李艷萍 ，楊文雪 ，夏啟勝 ，閻小萍 ，陶慶文 ，陳志華 ，趙淑欣 ，孔維萍 ?

（1.北京中醫(yī)藥大學(xué)，北京 100029；2.天津市中醫(yī)藥研究院腎病科，天津 300120；3.中日友好臨床醫(yī)學(xué)研究所，北京100029；4.中日友好醫(yī)院 中醫(yī)風(fēng)濕病科，北京 100029；5.免疫炎性疾病北京市重點實驗室，北京 100029）

強直性脊柱炎（ankylosing spondylitis，AS）是一種原因不明的慢性、炎性、自身免疫性疾病。主要累及骶髂、脊柱及外周關(guān)節(jié)，并可伴發(fā)關(guān)節(jié)外表現(xiàn)。附著點炎癥、骨侵蝕、韌帶骨贅形成被認(rèn)為是AS的主要病理過程。其中病理性新骨形成是其獨特標(biāo)志[1]。新骨形成導(dǎo)致的不可逆結(jié)構(gòu)損傷在疾病后期嚴(yán)重影響了脊柱活動，使關(guān)節(jié)活動降低[2]。晚期可出現(xiàn)脊柱活動受限、僵硬、融合，關(guān)節(jié)屈曲攣縮、畸形，造成患者不同程度殘疾，嚴(yán)重影響了疾病預(yù)后。

目前較為統(tǒng)一的觀點認(rèn)為骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（bone mesenchymal stem cells，BMSCs）原生質(zhì)膜的受體上結(jié)合 Wnt蛋白，誘導(dǎo)其向成骨細(xì)胞分化，成骨細(xì)胞產(chǎn)生骨基質(zhì)沉積而成骨[3]?，F(xiàn)已證實經(jīng)典Wnt信號通路（β-catenin依賴性通路）在BMSCs成骨過程發(fā)揮了重要作用[4]，該通路的激活促進成骨細(xì)胞分化和成熟，并與AS的新骨形成相關(guān)[5]。本實驗擬觀察補腎強督方含藥血清對Wnt信號通路中因子表達(dá)的影響，探討補腎強督方抑制新骨形成的可能作用機制。陽性對照藥物選擇非甾體抗炎藥塞來昔布。有研究報道連續(xù)使用其可減低AS放射學(xué)進展[6]。在細(xì)胞實驗方面有研究發(fā)現(xiàn)在炎癥條件下，大劑量塞來昔布的治療可以抑制BMSCs的成骨[7]。但目前關(guān)于塞來昔布對于AS的Wnt通路影響研究還未見報道。

1 材料與方法

1.1 制備藥物補腎強督方和西藥對照溶液

補腎強督方組成:熟地、金狗脊、鹿角、骨碎補、補骨脂 、桂枝、赤芍 、白芍 、知母 、秦艽 、羌活等。中日友好醫(yī)院藥劑室煎制，藥物經(jīng)水煎、過濾、濃縮至終濃度分別為0.75、1.5、3g/ml的補腎強督方低、中、高劑量組各140ml，裝瓶，封蓋，滅菌，4℃冰箱保存?zhèn)溆?。西藥對照?塞來昔布膠囊（西樂葆），廠家:上海輝瑞制藥有限公司，批號:R55875，規(guī)格:0.2g/片。換算為大鼠等效劑量，用水溶解，4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 大鼠含藥血清制備

實驗動物選用 Wistar雄性大鼠（來源于維通利華）20只，隨機分為5組（每組4只）:中藥高、中、低劑量組、西藥對照組以及空白組，分別進行灌胃給藥，連續(xù)給藥 7d，灌胃劑量參照《藥理試驗中動物間和動物與人體間的等效劑量換算》。末次給藥 2次，間隔 1h，末次給藥前 12h，禁食不禁水，末次給藥后 1h大鼠稱重，平均220g/只，10%水合氯醛（中日醫(yī)院提供）麻醉，每只1.2ml，剖腹，腹主動脈取血，離心取血清，56℃滅活30min，0.22μm微孔濾膜過濾除菌，-20℃冰箱保存。

1.3 細(xì)胞傳代擴增培養(yǎng)

人BMSCs購自ATCC，在MSCM基礎(chǔ)培養(yǎng)基（含1%青霉素鏈霉素雙抗、5%胎牛血清、1%間充質(zhì)干細(xì)胞生長因子，均購自ATCC）內(nèi)培養(yǎng)，細(xì)胞密度為3×105/ml，接種于 2μg/cm2多聚賴氨酸（購自Sciencell）包被后的 T-25培養(yǎng)瓶中，置 37℃溫箱靜置培養(yǎng)，次日更換培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，觀察生長情況。待細(xì)胞鋪滿培養(yǎng)瓶 60%～70%時，用0.25%胰酶（購自Gibco）進行消化，收集細(xì)胞后離心并臺盼藍(lán)計數(shù)，后將細(xì)胞種于3個2μg/cm2多聚賴氨酸包被后T-25培養(yǎng)瓶中，置37℃溫箱靜置培養(yǎng)，次日更換培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，觀察生長情況，傳代擴增至第5代的細(xì)胞用于實驗。

1.4 細(xì)胞成骨分化培養(yǎng)干預(yù)

用多聚賴氨酸包被好六孔板后，對第5代人BMSCs進行臺盼藍(lán)計數(shù)，調(diào)整細(xì)胞密度，接種于包被好的六孔板中，使得每孔中含約1×105個人BMSCs細(xì)胞，補足培養(yǎng)液至每孔2.5ml。置37℃溫箱靜置培養(yǎng)，次日更換培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，觀察生長情況，直至細(xì)胞鋪滿六孔板，分為中藥高、中、低劑量組、西藥對照、空白組。各分化組吸棄各孔中的培養(yǎng)基，分別更換為加入對應(yīng)含藥血清的MODM（含1%青霉素鏈霉素雙抗、5%胎牛血清、1%間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化因子、20%含藥血清）2.5ml，進行藥物干預(yù)成骨分化，4～5d更換1次培養(yǎng)液，培養(yǎng)14d。

1.5 檢測指標(biāo)

實時熒光定量PCR測定BMSCs膜內(nèi)成骨中GSK3β、wnt5a和SOST mRNA 表達(dá):BMSCs誘導(dǎo)成骨分化 14d，Trizol（購自Invitrogen）提取成骨細(xì)胞總RNA。取1μg總RNA，用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（購自BIO-RAD）合成20μl cDNA，再取1μl cDNA進行實時熒光定量PCR反應(yīng)。GSK3βmRNA上游引物為:5'-CACGGTCTCCAGTATTAGCATCT-3'，下游:5'-GGCTACCATCCTTATTCCTCC-3'；Wnt5a mRNA上游引物為:5'-TGGTGGTCGCTAGGTATGAATAAC-3'，下游:5'-TCCTGATACAAGTGGCACAGTTTCT-3'，SOST mRNA上游引物為:5'-CGGTCCCGAAGTCCTTGAGCT-3'，下游:5'-GGCAAGTGGTGGCGACCTAGT-3'。引物均由捷瑞生物工程有限公司合成，以cDNA為模板按FastStartUniversalSYBRGreenMaster（ROX）試劑盒（購自 Roche）說明書配制 25μl的PCR反應(yīng)體系，按以下條件在AB7500（Thermo公司）進行擴增:預(yù)變性，1個循環(huán)，95℃ 2min；熱循環(huán)，40個循環(huán)，95℃ 15s，60℃ 1 min；溶解曲線。每種樣品做3個復(fù)孔，計算時取平均值。

1.6 檢測方法

免疫印跡法分析BMSCs中 GSK3β、wnt5a和SOST蛋白含量:BMSCs誘導(dǎo)成骨分化14d后用RIPA法提取蛋白質(zhì)，BCA法測定蛋白濃度，蛋白質(zhì)免疫印跡（Western blot，WB）檢測細(xì)胞中的目標(biāo)蛋白質(zhì)含量。樣品加入上樣緩沖液后100℃加熱 5min。每孔各上 15～20μg樣品蛋白。電泳后，蛋白轉(zhuǎn)印至PVDF膜上，5%的脫脂奶粉封閉，37℃，2h，孵育一抗（GSK3β、SOST、Wnt5a，均購自 AB-cam），均為1∶1000稀釋，4℃ 孵育過夜后用TBST充分洗滌。孵育二抗（KPL公司，貨號:074-1516），室溫孵育 2h，ECL發(fā)光試劑盒（購自Millipore）顯影，以β-actin為內(nèi)對照，拍照，對雜交帶進行密度掃描分析，比較蛋白的相對表達(dá)。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SAS9.2統(tǒng)計學(xué)軟件，對各組數(shù)據(jù)進行正態(tài)分布檢驗和方差齊性檢驗，符合正態(tài)分布且方差齊采用方差分析，方差不齊的資料采用Wilcoxon秩和檢驗。

2 結(jié)果

2.1 補腎強督方干預(yù)BMSCs成骨的結(jié)果

如圖1（見封二）所示，空白組骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化培養(yǎng)14d后可見明顯礦化結(jié)節(jié)形成，補腎強督方高、中、低劑量組及西藥對照組均未見明顯礦化結(jié)節(jié)，各組間無明顯差別。提示補腎強督方和塞來昔布均可抑制骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化。

圖1 各組骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨誘導(dǎo)結(jié)果（茜紅素染色×10）

2.2 含藥血清對BMSCs成骨分化 SOST、Wnt5a、GSK3βmRNA表達(dá)的影響

如圖2所示，①各組細(xì)胞SOST mRNA表達(dá):與空白對照組比較，中藥各劑量組和西藥組SOST mRNA表達(dá)水平顯著增高（P＜0.05）；與西藥組比較，中藥高、中劑量組表達(dá)升高（P＜0.05）；與中藥低劑量組比較，中藥高、中劑量組表達(dá)升高（P＜0.05）；與中藥中劑量組比較，中藥高劑量組表達(dá)升高（P＜0.05）。②各組細(xì)胞 wnt5a mRNA 表達(dá):與空白對照組比較，中藥高中低劑量組wnt5a mRNA表達(dá)水平顯著降低（P＜0.05）；與西藥對照組比較，中藥中高劑量組wnt5a mRNA表達(dá)水平顯著降低（P＜0.05）；與中藥低劑量組比較，中藥高劑量組wnt5a mRNA表達(dá)水平顯著降低（P＜0.05）。③各組細(xì)胞GSK3β mRNA表達(dá):與空白對照組比較，中藥各劑量組GSK3β mRNA表達(dá)水平顯著增高（P＜0.05）；與西藥對照組比較，中藥中、高劑量組 GSK3β mRNA 表達(dá)水平顯著增高（P＜0.05）；與中藥中、低劑量組比較，中藥高劑量組GSK3β mRNA 表達(dá)水平顯著增高（P＜0.05）。

2.3 含藥血清對BMSCs成骨分化中SOST、Wnt5a、GSK3β蛋白表達(dá)的影響

如圖3所示:①與空白對照組比較，中藥各劑量組、西藥對照組SOST蛋白質(zhì)產(chǎn)生量顯著增高（P＜0.05），與西藥對照組、中藥低劑量組比較，中藥高劑量SOST蛋白質(zhì)產(chǎn)生量顯著增高（P＜0.05）。②與空白對照組比較，中藥高劑量組、西藥組Wnt5a 蛋白質(zhì)產(chǎn)生量顯著降低（P＜0.05），與西藥對照組比較，中藥高劑量Wnt5a蛋白質(zhì)產(chǎn)生量顯著增高（P＜0.05）。③與空白對照組比較，中藥高劑量組GSK3β蛋白質(zhì)產(chǎn)生量顯著增高（P＜0.05），與西藥對照組、中藥低劑量組比較，中藥高劑量GSK3β蛋白質(zhì)產(chǎn)生量顯著增高（P＜0.05）。

3 討論

圖2 補腎強督方對 BMSCs成骨分化中SOST mRNA、Wnt5a mRNA及GSK3β mRNA表達(dá)的影響

新骨形成是AS目前研究的熱點，AS新骨形成部位多在連接骨的肌腱、韌帶處[8]，可在疾病后期導(dǎo)致強直，嚴(yán)重影響脊柱活動度，甚至造成殘疾，是影響本病預(yù)后的主要原因。近年來，Wnt信號通路在AS新骨形成中的作用引起廣泛關(guān)注，該通路的激活促進成骨細(xì)胞分化和成熟，與AS的新骨形成相關(guān)[5]。

SOST是Wnt通路的抑制劑，當(dāng)Wnt蛋白與卷曲受體和LRP5/6受體結(jié)合時，激活一系列信號級聯(lián)反應(yīng)，發(fā)生經(jīng)典的Wnt/β-catenin信號通路，而SOST可競爭性結(jié)合LRP5/6共同受體，從而抑制Wnt信號通路[11]。AS患者血清SOST水平較正常人對照組顯著降低[16～19]，AS患者關(guān)節(jié)免疫組化染色SOST的表達(dá)顯著降低于健康對照組[21]。Wnt5a是一種既參與經(jīng)典Wnt信號通路，又參與非經(jīng)典Wnt信號通路的Wnt蛋白，不僅具有調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞的功能[12～14]，還能促進BMSCs表達(dá)ALP，促進其骨化進展[20]。抑制Wnt5a可減少成骨細(xì)胞礦化[22]。另外，在經(jīng)典 Wnt通路中，APC、GSK3β、Axin組成了β-catenin降解復(fù)合物，使細(xì)胞內(nèi)βcatenin水平降低，抑制了經(jīng)典的Wnt/β-catenin信號通路[15]。很多研究表明抑制GSK3β可促進骨形成。有研究表明通過基因敲除或藥物抑制GSK3β可增加骨密度[9]。在本實驗中，結(jié)果顯示，與空白對照組比較，補腎強督方含藥血清可以促進 BMSCs中 SOST、GSK3β蛋白的表達(dá)，抑制wnt5a蛋白的表達(dá)（P＜0.05）。實時熒光定量PCR檢測各組mRNA表達(dá)顯示，與空白對照組比較，補腎強督方含藥血清可以促進BMSCs中SOST、GSK3β mRNA的表達(dá)，抑制wnt5a mRNA的表達(dá)（P＜0.05）。

圖3 補腎強督方對 BMSCs成骨分化中SOST、Wnt5a及GSK3β蛋白表達(dá)的影響

我們認(rèn)為AS（大僂）主要病因病機是因腎督虧虛、陽氣不足，風(fēng)寒濕邪（尤其是寒濕偏重者）深侵腎督，陽失布化，陰失營榮，骨損筋攣，脊柱僵曲所致[10]。認(rèn)為附著點、滑膜關(guān)節(jié)、軟骨結(jié)合處的新骨生成是AS筋骨的生長發(fā)育逆亂的一種外在表現(xiàn)，其本質(zhì)是由于邪氣深侵入腎督，精血虧虛，筋骨失養(yǎng)而導(dǎo)致的。據(jù)此提出AS治療原則應(yīng)以補腎強督為大法，輔以祛寒除濕、散風(fēng)活瘀、強壯筋骨，通利關(guān)節(jié)等治療原則，研制出經(jīng)驗處方補腎強督方，主治強直性脊柱炎（大僂）腎虛督寒證。方藥由熟地、金狗脊、鹿角、骨碎補、補骨脂、桂枝、赤芍、白芍、知母、秦艽、羌活等組成，通過補腎精，養(yǎng)肝血，充骨髓，榮筋脈，促進筋、骨恢復(fù)正常生長發(fā)育。

前期我們對補腎強督方能否抑制AS的新骨形成進行了探索性研究，結(jié)果證實:補腎強督方能夠抑制AS附著點、滑膜關(guān)節(jié)、軟骨結(jié)合處的新骨形成，應(yīng)用本方治療2年后AS患者新骨形成放射學(xué)評分（mSASSS）較治療前無顯著增加。此外我們發(fā)現(xiàn)本方含藥血清能促進BMSCs成骨分化中DKK1蛋白和mRNA表達(dá)，抑制β-catenin蛋白和mRNA表達(dá)，且呈劑量依賴性，提示補腎強督方能調(diào)節(jié)BMSCs細(xì)胞成骨分化中Wnt通路[23]。我們還發(fā)現(xiàn)本方能夠抑制自發(fā)性AS模型DBA/1小鼠成骨分化中Wnt通路的激活，上調(diào)DKK-1水平，下調(diào)wnt5a水平，而臨床研究亦提示該方能上調(diào)AS患者血清中DKK-1水平，這些均提示該方可能通過Wnt通路抑制AS異位骨化[24]。

本研究是對系列研究的進一步補充，結(jié)果提示，補腎強督方能夠抑制BMSCs成骨分化中Wnt通路的激活，上調(diào)SOST、GSK3β水平，下調(diào)Wnt5a水平，這些均提示該方可能通過Wnt通路抑制AS骨化過程中BMSCs的成骨過程起到調(diào)節(jié)作用，是否通過該通路發(fā)揮作用，還需進一步的實驗證明。