張雨桐 張彥軍 徐飛 譚樂(lè)和 李士澤

摘 ?要??采用普魯蘭酶和異淀粉酶制備脫支菠蘿蜜種子淀粉（debranched jackfruit seed starch，DS）及脫支菠蘿蜜種子支鏈淀粉（debranched jackfruit seed amylopectin，DAP），旨在研究所得DS和DAP之間的差異。結(jié)果表明，DS具有較寬的分子量分布，而DAP具有較窄的分子量分布。普魯蘭酶水解α-1，6糖苷鍵更完全，所以普魯蘭酶DS和DAP平均分子量更低。普魯蘭酶水解較短側(cè)鏈更有效，異淀粉酶則可水解外分支鏈。異淀粉酶DAP具有高比例B2鏈、B3鏈和長(zhǎng)平均鏈長(zhǎng)，導(dǎo)致其具有低的峰值黏度、谷值黏度、崩解值、最終黏度和回生值，但糊化溫度高。因此，淀粉脫支酶的選擇和直鏈/支鏈淀粉組成均能導(dǎo)致淀粉分子結(jié)構(gòu)和糊化特性顯著不同（p<0.05），可根據(jù)特定需要選擇合適制備方法增強(qiáng)或抑制菠蘿蜜種子淀粉固有性質(zhì)或賦予其新的特定性質(zhì)。

關(guān)鍵詞 ?菠蘿蜜種子淀粉;脫支淀粉;普魯蘭酶;異淀粉酶;分子結(jié)構(gòu);糊化特性中圖分類號(hào)??TS231??????文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼??A

Effect of Different Starch Debranching Enzymes on the Molecular Structure of Jackfruit Seed Starch and Pasting Properties

ZHANG Yutong¹， ZHANG Yanjun^2*， XU Fei²， TAN Lehe²， LI Shize^1*

1.?College of Food Science， Heilongjiang Bayi Agricultural University， Daqing， Heilongjiang 163319， China; 2. Spice and Beverage Research Institute， Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences， Wanning， Hainan 571533， China

Abstract ?Debranched jackfruit seed starch （DS） and debranched jackfruit seed amylopectin （DAP） were prepared by pullulanase or isoamylase， and the differences between the DS and DAP?was investigated. The results showed that DS had a broad molecular weight distribution while DAP had a narrow molecular weight distribution. Pullulanase DS and DAP had a lower average molecular weight due to more complete hydrolysis of the α-1，6 glycosidic bonds. Pullulanase hydrolysis was more effective for shorter lateral chains， whereas isoamylase could?hydrolyze outer branching linkages of amylopectin. Isoamylase DAP had a higher proportion of B2， B3 chains and the longest average chain length， resulting in a lower peak viscosity， trough viscosity， breakdown， final viscosity and setback， but a higher gelatinization temperature. Therefore， both the selection of starch debranching enzymes and the amylose/amylopectin composition could lead to the significant?differences?（p<0.05） in the molecular structure and pasting properties. According to the specific needs， the appropriate methods could be used to enhance or inhibit the inherent properties of jackfruit seed starch or endow it new specific properties.

Keywords ?jackfruit seed starch; debranched starch; pullulanase; isoamylase; molecular structure; pasting properties

DOI10.3969/j.issn.1000-2561.2019.01.022

菠蘿蜜（Artocarpus heterophyllusLam.）為桑科（Moraceae），是熱帶地區(qū)典型常綠樹(shù)種之一^[1]。千年之前被引入中國(guó)，主要栽培在我國(guó)海南、廣東、廣西、云南和四川南部的熱帶、亞熱帶地區(qū)以及南亞熱帶地區(qū)^[2]。菠蘿蜜是世界上最大的可食用水果，由外皮、黃色果肉、鱗莖和種子組成。種子占果實(shí)總重的8%～15%^[1]，富含大量淀粉，占干物質(zhì)的60%～80%^[3]。菠蘿蜜種子淀粉（jackfruit seed starch，JFSS）的研究利用仍處于初級(jí)階段，雖對(duì)JFSS的性質(zhì)進(jìn)行了研究，驗(yàn)證了其在食品和其他用途中的適用性^[4]，但JFSS的分子結(jié)構(gòu)還需進(jìn)一步研究。

淀粉分子結(jié)構(gòu)一直是食品科研人員的研究重點(diǎn)，主要包括淀粉精細(xì)結(jié)構(gòu)，支鏈鏈長(zhǎng)分布是最普遍的精細(xì)結(jié)構(gòu)分析之一^[5]。目前有關(guān)JFSS分子結(jié)構(gòu)報(bào)道較少，Zhang等^[1]報(bào)道了JFSS直鏈和支鏈淀粉平均分子量，表明分子大小隨直鏈和支鏈淀粉平均分子量增加而增加。Zhang等^[1]研究了普魯蘭酶脫支菠蘿蜜種子支鏈淀粉（debranched?jackfruit seed amylopectin，DAP），發(fā)現(xiàn)高比例A鏈可形成致密結(jié)構(gòu)，高比例B2和B3鏈與平均鏈長(zhǎng)相關(guān)。Luciano等^[6]選取異淀粉酶脫支JFSS（debranched JFSS，DS），發(fā)現(xiàn)軟JFSS的A鏈比例低于硬JFSS，B1、B2、B3鏈和平均鏈長(zhǎng)高于硬JFSS。目前，DS和DAP的平均分子量尚未見(jiàn)報(bào)道，JFSS鏈長(zhǎng)分布雖存在少量研究，但淀粉脫支酶的選擇卻不統(tǒng)一，對(duì)淀粉或支鏈淀粉進(jìn)行水解也存在不一致性。

本研究中，以JFSS及支鏈淀粉作為原料，通過(guò)高性能體積排阻色譜-多角度激光散射檢測(cè)器-示差折光檢測(cè)器（high-performance size exclusion chromatography-multi-angle laser light-scattering detector-refractive index detector，HPSEC-MALLS-?RI）聯(lián)用系統(tǒng)分析DS和DAP分子量特征，采用高效陰離子交換色譜-脈沖安培檢測(cè)器（high-per for mance anion-exchange chromatography?with pulsed amperometric detection，HPAEC-PAD）確定DS和DAP鏈長(zhǎng)分布，并且利用快速黏度分析儀（rapid visco analyzer，RVA）測(cè)定DS和DAP糊化特性，以確定不同淀粉脫支酶對(duì)DS和DAP分子結(jié)構(gòu)和糊化特性的影響，為JFSS的進(jìn)一步研究提供理論基礎(chǔ)。

1??材料與方法

1.1材料

1.1.1 ?植物材料與試劑??菠蘿蜜種子由中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院香料飲料研究所提供，為馬來(lái)西亞引進(jìn)品種。普魯蘭酶，美國(guó)Sigma公司;異淀粉酶，愛(ài)爾蘭Megazyme公司;二甲基亞砜（色譜純），德國(guó)Meker公司;葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)品T40，美國(guó)Sigma公司;醋酸鈉（色譜純），美國(guó)Dionex公司;氫氧化鈉（色譜純），德國(guó)Meker公司。其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.1.2 ?儀器與設(shè)備??HPSEC-MALLS-RI高效液相色譜系統(tǒng)（配有多角度激光光散射檢測(cè)器、示差折光檢測(cè)器及Astra 5.3.4數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)）：美國(guó)Waters公司;HPAEC-PAD高效液相陰離子色譜系統(tǒng)（配有脈沖安培檢測(cè)器及Chromeleon 6.8色譜工作站）：美國(guó)Dionex公司;TechMaster快速黏度分析儀：瑞典perten儀器公司;LXJ-IIB離心機(jī)：上海安亭科學(xué)儀器廠;Scientz-18ND冷凍干燥機(jī)：寧波新芝生物科技股份有限公司;SHZ-C水浴恒溫振蕩器：上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠;Blue pard電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱：上海一恒科學(xué)儀器有限公司;SY-100C脫殼機(jī)：臺(tái)州市鯊魚(yú)食品機(jī)械有限公司;HX-PB908多功能磨漿機(jī)：佛山市海迅電器有限公司;80膠體磨：上?？苿跈C(jī)械廠。

1.2方法

1.2.1 ?制備菠蘿蜜種子淀粉??種子置于50?℃干燥箱，外殼略干、內(nèi)種衣濕潤(rùn)時(shí)取出并去除。種仁加蒸餾水于磨漿機(jī)粉碎，粗漿與蒸餾水1∶3混合，膠體磨細(xì)磨5?min。過(guò)200目篩后水洗，5000?r/min離心10 min，沉淀與0.5 mol/L硫代硫酸鈉1∶1混合攪拌36 h。再次離心，刮去沉淀上層褐色皮并水洗，用1.0 mol/L鹽酸中和至pH?7.0，離心，沉淀用50%無(wú)水乙醇洗滌。所得JFSS于50?℃冷凍干燥至水分含量<13%^[3]。

1.2.2 ?分離菠蘿蜜種子支鏈淀粉??JFSS加蒸餾水配成質(zhì)量分?jǐn)?shù)3%的溶液，于100?℃水浴搖床1?h。5000?r/min離心10?min，沉淀加蒸餾水配成質(zhì)量分?jǐn)?shù)3%的溶液，于100?℃水浴搖床1 h，再次離心去除殘留直鏈淀粉，沉淀加甲醇配制成質(zhì)量分?jǐn)?shù)80%的溶液，渦旋2?min，離心，沉淀為支鏈淀粉。所得支鏈淀粉于50?℃冷凍干燥至水分含量<13%^[1]。

1.2.3 ?測(cè)定分子量分布??JFSS或支鏈淀粉22.5?mg分別溶于二甲基亞砜溶液0.3?mL（色譜純），100?℃加熱10 min后沸水浴10 min。冷卻后，加1.5?mL醋酸鈉緩沖溶液（1.0?mol/L，pH 4.0），5?μL普魯蘭酶或異淀粉酶（1000 U/mL），40?℃水浴24 h脫支，取出后沸水浴滅酶20 min。DS和DAP以12?000 r/min離心10?min，上清液過(guò)0.22 μm聚四氟乙烯濾膜^[7]。

流動(dòng)相：50 mmol/L硝酸鈉-二甲基亞砜，超聲20 min;流速：0.6 mL/min;色譜柱：Styragel HMW 6E DMF和HMW 2 MF串聯(lián);柱溫：45?℃;RI檢測(cè)器：40?℃;進(jìn)樣量：100 μL。葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)品：T40，2 mg/mL，用于MALLS中檢測(cè)器歸一化^[7]。采用Astra 5.3.4軟件采集分析光散射數(shù)據(jù)和示差檢測(cè)器信號(hào)。曲線擬合用采二階Berry模型，計(jì)算重均分子量（weight average molecular weight，Mw）、數(shù)均分子量（number average molecular weight，Mn）、平均旋轉(zhuǎn)半徑（average radius of gyration，Rg）和多分散性（polydis persit

-yindices，PI）^[7]。

1.2.4 ?測(cè)定支鏈淀粉精細(xì)結(jié)構(gòu)??JFSS或支鏈淀粉40 mg，加2 mL醋酸鈉緩沖溶液（50 mmol/L，pH 6.0），沸水浴30 min，55?℃水浴10 min，加5 μL普魯蘭酶或異淀粉酶（1000 U/mL），55?℃水浴24?h，沸水浴滅酶20?min，冷卻后12?000?r/min離心10 min，取上清液，過(guò)0.45?μm水系濾膜，稀釋10倍進(jìn)樣^[1]。

流動(dòng)相：屈臣氏蒸餾水（A），0.25?mol/L氫氧化鈉（B），0.1?mol/L氫氧化鈉+1 mol/L醋酸鈉（C）;流速：0.5?mL/min;色譜柱：Cabo Pac PA20（3?mm×?150 mm）分析柱和Carbo Pac PA20（3 mm×30?mm）保護(hù)柱;柱溫：30?℃;進(jìn)樣量：10?μL;脈沖積分安培檢測(cè)：Au工作電極，Ag/AgCl參比電極，檢測(cè)電位波形為標(biāo)準(zhǔn)四電位波形^[1]。采用峰值分析軟件確定A、B1、B2和B3鏈聚合度所占比例^[8]。1.2.5 ?測(cè)定糊化特性??JFSS或支鏈淀粉3.0 g與25 mL蒸餾水混合，在RVA容器中960 r/min攪拌10 s，然后以160 r/min進(jìn)行剩余程序。50?℃保持1?min后，以6?℃/min加熱至95?℃并保持5?min，以6?℃/min冷卻至50?℃并保持2?min。記錄糊化參數(shù)峰值黏度、最低黏度、崩解值、最終黏度、回生值和糊化溫度^[3]。

1.3數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 19.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，p<0.05為顯著;采用Origin 8.5軟件繪圖。

2??結(jié)果與分析

2.1分子量分布

DS和DAP的平均分子量分布如圖1和圖2所示，基于Berry擬合模型計(jì)算的Mw、Mn、Rg和PI如表1所示。觀察到DS和DAP的Mw、Mn、Rg和PI存在顯著差異（p<0.05）。DS和DAP的Mw、Mn、Rg和PI分別是2.37×10⁶～4.41× 10⁶g/mol、1.24×10⁶～2.94×10⁶g/mol、80.7～99.4 nm和1.5～1.9。

2.2 支鏈淀粉分支鏈長(zhǎng)分布

分支鏈長(zhǎng)分布常用的分配方式為A鏈（DP 6-12）、B1鏈（DP 13-24）、B2鏈（DP 24-36）和B3鏈（DP≥37）^[9]，此種分配方式被用于異淀粉酶脫支處理，因?yàn)楫惖矸勖覆荒芩庥?～3個(gè)葡萄糖殘基構(gòu)成的側(cè)枝^[10]。普魯蘭酶可以水解較短的側(cè)鏈（麥芽糖或麥芽三糖）^[11]，所以分配方式為A鏈（DP?2-12），其余相同。

DS和DAP的分支鏈長(zhǎng)分布如圖3和圖4所示，比例分配結(jié)果如表2所示。DS和DAP的分支鏈長(zhǎng)分布觀察到顯著差異（p<0.05）。DS和DAP的A鏈、B1鏈、B2鏈和B3鏈分別為39.84%～ 44.18%、37.95%～39.63%、13.26%～18.94%和2.93%～ 3.27%。平均鏈長(zhǎng)為鏈長(zhǎng)分布的平均值，DS和DAP平均鏈長(zhǎng)為DP 17.02～18.66。

2.3 糊化特性

DS和DAP的糊化參數(shù)如表3所示。DS和DAP的糊化特性觀察到顯著差異（p<0.05）。DS和DAP的峰值黏度、谷值黏度、崩解值、最終黏度、回生值和糊化溫度分別為156～338 cP、105～ 236?cP、50～102?cP、424～689?cP、120～234?cP和50.15～62.47?℃。

3討論

DS的Mw、Mn和Rg均高于DAP的Mw、Mn和Rg。Cai等^[12]的研究表明，蠟質(zhì)淀粉產(chǎn)生的線性直鏈分子具有較窄的分子量分布，含直鏈的淀粉（如普通淀粉和高直鏈淀粉）產(chǎn)生的線性直鏈分子具有較寬的分子量分布。普魯蘭酶DS和DAP的Mw、Mn和Rg均低于異淀粉酶DS和DAP的Mw、Mn和Rg，這是由于普魯蘭酶水解α-1，6糖苷鍵完全，導(dǎo)致分子量明顯下降^[13]。普魯蘭酶能專一性切開(kāi)支鏈淀粉分支點(diǎn)中α-1，6糖苷鍵，將最小單位的支鏈分解，使水解產(chǎn)物中含有更多游離線性直鏈淀粉分子，最大限度利用淀粉原料^[14];而異淀粉酶雖然也能水解糖原或支鏈淀粉分枝點(diǎn)的α-1，6糖苷鏈，形成長(zhǎng)短不一的線性直鏈淀粉分子，但是卻不能水解由2～3個(gè)葡萄糖殘基構(gòu)成的側(cè)枝^[10]。Zhang等^[15]的研究表明，JFSS的Mw、Mn、Rg和PI分別是1.74×10⁷～4.61×?10⁷g/mol、1.10×10⁷～2.34×10⁷g/mol、115.4～144.2?nm和1.4～ 2.0。Zhang等^[1]報(bào)道，JFSS支鏈淀粉的Mw、Mn、Rg和PI分別為2.51×10⁷～6.74×10⁷g/mol、1.87×10⁷～5.36×10⁷g/mol、94.6～136.5?nm和1.21～?1.41。對(duì)比前人研究結(jié)果，DS和DAP平均分子量較正常JFSS及支鏈淀粉平均分子量明顯降低，是由于普魯蘭酶和異淀粉酶通過(guò)水解α-1，6糖苷鍵，導(dǎo)致其形成低分子量的線性直鏈分子^[16-17]。普魯蘭酶脫支甘薯淀粉的Mw、Mn和PI分別是3.07×10⁷～3.09×10⁷g/mol、2.81×10⁵～3.00×10⁵g/mol和10.31～10.92^[18]，普魯蘭酶脫支蠟質(zhì)大米淀粉的Mw、Mn、Rg和PI分別是3.19×10⁵g/mol、6.12×10⁴g/mol、22.80?nm和5.33^[19]，異淀粉酶脫支馬鈴薯、小麥、玉米和蠟質(zhì)玉米淀粉的Mw和Rg范圍是2.5×10⁴～3×10⁵g/mol和5～20 nm^[20]。對(duì)比前人研究結(jié)果，普魯蘭酶DS的Mw、Mn和PI低于普魯蘭酶脫支甘薯淀粉;普魯蘭酶DAP的Mw、Mn和Rg高于普魯蘭酶脫支蠟質(zhì)大米，但PI低于普魯蘭酶脫支蠟質(zhì)大米;異淀粉酶DS和DAP的Mw和Rg高于異淀粉酶脫支馬鈴薯、小麥、玉米和蠟質(zhì)玉米淀粉。不同植物來(lái)源、種植環(huán)境和淀粉組成均能導(dǎo)致平均分子量顯著不同^[21]。

DS的A鏈和B1鏈高于DAP，但B2鏈和B3鏈低于DAP，可能是由于JFSS中含直鏈淀粉，DS產(chǎn)生線性直鏈淀粉分子與JFSS中原有直鏈淀粉結(jié)合，因此與DAP存在差異。Tester等^[22]報(bào)道了淀粉中直鏈/支鏈淀粉組成強(qiáng)烈影響其對(duì)酶水解的敏感性。普魯蘭酶DS和DAP的A鏈和B1鏈分別高于異淀粉酶DS和DAP的A鏈和B1鏈，是由于普魯蘭酶水解反應(yīng)對(duì)于較短的側(cè)鏈更有效^[11]，水解后短鏈含量明顯增加^[23]。普魯蘭酶DS和DAP的B2鏈和B3鏈分別低于異淀粉酶DS和DAP的B2鏈和B3鏈，是由于普魯蘭酶難以切割更長(zhǎng)側(cè)鏈，水解長(zhǎng)鏈相對(duì)困難^[11]。因此，不同淀粉脫支酶和不同直鏈/支鏈淀粉組成均能導(dǎo)致鏈長(zhǎng)分布顯著不同。異淀粉酶DAP平均鏈長(zhǎng)最長(zhǎng)，普魯蘭酶DS平均鏈長(zhǎng)最短，Zhang等^[1]報(bào)道最長(zhǎng)的平均鏈長(zhǎng)與高比例的B2鏈和B3鏈直接相關(guān)。大米淀粉A鏈、B1鏈、B2鏈、B3鏈和平均鏈長(zhǎng)范圍是17.3%～19.4%、57.4%～58.9%、12.7% ～14.0%、10.0%～10.9%和DP 20.6～21.2^[24]。蠟質(zhì)玉米A鏈、B1鏈、B2鏈、B3鏈和平均鏈長(zhǎng)范圍是37.27%、38.79%、11.49%、12.46%和DP 19.65^[25]。對(duì)比前人研究結(jié)果，大米淀粉A鏈和B2鏈小于DS，B1鏈、B3鏈和平均鏈長(zhǎng)大于DS;蠟質(zhì)玉米的A鏈、B1鏈和B2鏈小于脫支DAP，B3鏈和平均鏈長(zhǎng)大于DAP。不同的植物來(lái)源、淀粉組成、水解條件等均會(huì)造成上述差異^[25-26]。