余鵬，楊雨陽，謝德高，高漓，滕若冰

（桂林醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院 1.泌尿外科；2.生殖男科，廣西 桂林 541000）

不孕不育是臨床較為常見的一種疾病，據(jù)世界衛(wèi)生組織（World Health Organization,WHO）調(diào)查，15%育齡夫婦存在不育問題，而發(fā)展中國家某些地區(qū)可高達(dá)30%，男女雙方原因各占50%[1-2]。影響男性不育的因素有很多，包括內(nèi)分泌因素、遺傳因素和環(huán)境等因素，但目前全球只有25%～40%患者能查明病因并予以對(duì)癥治療，不能查明病因的臨床上稱之為特發(fā)性男性不育，但傾向考慮與環(huán)境或遺傳因素相關(guān)，基因突變是一個(gè)很重要的遺傳因素。臨床上對(duì)不育男性進(jìn)行精液分析常提示少精子癥、畸形精子癥和無精子癥，因此對(duì)精子的發(fā)生以及影響精子發(fā)生的因素的研究成為了近幾年研究的熱點(diǎn)。細(xì)胞色素P4501A1（cytochrome P450 1A1,CYP1A1）是一種重要的解毒酶，它由CYP1A1基因編碼，CYP1A1基因位于染色體15q22-15q24，含7個(gè)外顯子和6個(gè)內(nèi)含子，總長5 810 bp。目前有大量的研究報(bào)道了CYP1A1在多環(huán)芳烴（polycyclic aromatic hydrocarbons,PAHs）的代謝中能產(chǎn)生一種生物活性中間體，而這種活性中間體對(duì)男性生殖有潛在的毒性[3-4]。CYP1A1基因本身存在結(jié)構(gòu)變異即多型性，目前已發(fā)現(xiàn)4個(gè)重要的多型性位點(diǎn)，分別稱m1、m2、m3和m4。m1是3'-端T6235C點(diǎn)突變。m2是第七外顯子A4889G突變，m2與m1位點(diǎn)突變高度關(guān)聯(lián)。m3位于第七內(nèi)含子，為T＞C轉(zhuǎn)換突變，m4是與m2相鄰的C＞A顛換突變。這些研究中報(bào)道最多的是m3，即T＞C轉(zhuǎn)換突變（或4646903基因位點(diǎn)突變），其特征在于CYP1A1基因的39個(gè)側(cè)翼區(qū)域中核苷酸3801處的T至C突變。3801T＞C多態(tài)性可以改變基因表達(dá)水平或信使RNA穩(wěn)定性，從而可高度誘導(dǎo)酶的表達(dá)及其活性[5-6]。進(jìn)而改變雌激素受體α和芳烴受體的表達(dá)水平，導(dǎo)致男性生殖功能障礙。除此之外，CYP1A1 T3801C多態(tài)性和雌激素的相互作用將會(huì)損傷精子的發(fā)生，最終導(dǎo)致男性不育[7]。到目前為止，有很多文獻(xiàn)報(bào)道了CYP1A1基因多態(tài)性與特發(fā)性男性不育的相關(guān)性研究，然而，他們報(bào)道的結(jié)果卻不盡相同，而且最近的一次meta分析卻是在2014年，納入的文獻(xiàn)數(shù)量較少，近幾年又有新的相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，有必要對(duì)文獻(xiàn)再次進(jìn)行系統(tǒng)評(píng)價(jià)和薈萃分析來評(píng)估CYP1A1 T3801 C多態(tài)性與男性特發(fā)性不育易感性之間的關(guān)聯(lián)。

1 材料與方法

1.1 文獻(xiàn)檢索

本系統(tǒng)評(píng)價(jià)和meta分析遵循系統(tǒng)評(píng)價(jià)和meta分析報(bào)告首選報(bào)告項(xiàng)目（preferred reporting items for systematic reviews and meta-analysis,PRISMA）指南。檢索數(shù)據(jù)庫包括：英文數(shù)據(jù)庫Pubmed、Medline、Embase和中文數(shù)據(jù)庫中國知網(wǎng)。英文檢索詞：“Cytochrome P450 CYP1A1”、“EROD”、“Ethoxyresorufin Dealkylase”、“Ethylresorufin O-Deethylase”、“CYP1A1 Protein”、“7-Ethoxyresorufin O-Deethylase”、“Cytochrome P4501A1”、“Ethoxyresorufin O-Deethylase”、“CYP1A1”、“Polymorphisms，Genetic”、“Genetic Polymorphisms”、“Genetic Polymorphism”、“Polymorphism (Genetics)”、“Polymorphisms(Genetics)”、“SNP”、“Single nucleotide polymorphism”、“Male Infertility”、“Sterility，Male”、“Male Sterility”、“Subfertility,Male”、“Male Subfertility”、“Sub-Fertility,Male”、“Male Sub-Fertility”、“Subfertility,male”、“Azoospermia”、“Oligozoospermia”及“Malformed sperm”。中文檢索詞：細(xì)胞色素P4501A1、CYP1A1、基因多態(tài)性、基因融合、基因突變、男性不育、無精子癥、少精子癥、弱精子癥及精子畸形。檢索語言不受限制。檢索時(shí)間：自建庫以來至2018年8月31日。為盡量避免查漏文獻(xiàn)，采取電腦檢索和手工檢索相結(jié)合的方法，并對(duì)所檢索的文獻(xiàn)的參考文獻(xiàn)進(jìn)行二次檢索。

1.2 文獻(xiàn)納入和排除標(biāo)準(zhǔn)

1.2.1 文獻(xiàn)納入標(biāo)準(zhǔn) ①病例對(duì)照研究；②病例組和對(duì)照組中有rs4646903基因型的分布；③包含了rs4646903基因多態(tài)性與特發(fā)性男性不育的評(píng)價(jià)；④對(duì)照組有哈代溫伯格定律檢驗(yàn)；⑤能獲取全文。

1.2.2 排除標(biāo)準(zhǔn) ①重復(fù)報(bào)告、質(zhì)量差的文獻(xiàn)；②無基因型分布或基因型分布不完整的文獻(xiàn)；③對(duì)照組未進(jìn)行哈代溫伯格定律檢驗(yàn)的文獻(xiàn)；④各種評(píng)價(jià)類、綜述類文獻(xiàn)；⑤僅有摘要，無全文的文獻(xiàn)。

1.3 數(shù)據(jù)提取

根據(jù)以上的納入和排除標(biāo)準(zhǔn)，由兩位研究人員獨(dú)立評(píng)估以確定納入文獻(xiàn)，并對(duì)納入的文獻(xiàn)獨(dú)立提取數(shù)據(jù)，對(duì)于有爭議的文獻(xiàn)會(huì)對(duì)摘要進(jìn)行檢測(cè)，必要時(shí)檢查全文。確定納入文獻(xiàn)后，兩位研究人員獨(dú)立地對(duì)每個(gè)研究提取數(shù)據(jù)，提取的信息包括：第一作者的姓名、出版年份、國家、人種以及病例組和對(duì)照組人群中基因型頻率的分布。所納入的文獻(xiàn)人群分為亞洲人群和高加索人群。值得注意的是，由于歷史和地理的原因，伊朗處于高加索人民向地中海運(yùn)動(dòng)的路線上，伊朗應(yīng)該是歐洲人的后裔，根據(jù)以往發(fā)表的文獻(xiàn)，伊朗和印度人被歸類于高加索人群[8]，在本次研究中，也將印度和伊朗人歸類為高加索人群進(jìn)行分層分析。

1.4 質(zhì)量評(píng)價(jià)

通過紐卡斯?fàn)?渥太華量表（the Newcastle-Ottawa Scale,NOS）來評(píng)估所納入的每項(xiàng)研究，其中包含三大塊共8個(gè)條目專門評(píng)價(jià)病例對(duì)照研究[9]。主要從以下三個(gè)方面來評(píng)價(jià)：病例組與對(duì)照組選擇方法、病例組與對(duì)照組的可比性、接觸暴露評(píng)估方法。評(píng)價(jià)后星數(shù)（☆）越多質(zhì)量越好。由兩位評(píng)審人員獨(dú)立地評(píng)估納入的每項(xiàng)研究，并通過討論解決他們?cè)u(píng)估過程中的任何分歧?？紤]到最初文獻(xiàn)檢索中發(fā)現(xiàn)的病例對(duì)照研究的質(zhì)量存在差異，如果所納入文獻(xiàn)NOS評(píng)分均≥6顆星，認(rèn)為研究質(zhì)量很高[10]。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用stata 12.0軟件對(duì)CYP1A1基因rs4646903位點(diǎn)與特發(fā)性男性不育的關(guān)系進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。首先對(duì)納入的各項(xiàng)研究綜合采用Q檢驗(yàn)和I2值進(jìn)行異質(zhì)性檢驗(yàn)。如果Q檢驗(yàn)的P值大于0.1或I2＜50%，說明各研究間無顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)異質(zhì)性，所以應(yīng)采用固定效應(yīng)模型進(jìn)行合并分析，反之，則用隨機(jī)效應(yīng)模型進(jìn)行合并分析。為了探究異質(zhì)性的來源，需要根據(jù)所納入研究的一些相似性特征，諸如種族、樣本量來進(jìn)行亞組分析，并通過省略每一個(gè)單項(xiàng)研究來進(jìn)行靈敏度分析，以反映個(gè)體數(shù)據(jù)集對(duì)合并后的OR值的影響。使用“genhwcci”STATA命令進(jìn)行適當(dāng)?shù)腃hisquare擬合優(yōu)度檢驗(yàn)[11]，以評(píng)估在對(duì)照組中與哈迪·溫伯格平衡定律（Hardy-Weinberg equilibrium,HWE）的偏差。用合并后的OR值和95%可信區(qū)間（confidence index,CI）來描述CYP1A1基因rs4646903位點(diǎn)多態(tài)性與特發(fā)性男性不育的關(guān)系，分別檢測(cè)CYP1A1基因rs4646903位點(diǎn)的五個(gè)基因模型：等位基因模型（C vs.T）、純合子模型（CC vs.TT）、雜合子模型（CT vs.TT）、顯性模型（CC+CT vs.TT）以及隱形模型（CC vs.CT+TT），并繪制OR值森林圖。最后通過Begger's和Egger's的不對(duì)稱測(cè)試[12]來評(píng)價(jià)發(fā)表偏倚，解釋Egger檢驗(yàn)的統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性定義為P＜0.05。

2 結(jié)果

2.1 檢索結(jié)果

文獻(xiàn)檢索流程見圖1，初始檢索到文獻(xiàn)56篇，語言為英語的文獻(xiàn)有51篇，語言為中文的文獻(xiàn)5篇；重復(fù)文獻(xiàn)26篇，閱讀標(biāo)題剔除文獻(xiàn)8篇，meta分析及綜述類的3篇，詳細(xì)閱讀摘要及全文發(fā)現(xiàn)無基因型或非相關(guān)基因型的有10篇，無全文的文獻(xiàn)1篇，最終8篇文獻(xiàn)符合納入標(biāo)準(zhǔn)，納入本薈萃分析。其中納入的文獻(xiàn)中有3篇是亞洲人群，5篇屬于高加索人群。所有納入研究的基因型的分布均符合遺傳學(xué)HWE平衡（P均＞0.05）。納入的研究均為中高等質(zhì)量研究（NOS評(píng)分均≥5 顆星）。所納入文獻(xiàn)的基本特征和質(zhì)量評(píng)價(jià)見表1。

2.2 meta分析結(jié)果

CYP1A1基因rs4646903位點(diǎn)多態(tài)性與特發(fā)性男性不育的相關(guān)性meta分析結(jié)果見表2。從meta分析結(jié)果可以看出，等位基因模型（OR=1.39，95%CI：1.05；1.84）、純合子模型（OR=2.17，95%CI：1.24；3.79）、顯性模型（OR=1.44，95%CI：1.02；2.03）和隱形模型（OR=1.83，95%CI：1.15；2.89）中觀察到 CYP1A1基 因rs4646903位點(diǎn)多態(tài)性與特發(fā)性男性不育顯著相關(guān)，而與野生純合型TT比較，雜合性CT（OR=1.32，95%CI：0.97；1.79）與特發(fā)性男性不育無相關(guān)性。由表2可以看到各個(gè)基因模型異質(zhì)性明顯,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），故采用隨機(jī)效應(yīng)模型為各獨(dú)立研究賦予權(quán)重再進(jìn)行合并。為探究異質(zhì)性來源，根據(jù)種族（分為亞洲人群和高加索人群）及樣本量大?。ǚ譃闃颖玖浚?00和樣本量≤400）進(jìn)行亞組分析。如表2所示，根據(jù)種族進(jìn)行亞組分析不能明確異質(zhì)性來源，而進(jìn)一步的亞組分析中顯示，各個(gè)比較中沒有進(jìn)一步確定對(duì)男性不育的易感性；根據(jù)樣本量進(jìn)行亞組分析結(jié)果顯示，小樣本量是異質(zhì)性來源，各個(gè)比較中也沒有進(jìn)一步確定對(duì)男性不育的易感性。等位基因模型下CYP1A1基因rs4646903位點(diǎn)多態(tài)性與男性不育關(guān)聯(lián)的森林圖如圖2（其余模型森林圖文中未示出）。

圖1 文獻(xiàn)篩選流程及結(jié)果

表1 納入文獻(xiàn)的基本特征

表2 CYP1A1基因rs4646903位點(diǎn)不同基因模型的meta分析結(jié)果

續(xù)表2

圖2 等位基因模型meta分析森林圖

2.3 敏感性分析

進(jìn)行單獨(dú)的薈萃分析以研究每個(gè)獨(dú)立研究對(duì)整體薈萃分析估計(jì)的影響。圖3表明，遺漏的個(gè)體研究的點(diǎn)估計(jì)不在等位基因模型的組合分析的95%CI之外。類似地，當(dāng)對(duì)其他模型進(jìn)行分析時(shí)沒有觀察到顯著影響（文中未示出）。這些分析表明，沒有個(gè)別研究影響薈萃分析的結(jié)果，即研究結(jié)果較為可靠和穩(wěn)定。

中間的縱軸是總體合并后的OR值，兩邊的縱軸分別是合并后的OR值的95%可信區(qū)間，每個(gè)小圓圈代表省略該項(xiàng)研究后其余研究合并后的OR值，由圖中可以看出無論省略哪些研究其余研究合并后的OR值總是在95%可信區(qū)間內(nèi)，故各個(gè)研究較為穩(wěn)健，結(jié)果較為可靠。

2.4 發(fā)表偏倚

在對(duì)OR值的比較分析中，等位基因模型、純合模型及隱形模型均沒有發(fā)現(xiàn)發(fā)表偏倚，而在雜合模型和顯性模型分析中Egger's檢驗(yàn)存在發(fā)表偏倚，而Begger's檢驗(yàn)無發(fā)表偏倚，如表3，而本薈萃分析納入研究數(shù)量只有8個(gè)研究，數(shù)量較少，Begger's檢驗(yàn)更可靠，可以認(rèn)為無明顯發(fā)表偏倚。在所有的遺傳模型中，漏斗圖基本對(duì)稱，等位基因模型（C/T）Begger's檢驗(yàn)漏斗圖，見圖4（其他模型文中未示出）。Begger's檢測(cè)提示無明顯發(fā)表偏倚（P均＞0.05），結(jié)論可信度較高。

表3 Egger's檢驗(yàn)和Begger's檢驗(yàn)結(jié)果

圖3 個(gè)體研究對(duì)特發(fā)性男性不育患者CYP1A1基因rs4646903位點(diǎn)多態(tài)性的合并OR值等位基因比較的影響

圖4 特發(fā)性男性不育癥等位基因模型下Begger's漏斗圖

3 討論

特發(fā)性男性不育是目前全世界非常突出的一個(gè)問題。一些研究表明，在過去幾十年里，人類的精液數(shù)量和質(zhì)量均顯著下降，可能的原因雖然還不太清楚，但有人提出環(huán)境因素與精子功能不良和不育癥的情況有關(guān)[1,21-23]。外界的環(huán)境因素進(jìn)入人體內(nèi)會(huì)轉(zhuǎn)化成一種多環(huán)芳烴對(duì)人體致病，而CYP1A1酶參與多環(huán)芳烴的I相代謝，代謝過程中產(chǎn)生一種DNA加合物的中間代謝產(chǎn)物，這種中間代謝產(chǎn)物對(duì)人類生殖有潛在的毒性[3-4]。CYP1A1基因編碼CYP1A1酶，CYP1A1基因位點(diǎn)的多態(tài)性影響著酶的表達(dá)。目前，已經(jīng)有許多相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道了CYP1A1基因不同位點(diǎn)的多態(tài)性可能與男性不育相關(guān)。Aydos等[24]報(bào)道了CYP1A1基因rs4646422位點(diǎn)的多態(tài)性可能導(dǎo)致男性不育。而更多的研究則集中在CYP1A1基因rs4646903位點(diǎn)多態(tài)性與特發(fā)性男性不育的相關(guān)性上，Lu等[13]對(duì)中國漢族人群進(jìn)行了研究，報(bào)道認(rèn)為CYP1A1基因rs4646903位點(diǎn)多態(tài)性與中國漢族人群男性不育不相關(guān)；陳文成等[15]報(bào)道CYP1A1基因rs4646903位點(diǎn)多態(tài)性與中國壯族少精子癥相關(guān)；彭亮等[17]報(bào)道CYP1A1基因rs4646903與寧夏地區(qū)男性不育不存在相關(guān)性，Vani等[14]報(bào)道CYP1A1rs4646903與印度男性不育存在相關(guān)性。以上結(jié)果并不一致，可能與研究的人群、區(qū)域、樣本量大小有關(guān)。為了得到一個(gè)全面的、可信的關(guān)于CYP1A1基因rs4646903位點(diǎn)多態(tài)性與男性不育的相關(guān)性結(jié)論，筆者進(jìn)行了本次研究。通過檢索數(shù)據(jù)庫、制定納入和排除標(biāo)準(zhǔn)、用stata 12.0軟件合并分析數(shù)據(jù)完成了本篇meta分析文章?？傮w而言，在等位基因模型、純合基因模型、顯性模型以及隱形模型中，CYP1A1基因rs4646903位點(diǎn)多態(tài)性與特發(fā)性男性不育相關(guān)，而根據(jù)種族進(jìn)行亞組分析中卻并沒有進(jìn)一步顯示男性不育的易感性；根據(jù)樣本量進(jìn)行亞組分析顯示在大樣本中并沒有表現(xiàn)出男性不育的易感性，相反，在小樣本比較中卻發(fā)現(xiàn)在等位基因模型、顯性模型進(jìn)一步表現(xiàn)出了對(duì)男性不育的易感性，可能與樣本含量小、存在偏倚有關(guān)。在進(jìn)一步的亞組分析中出現(xiàn)這種陰性結(jié)果可能是由于meta分析中包含的高加索人和亞洲人的研究和人口數(shù)量有限。既往有學(xué)者[25]納入7篇文獻(xiàn)認(rèn)為等位基因模型、雜合模型、顯性模型和隱形模型中，CYP1A1rs4646903位點(diǎn)多態(tài)性與特發(fā)性男性不育顯著相關(guān)，其進(jìn)一步的亞組分析顯示，在等位基因模型、雜合模型和顯性模型中，亞洲人群CYP1A1基因rs4646903位點(diǎn)與特發(fā)性男性不育顯著相關(guān)?？紤]到其納入的一項(xiàng)研究中的基因位點(diǎn)不是CYP1A1rs4646903位點(diǎn)，而且其亞組分析中把印度人歸類于黃種人群，結(jié)果偏頗。而在本研究中，距最近的一次meta分析又有2個(gè)新的研究能納入meta分析，而且其報(bào)道結(jié)果也是不同，本研究根據(jù)種族進(jìn)行亞組分析時(shí)結(jié)合以往已發(fā)表文獻(xiàn)的人群分類方法及歷史地理情況將印度人群歸類于高加索人，而且納入的8篇文獻(xiàn)質(zhì)量較高，總體樣本量較大，結(jié)果更為可靠，為今后進(jìn)一步的研究提供參考。

但本次研究也具有較大的局限性，首先，對(duì)結(jié)果的解釋應(yīng)該更為審慎，因?yàn)榇蠖鄶?shù)的比較中存在明顯的異質(zhì)性，雖然通過亞組分析明確了一些基因型異質(zhì)性的來源；其次，納入的文獻(xiàn)研究中由于缺乏其他匹配因素（諸如年齡、吸煙情況及其他的環(huán)境因素）限制了進(jìn)一步分層分析以明確異質(zhì)性來源；此外，納入的樣本量還是偏少，納入的研究主要集中在中國、印度這些國家，還有語種僅限于中文和英語，存在一定的發(fā)表偏倚?？傊獪?zhǔn)確地得出CYP1A1rs4646903位點(diǎn)多態(tài)性與特發(fā)性男性不育的關(guān)系，要綜合考慮到上述各種因素，需要更大的樣本量和更多的研究，還有更為精心的匹配設(shè)計(jì)才能得到正確而全面的結(jié)論。