鄧茹蕓 ，曹 建 ，魏潤(rùn)杰 ，姚樹坤 ,,,4?

（1.北京中醫(yī)藥大學(xué)，北京 100029；2.北京航空航天大學(xué) 生物與醫(yī)學(xué)工程學(xué)院，北京 100191；3.北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部中日友好臨床醫(yī)學(xué)院，北京 100029；4.中日友好醫(yī)院 消化內(nèi)科，北京 100029）

原發(fā)性肝癌全球每年新發(fā)病例高達(dá)60萬人，其中超過50%發(fā)生于中國(guó)，確診時(shí)多為晚期[1，2]。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，中藥辯證治療晚期原發(fā)性肝癌患者可以顯著減輕臨床癥狀和體征[3]。中國(guó)2017版《原發(fā)性肝癌診療規(guī)范》指出中醫(yī)藥治療是肝癌治療的重要輔助手段[4]。清肝化瘀顆粒，由黃芩、苦參、白術(shù)、莪術(shù)等中藥組成，該處方是姚樹坤教授根據(jù)其三十余年臨床經(jīng)驗(yàn)創(chuàng)制的治療原發(fā)性肝癌的有效經(jīng)驗(yàn)方，該方具有清熱解毒，健脾祛濕，活血化瘀，軟堅(jiān)消癥等功效。前期臨床相關(guān)應(yīng)用表明清肝化瘀方能夠提高患者免疫功能，延長(zhǎng)生存期，改善生活質(zhì)量，可應(yīng)用于大多數(shù)原發(fā)性肝癌的患者，具有極高的開發(fā)研究?jī)r(jià)值。目前清肝化瘀顆粒正在進(jìn)行新藥研發(fā)，本次試驗(yàn)進(jìn)行急性毒性試驗(yàn)為臨床用藥的安全性提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物為80只ICR小鼠，SPF級(jí)，體重18～21g，雌雄各半，購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，許可證編號(hào):SCXK（京）2016-0011。

清肝化瘀顆粒（批號(hào):20170731）由中日友好醫(yī)院藥學(xué)部提供。以下描述中，“干膏粉”指的是本供試品提取物，每克提取物相當(dāng)于4.472g生藥，“生藥”是根據(jù)此含量計(jì)算得到的生藥量。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 劑量設(shè)置

本品為中藥復(fù)方，由黃芩、苦參等組成，本試驗(yàn)設(shè)置 7個(gè)劑量:0.15、0.20、0.27、0.36、0.48、0.65、0.86藥粉/ml，給藥體積:40ml/kg[6]。劑量設(shè)置依據(jù):前期預(yù)試驗(yàn)表明，清肝化瘀顆粒（批號(hào)同正式供試品），以濃度 0.718、0.431、0.259、0.155、0.093g 干膏粉/ml一次性灌胃給予小鼠后，前2個(gè)劑量組有3 只（3/10）、2 只（2/10）雄性動(dòng)物于給藥后 24h 內(nèi)死亡；后3個(gè)劑量組未出現(xiàn)死亡，最低劑量組未見肉眼可見的不良反應(yīng)。

正式供試品預(yù)配制結(jié)果顯示，清肝化瘀顆粒干膏粉可配制的最高濃度為0.86g干膏粉/ml。因此，本次正式試驗(yàn)進(jìn)行小鼠半數(shù)致死量試驗(yàn)，最高劑量設(shè)定為0.86g干膏粉/ml，然后0.75倍間距向下設(shè)定6個(gè)劑量[5，6]，至低于未出現(xiàn)不良反應(yīng)濃度劑量，6.0g干膏粉/kg。

1.2.2 動(dòng)物分組

適應(yīng)期結(jié)束后，小鼠禁食約15h，稱禁食體重，采用分層隨機(jī)法，根據(jù)此體重分層對(duì)納入試驗(yàn)的80只動(dòng)物按性別分別進(jìn)行分組。參考 “SOPTQ035實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的隨機(jī)分組”。80只ICR小鼠采用隨機(jī)分為8組:對(duì)照組（灌胃給予等體積實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飲用水）和上述7個(gè)劑量的給藥組。

1.2.3 給藥方法

經(jīng)口灌胃給藥，根據(jù)前期藥效學(xué)相關(guān)研究，清肝化瘀給藥組給予相應(yīng)濃度的藥液，對(duì)照組給予等體積實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飲用水，40ml/kg/次，給藥1次，于稱禁食體重分組后立即給予。

1.3 觀察與檢測(cè)

1.3.1 毒性癥狀、一般狀態(tài)觀察與剖檢結(jié)果

給藥后，密切觀察1h內(nèi)動(dòng)物毒性反應(yīng)，給藥當(dāng)日上下午均進(jìn)行觀察。之后每天1次觀察動(dòng)物，記錄動(dòng)物的一般狀況、毛色、活動(dòng)、步態(tài)、神態(tài)、大便、尿液等。觀察有無中毒癥狀發(fā)生，及發(fā)生的時(shí)間和持續(xù)時(shí)間、恢復(fù)情況，記錄死亡或?yàn)l死動(dòng)物。

1.3.2 體重

給藥后第 1 天（D1）、第 2 天（D2）、第 3 天（D3）、第 5 天（D5）、第 8 天（D8）、第 11 天（D11）、第14天（D14）稱量動(dòng)物未禁食體重。

1.3.3 攝食量

給藥后（D0）即恢復(fù)供食，每籠加定量飼料（200g/籠），與上述體重稱量的同時(shí)稱剩余飼料，每次稱剩余飼料后繼續(xù)定量添加飼料（200g/籠）。計(jì)算每籠飼料消耗量，除以每籠動(dòng)物數(shù)，即得該籠平均攝食量（g飼料/鼠日）。

給藥當(dāng)天（D0）給藥后定量添加飼料。給藥后D1、D2、D3、D5、D8、D11 稱剩余飼料量后定量添加飼料。給藥后D14稱剩余飼料后不再定量添加飼料。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。動(dòng)物半數(shù)致死量（LD50）采用Bliss法計(jì)算，probit程序進(jìn)行檢驗(yàn)；采用單因素方差分析（ANOVA），組間比較方差齊性采用LSD檢驗(yàn)，方差不齊時(shí)選用 Tamhane’s T2 檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 小鼠死亡率和不良反應(yīng)

清肝化瘀顆粒以 26.8、35.8、48.3、64.4、85.9、116.3、153.8g生藥/kg，40ml/kg給藥體積，一次性經(jīng)口給予小鼠，可觀察到的主要毒性反應(yīng)為急性死亡。上述劑量給藥當(dāng)日、D1、D2-14的動(dòng)物死亡情況見表1。劑量組4～7在給藥后1h陸續(xù)有動(dòng)物出現(xiàn)死亡，發(fā)生在用藥后1h～24h內(nèi)，其中劑量組6的死亡高峰發(fā)生在給藥后1～2h，其余各組的死亡高峰在給藥后4～24h內(nèi)。采用Bliss法計(jì)算得出LD50為69.94g生藥/kg（相當(dāng)于臨床劑量的104倍），95%可信限為63.50～81.03g生藥/kg。結(jié)果見表1所示。

表1 清肝化瘀顆粒急性毒性試驗(yàn)動(dòng)物死亡情況

表2 清肝化瘀顆粒急性毒性試驗(yàn)不良反應(yīng)情況

除急性死亡外，其它肉眼可見的不良反應(yīng)主要表現(xiàn)為腹瀉、靜臥、步態(tài)不穩(wěn)、翻正反射消失伴肢體僵直；劑量組2、3的小鼠表現(xiàn)為腹瀉和/或靜臥，發(fā)生率分別為30%和40%，約在給藥后20～30min發(fā)生，在給藥后5h內(nèi)恢復(fù)；劑量組4有7只動(dòng)物出現(xiàn)腹瀉和/或靜臥的不良反應(yīng)，發(fā)生在給藥后30min～2h，除有2只動(dòng)物在給藥后24h內(nèi)恢復(fù)外，其余動(dòng)物在給藥后5h內(nèi)恢復(fù)；5～7劑量組除有腹瀉和/或靜臥的不良反應(yīng)外，且出現(xiàn)步態(tài)不穩(wěn)和/或翻正反射消失伴肢體僵直癥狀，發(fā)生在給藥后30min～5h內(nèi)，劑量組5、7雖分別有2只和1只動(dòng)物的腹瀉在給藥后4h內(nèi)恢復(fù)，但上述3個(gè)劑量組的所有動(dòng)物均在24h內(nèi)死亡；劑量組1未出現(xiàn)上述肉眼可見的不良反應(yīng)。劑量組1～7的不良反應(yīng)發(fā)生率分別為0%、30%、40%、70%、100%、100%和100%；此后直至觀察期14d結(jié)束，存活動(dòng)物的一般情況、活動(dòng)、步態(tài)、呼吸、進(jìn)食、飲水、二便、皮毛等均未見異常見。結(jié)果見表2所示。

圖1 清肝化瘀顆粒急性毒性實(shí)驗(yàn)——雄性動(dòng)物平均體重變化

圖2 清肝化瘀顆粒急性毒性實(shí)驗(yàn)——雌性動(dòng)物平均體重變化

2.2 對(duì)小鼠體重和攝食量的影響

與對(duì)照組相比，給藥后14d內(nèi)，清肝化瘀顆粒雄性動(dòng)物64.4g生藥/kg劑量組在給藥后D1～14體重均較對(duì)照組偏低，其中D1體重較對(duì)照組明顯降低（P＜0.01），其余各時(shí)間點(diǎn)未見明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；雄性動(dòng)物的其它劑量組和雌性動(dòng)物各劑量組在各時(shí)間點(diǎn)與對(duì)照組體重基本相當(dāng)，與對(duì)照組比較均未見明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。各組平均體重見圖1、2。

與對(duì)照組比較，清肝化瘀顆粒雄性動(dòng)物64.4g生藥/kg劑量組于給藥后D1攝食量較對(duì)照組降幅明顯，約為對(duì)照組的52%，D2后攝食量已與對(duì)照組基本接近；雄性動(dòng)物的其它劑量組和雌性動(dòng)物各劑量組在各時(shí)間點(diǎn)與對(duì)照組攝食量基本相當(dāng)。

2.3 大體解剖觀察

14d觀察期結(jié)束，解剖后肉眼觀察，動(dòng)物胸、腹腔未見滲液、出血和粘連，心、肝、脾、肺、腎、腎上腺、胃腸、膀胱、睪丸、附睪等均未見充血、瘀血、出血、滲液、粘連、糜爛、潰瘍等肉眼可見的病變。

3 討論

中藥具有調(diào)整機(jī)體狀態(tài)，增強(qiáng)免疫功能，減少手術(shù)副反應(yīng)，控制腫瘤發(fā)展，改善癥狀，提高生活質(zhì)量，延長(zhǎng)“帶瘤生存”期的；所以研究有效的肝癌中成藥具有長(zhǎng)遠(yuǎn)的積極意義。清肝化瘀顆粒是姚樹坤教授集多年經(jīng)驗(yàn)形成的治療肝癌的有效經(jīng)驗(yàn)方。本課題組前期動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和細(xì)胞實(shí)驗(yàn)明確了清肝化瘀方的主要有效組分是:氧化苦參堿類、黃芩苷類、莪術(shù)醇類；其有效成分在各類腫瘤中均具有具有明確的抗腫瘤、抑制細(xì)胞增殖的作用[7～10]。本研究將為臨床用藥的安全性提供參考。

3.1 不良反應(yīng)

本實(shí)驗(yàn)得出，清肝化瘀顆粒最大無毒反應(yīng)劑量為26.8g生藥/kg（相當(dāng)于成人臨床推薦劑量的40倍）。26.8g生藥/kg劑量組未出現(xiàn)任何肉眼可見不良反應(yīng)；35.8、48.3g生藥/kg劑量組毒性反應(yīng)輕微，發(fā)生率分別為30%和40%；64.4g生藥/kg劑量組毒性反應(yīng)較大，不良反應(yīng)發(fā)生率為70%；85.9g生藥/kg及以上劑量組，毒性反應(yīng)劇烈全部致死。除死亡動(dòng)物出現(xiàn)步態(tài)不穩(wěn)以及翻正反射消失伴僵直等不良反應(yīng)外，其余不良反應(yīng)均為腹瀉和/或靜臥，且在5h內(nèi)恢復(fù)。除最大劑量組外，其余各組給藥后攝食量及體重?zé)o明顯變化，觀察期結(jié)束后，存活動(dòng)物解剖后未見明顯病變。可見，清肝化瘀顆粒正常劑量臨床應(yīng)用，在不良反應(yīng)方面可能具有較為明顯的優(yōu)勢(shì)。

3.2 安全性

本實(shí)驗(yàn)表明，過量清肝化瘀顆粒主要毒性反應(yīng)為急性死亡。實(shí)驗(yàn)得出LD50為69.94g生藥/kg（相當(dāng)于成人臨床推薦劑量的104倍），95%可信限為63.50～81.03g生藥/kg，最大無致死劑量為48.3g生藥/kg（相當(dāng)于成人臨床推薦劑量的72倍）。觀察期14d結(jié)束，存活動(dòng)物的一般情況、活動(dòng)、步態(tài)、呼吸、進(jìn)食、飲水、二便、皮毛等均未見異常；因此，清肝化瘀顆粒常規(guī)劑量應(yīng)用，安全性可能較高。

本次試驗(yàn)只觀察了動(dòng)物解剖后可見病變，沒有進(jìn)行血液和組織分析。下一步，課題組將結(jié)合臨床實(shí)踐，深入分析清肝化瘀顆粒毒性反應(yīng)機(jī)理，為其臨床研究奠定基礎(chǔ)。