片中可溶性蛋白含量隨著脅迫時間的延長均呈上升趨勢。T1、T2處理下可溶性蛋白含量與對照組相比無顯著性差異(P>0.05)；處理T9與對照組相比存在顯著性差異(P<0.05)，增加了28.8%。說明在抗逆境中可溶性蛋白不僅能夠維持細(xì)胞的膨壓，而且能夠起到抵御或減輕干旱、高溫傷害等作用。

圖7 干旱高溫互作對高山杜鵑幼苗可溶性蛋白含量的影響

3 討論

植物受到非生物脅迫時，體內(nèi)常通過自身的防御網(wǎng)絡(luò)來調(diào)控相關(guān)的代謝途徑。脯氨酸不僅是細(xì)胞內(nèi)最重要的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，而且是一種水溶性極強的氨基酸，具有較強的水合能力；此外，還可以增加蛋白質(zhì)的可溶性和減少可溶性蛋白質(zhì)的沉淀，保持膜結(jié)構(gòu)的完整性[18]。脯氨酸能有效幫助植物細(xì)胞組織持水和防止脫水，同時具有解氨毒和保護膜完整性的作用。干旱脅迫時脯氨酸的積累最為明顯，其含量可以比正常條件下增加幾十到幾百倍[19-20]。本研究中，各處理組脯氨酸含量隨著脅迫時間的延長呈上升趨勢，在T9處理下高山杜鵑脯氨酸含量增長幅度最大。植物體內(nèi)脯氨酸含量的多少在一定程度上與植物的抗逆性呈正相關(guān)，抗性強的品種往往積累的脯氨酸較多。因此脯氨酸含量可以作為衡量植物的抗逆性強弱的生理指標(biāo)。

植物相對電導(dǎo)率是反映植物細(xì)胞膜透性的一項基本指標(biāo)。在本試驗中，對照組葉片的相對膜透性沒有明顯的變化，而干旱高溫互作處理下的相對電導(dǎo)率變化顯著，隨著脅迫時間的延長均呈上升趨勢，但存在一定的差異，其中T9增長幅度最大。因此，植物在受到干旱高溫互作的情況下細(xì)胞膜容易被破壞，導(dǎo)致胞質(zhì)的胞液外滲而使相對電導(dǎo)率增大。

在逆境脅迫下，植物體內(nèi)活性氧的產(chǎn)生與清除平衡被打破，導(dǎo)致植物體在生命過程中活性氧不斷積累。SOD、POD和CAT是植物體內(nèi)3種重要的保護酶。SOD是植物活性氧代謝的關(guān)鍵酶，而POD和CAT這2種酶反映了植物生理生化代謝及生長發(fā)育情況，也可作為植物抗性強弱的標(biāo)志[21]。普遍認(rèn)為，在逆境脅迫下，植物的 SOD、POD和CAT活性都會有一定提高[22-23]。SOD活性受超氧陰離子自由基(O2-)的誘導(dǎo)，歧化O2-為H2O2和O2，而CAT和POD則進(jìn)一步將H2O2催化生成H2O，從而減少O2-和H2O2的積累[24]。

在本研究中，干旱高溫互作下高山杜鵑的POD、CAT活性均隨著脅迫時間延長呈上升趨勢，其中POD、CAT活性均在T9處理下增長幅度最大；而SOD的活性隨著脅迫時間延長呈現(xiàn)出先升后降的趨勢，其中在第7天時達(dá)到最大后逐漸下降，這與龐新華等[10]的研究結(jié)果一致。SOD的活性呈現(xiàn)這一趨勢，可認(rèn)為，盡管SOD 可清除 O2-，減輕膜脂過氧化對細(xì)胞內(nèi)其他部位的傷害，但這種保護作用是有限的；到干旱高溫脅迫后期，當(dāng)脅迫壓力超過植物所能承受的極限時，干旱高溫會破壞酶的活性中心，通過改變酶的結(jié)構(gòu)或抑制酶的表達(dá)，使得酶活性下降。王麗娟等[25]在對逆境脅迫下桃葉杜鵑幼苗的生理生化研究中卻發(fā)現(xiàn)SOD活性持續(xù)上升。這一現(xiàn)象可能與不同實驗研究中材料、方法或處理時間的不同或不同類型杜鵑對高溫脅迫的反應(yīng)不同有關(guān)，具體原因還有待深究。

MDA是膜脂過氧化作用的產(chǎn)物之一，其含量高低被作為活性氧傷害的重要指標(biāo)。在本試驗中，干旱高溫互作下高山杜鵑幼苗的MDA含量顯著增加，其中處理T1、T2的MDA含量增長幅度不明顯，T9處理的MDA含量增長幅度最大，高山杜鵑MDA含量隨脅迫時間的延長而增加的這一現(xiàn)象與對其它杜鵑花屬植物的研究結(jié)果相吻合[10]，說明干旱高溫互作下脅迫程度的加深，致使抗氧化系統(tǒng)被破壞，植物體內(nèi)的活性氧大量積累，導(dǎo)致了膜脂的過氧化，對細(xì)胞膜造成了嚴(yán)重的傷害。因此，MDA可被作為檢測膜損傷程度、膜脂過氧化程度和植物對逆境條件反應(yīng)強弱的指標(biāo)。

可溶性蛋白質(zhì)是細(xì)胞內(nèi)的重要滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，對維護細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定具有重要作用。高含量的可溶性蛋白質(zhì)可使細(xì)胞維持較低的滲透勢，抵抗水分脅迫帶來的傷害。本研究結(jié)果表明，隨脅迫時間的延長，可溶性蛋白質(zhì)的含量呈上升趨勢，其中T1處理的可溶性蛋白質(zhì)含量增長幅度不明顯，T9處理的可溶性蛋白質(zhì)含量增長幅度最大。因此，可溶性蛋白不僅能夠維持細(xì)胞的膨壓，而且能夠起到抵御或減輕干旱、高溫傷害等作用。

綜合各項指標(biāo)表明，干旱高溫脅迫處理程度越深，對秦嶺高山杜鵑的傷害越大，植物越容易死亡。因此，秦嶺高山杜鵑幼苗適宜在25 ℃左右的溫度下和沒有干旱脅迫的環(huán)境下生長，33 ℃和不同濃度的PEG干旱處理會導(dǎo)致植物生長受到抑制，但具有一定抗性；40 ℃和不同濃度的PEG干旱處理會導(dǎo)致植物生長受到嚴(yán)重影響。因此，將高山杜鵑引種栽培到夏季最高溫度不超過25 ℃左右的地區(qū)是可行的，但隨著近年來夏季溫度的不斷上升，通過什么方法讓杜鵑在炎熱的城市引種成功還需要進(jìn)一步研究。