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        基于HS-SPME-GC-O-MS的西番蓮果汁香氣成分分析方法

        2019-06-11 09:40:06龍倩倩林麗靜袁源龔霄李國鵬馬麗娜李積華黃葦
        熱帶作物學(xué)報(bào) 2019年1期
        關(guān)鍵詞:總峰西番蓮頂空

        龍倩倩 林麗靜 袁源 龔霄 李國鵬 馬麗娜 李積華 黃葦

        摘 ?要??因西番蓮果汁具有多種水果的濃郁香味,可建立更全面的氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用檢測(cè)條件。利用氣相色譜-嗅聞-質(zhì)譜聯(lián)用(GC-O-MS)技術(shù)確定西番蓮果汁中14種香氣主要揮發(fā)性成分,再結(jié)合頂空-固相微萃取-氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(HS-SPME-GC-MS)分析不同萃取條件下西番蓮果汁的香氣主要揮發(fā)性成分,建立萃取方法。通過實(shí)驗(yàn)分析,得到條件如下:未添加氯化鈉的西番蓮果汁,取汁量為0.5 mL,65 μm DVB/PDMS萃取頭,萃取溫度40?℃,萃取時(shí)間20 min,解吸時(shí)間5 min。鑒定得到62種揮發(fā)成分,包括酯類、醇類、烯類、酮類化合物,其中酯類化合物為71.58%,是西番蓮果汁香氣的主要貢獻(xiàn)化合物類,此檢測(cè)方法有效可行。

        關(guān)鍵詞 ?西番蓮;頂空-固相微萃取-氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(HS-SPME-GC-MS);香氣成分;氣相色譜-嗅聞-質(zhì)譜聯(lián)用(GC-O-MS)中圖分類號(hào)??S667.9??????文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼??A

        Analysis Conditions of Volatile Aroma Components in Passion Fruit Juice by HS-SPME-GC-O-MS

        LONG Qianqian1,2,3, LIN Lijing2, YUAN Yuan2, GONG Xiao2, LI Guopeng2, MA Lina2, LI Jihua2,HUANG Wei1*

        1. College of Food Sciences,?South China Agricultural University, Guangzhou, Guangdong 510642, China;?2. Agricultural Product Processing Research Institute, Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences, Zhanjiang, Guangdong 524001, China;?3. Tongren Institute for Food and Drug Control, Tongren, Guizhou 554300, China

        Abstract ?Passion?fruit?juice has rich aroma of various?fruits, and it is possible to establish more comprehensive conditions for gas chromatography-mass spectrometry. The main components of 14 types of?aroma from passion fruit juice were determined by gas chromatography-olfactometry-mass spectrometry?(GC-O-MS), and the main aroma components under different extraction conditions were analyzed by head space-solid phase micro-extraction-gas chromatography-mass spectrometry?(HS-SPME-GC-MS). Through experimental analysis,?the conditions was as follows: passion fruit juice without NaCl 0.5 mL, extraction fiber 65 μm?DVB/PDMS, extraction temperature 40?℃, extraction time 20 min, desorption time 5 min. Sixty-two volatile components were determined, including esters, alcohols, alkenes and ketones, and the esters (71.58%), which dominated the aroma of passion fruit?juice,?this method was effective and feasible.

        Keywords ?passion fruit; head?space-solid?phase micro-extraction-gas chromatography-mass spectrometry (HS-SPME- GC-MS); volatile aroma components;?gas chromatography-olfactometry-mass?spectrometry (GC-O-MS)

        DOI10.3969/j.issn.1000-2561.2019.01.024

        西番蓮(Passiflora caeruleaL.)是西番蓮科西番蓮屬的多年生常綠藤本植物,原產(chǎn)于巴西,目前在東南亞、澳洲、南美洲及非洲南部等熱帶、亞熱帶地區(qū)廣泛種植,其中巴西是世界上西番蓮鮮果和加工品最大的生產(chǎn)國和消費(fèi)國,主要種植品種為黃果西番蓮[1]。西番蓮為一年多次成熟植物,果實(shí)采收期長,有9個(gè)多月,隨熟隨采隨時(shí)供應(yīng)[2]。西番蓮果除食用以外,同時(shí)具有保健功能,如活血強(qiáng)身、滋陰補(bǔ)腎、生津止渴等[3]。因西番蓮果汁的香味中含有165種芳香化合物而被譽(yù)為世界上最芳香的水果,是飲料加工的優(yōu)質(zhì)原料[4]。所以,研究西番蓮果汁香氣成分,建立檢測(cè)方法,對(duì)進(jìn)一步研究選擇西番蓮的品種、產(chǎn)品加工、香氣合成都有極其重要的意義。

        固相微萃?。⊿PME)技術(shù)可以靈活應(yīng)用于富集氣體、液體、固體等多種樣品中的各類揮發(fā)性或半揮發(fā)性物質(zhì)分析[5],具有樣品制備方便、快捷,不使用有機(jī)溶劑,且樣品用量少,能較為真實(shí)地反映樣品本身的揮發(fā)性成分等優(yōu)點(diǎn)[6],所以固相微萃取在近幾年應(yīng)用研究頗多,但建立的多數(shù)是手動(dòng)進(jìn)樣的方法[7-9]。手動(dòng)進(jìn)樣易導(dǎo)致人為誤差,需要的樣品量遠(yuǎn)大于自動(dòng)進(jìn)樣,自動(dòng)進(jìn)樣可盡量避人為誤差。目前,西番蓮果汁中少量成分未見標(biāo)準(zhǔn)品,依靠質(zhì)譜檢索存在不確定性,因不同的GC-MS性能和分離柱柱效有差異,分離效果有所不同[10]。故采用保留指數(shù)(retention index,RI)法[11]結(jié)合質(zhì)譜檢索可增加定性的可信度,解決定性不夠準(zhǔn)確的問題。國內(nèi)研究大多通過揮發(fā)性成分總峰面積建立相關(guān)檢測(cè)方法,整體揮發(fā)性成分不全代表整體香氣成分,忽略其揮發(fā)性成分的香氣閾值。利用GC-O-MS通過人嗅覺感知選取與西番蓮果汁特征香味有關(guān)成分,體現(xiàn)香氣變化趨勢(shì)從而建立檢測(cè)方法,解決以往研究不能覆蓋使用以及不夠全面的問題。

        1??材料與方法

        1.1材料

        1.1.1 ?原料??鮮紫果西番蓮(廣西南寧,2016年9月產(chǎn)),手工過濾,經(jīng)4層紗布過濾去籽取汁,于–80?℃冰箱冷凍待測(cè)。

        1.1.2 ?儀器設(shè)備??QP2010-Plus氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(配有AOC-5000頂空,固相微萃取及液體注射器三合一自動(dòng)進(jìn)樣器),日本島津公司;GC7890A-MS5925C氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀,美國Aglient公司;嗅聞裝置(ODP2),德國Gerstel公司;SPME萃取頭(Divinylbenzene/Carboxen/?Polydimethylsiloxane,DVB/CAR/PDMS,50/30 μm;Div inyl benzene/Polydimethylsiloxane,DVB/PDMS,65 μm;Carboxen/Polydi methyl silo xane,CAR/PDMS 85?μm;Polydimethylsiloxane,PDMS,100?μm;Pi lyacrylate,PA,85 μm),美國Supelco公司。

        1.2方法

        1.2.1 ?氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用條件??色譜柱:VF-wax毛細(xì)管色譜柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm);升溫程序:45?℃保持2 min,以5?℃/min升至180?℃,再以20?℃/min升至240?℃,保持5 min;載氣(He)流速1 mL/min;壓力100.0 kPa;不分流;進(jìn)樣口溫度250?℃。電子轟擊離子源(EI):電子能量70 eV;接口溫度250?℃;離子源溫度230?℃;檢測(cè)器增益電壓1.25?kV;質(zhì)量掃描范圍m/z?30~?350。萃取頭萃取條件:取已過濾的西番蓮果汁少量,分別移取0.5 mL于20 mL頂空進(jìn)樣瓶中。將進(jìn)樣瓶放置在50?℃溫度控制攪拌器中以250?r/min轉(zhuǎn)速動(dòng)態(tài)平衡15?min;再在上述條件下將萃取頭插入進(jìn)樣瓶動(dòng)態(tài)萃取15?min;然后GC-MS進(jìn)樣,解吸溫度250?℃,解吸時(shí)間5?min。

        1.2.2 ?氣相色譜-嗅聞-質(zhì)譜聯(lián)用測(cè)定條件??用與1.2.1節(jié)相同的分析條件進(jìn)行分離,流出物在毛細(xì)管末端以1∶1的分流比分別流入質(zhì)譜檢測(cè)器和ODP嗅聞裝置。挑選出經(jīng)聞香訓(xùn)練的實(shí)驗(yàn)人員3名,用時(shí)間強(qiáng)度法進(jìn)行GC-O-MS分析,并記錄保留時(shí)間和化合物的香氣強(qiáng)度和特征,香氣強(qiáng)度按1~5共5個(gè)等級(jí)記錄[12]?!?”表示能感受到香氣,“2”表示可以聞到強(qiáng)于“1”的香氣但氣味不明顯,“3”表示該氣味成分強(qiáng)度適中且氣味明顯,“4”表示味道強(qiáng)度略大,較強(qiáng)烈,“5”表示氣味明顯且強(qiáng)烈。每人做3次檢測(cè),同1人記錄1個(gè)成分2次以上且3人共有同1個(gè)記錄才認(rèn)作有效記錄,香氣強(qiáng)度為3人記錄的平均值。

        1.2.3 ?保留指數(shù)(RI)值的測(cè)定??以C7~C30正構(gòu)烷烴混合標(biāo)準(zhǔn)品配制濃度為0.1%的溶液,采取與1.2.1節(jié)相同的分析條件進(jìn)行分離,通過測(cè)定各正烷烴的保留時(shí)間來計(jì)算各成分的RI。各成分的RI值根據(jù)Kovats公式[11]進(jìn)行計(jì)算:

        式中,RI為被測(cè)成分的保留指數(shù);tx為被測(cè)成分流出峰的保留時(shí)間(min);tn為碳原子數(shù)為n的正構(gòu)烷烴流出峰的保留時(shí)間(min),tn+1為碳原子數(shù)為n+1的正烷烴流出峰的保留時(shí)間(min),且tn<tx<tn+1[12]。

        1.2.4 ?SPME方法建立??(1)萃取頭選擇。選取5種不同的萃取頭,分別為50/30?μm DVB/CAR/?PDMS(DCP),65?μm的DVB/ PDMS(DP),85?μm的CAR/PDMS(CP),100?μm的PDMS,85?μm的PA。新萃取頭在使用前預(yù)老化1?h。取少量已過濾的西番蓮果汁,與1.2.1節(jié)相同的分析條件進(jìn)行分離。

        (2)果汁量的選擇。取少量已過濾的西番蓮果汁,分別移取0.4、0.5、0.6、0.7、0.8?mL于20?mL頂空進(jìn)樣瓶中。使用DVB/ PDMS萃取頭,其他條件同1.2.1節(jié)。

        (3)氯化鈉添加量的選擇。取少量已過濾的西番蓮果汁,移取0.5 mL于20 mL頂空進(jìn)樣瓶中,分別添加氯化鈉0、0.05、0.10、0.15、0.20 g。使用DVB/ PDMS萃取頭,其他條件同1.2.1節(jié)。

        (4)萃取溫度的選擇。移取0.5?mL西番蓮果汁于20 mL頂空進(jìn)樣瓶中,不加入氯化鈉,將進(jìn)樣瓶分別放置在40、50、60、70、80?℃溫度控制攪拌器中以250?r/min轉(zhuǎn)速動(dòng)態(tài)平衡15?min;使用DVB/ PDMS萃取頭,其他條件同1.2.1節(jié)。

        (5)萃取時(shí)間的選擇。取0.5?mL西番蓮果汁于20 mL頂空進(jìn)樣瓶中,不加入氯化鈉,將進(jìn)樣瓶分別放置在40?℃溫度控制攪拌器中以250?r/min轉(zhuǎn)速動(dòng)態(tài)平衡時(shí)間15 min;再在上述條件下將萃取頭DVB/PDMS插入進(jìn)樣瓶分別動(dòng)態(tài)萃取5、10、15、20、25?min;GC-MS進(jìn)樣,其他條件同1.2.1節(jié)。

        2??結(jié)果與分析

        2.1 ?GC-O-MS技術(shù)結(jié)合保留指數(shù)為西番蓮主要揮發(fā)性成分定性

        利用GC-O-MS可直接檢測(cè)出有香味的成分,可大致判斷出其成分的閾值,對(duì)香氣進(jìn)行大致描述,而保留指數(shù)結(jié)合質(zhì)譜匹配度共同定性,大大提高了成分的定性可信度[12]。表1為通過GC-O-MS以及保留指數(shù)做參考,從而確定14種具有香氣且對(duì)整體香味具有較大影響的揮發(fā)性成分。

        2.2萃取頭的選擇

        萃取頭DCP和DP富集效果遠(yuǎn)大于其余3種萃取頭(圖1),DP和CP的主要揮發(fā)性成分峰面積百分比最高(表2),綜合比較選取DP較好。

        據(jù)報(bào)道,β-紫羅蘭酮的含量對(duì)西番蓮果汁的香氣有很大影響[15],兩者呈正相關(guān);芳樟醇香味較為明顯,是一味持久清新的香氣[16];羅勒烯有清新花香,易高溫分解,需關(guān)注其變化。由圖1可知,在羅勒烯、芳樟醇、β-紫羅蘭酮這幾種成分富集上DP較高于其他萃取頭。而DP好于DCP的原因可能有2個(gè),其一是DP萃取頭為雙極性偏非極性,而本研究選取的這14種主要揮發(fā)性成分中非極性的成分稍多,所以萃取頭DP較優(yōu);其二可能是由于萃取頭DCP比DP增加1種涂層,雖然可以吸附更多成分,但同時(shí)也使得目標(biāo)主要揮發(fā)性成分的峰面積總百分比降低。綜上所述,在西番蓮果汁的萃取頭選取實(shí)驗(yàn)中萃取頭DVB/ PDMS(DP)較優(yōu)于其他萃取頭。

        2.3果汁量的選擇

        由于固相微萃取需要較長時(shí)間才可達(dá)到真正意義上的分配平衡,所以確定果汁量可以無須達(dá)到分配平衡,只需保證其他萃取條件相同,萃取成分與原始成分呈正比即可[17]。隨著果汁量增加,使得分子量小的成分峰面積出現(xiàn)上升后下降的趨勢(shì)(圖2),分子量大的成分峰面積呈上升趨勢(shì),對(duì)月桂烯、乙酸己酯、乙酸葉醇酯、丁酸葉醇酯、β-紫羅蘭酮等成分影響較小,主要揮發(fā)性成分峰面積百分比差異不大(表3),0.5 mL果汁量的主要揮發(fā)性成分峰面積百分比相對(duì)于其他果汁量要高,不同果汁量下的峰面積無顯著差異,證明自動(dòng)進(jìn)樣對(duì)果汁量的影響沒有手動(dòng)萃取因頂空氣體空間限制而導(dǎo)致樣品體積與頂空體積存在的顯著相互關(guān)系,但樣品量過大容易造成質(zhì)譜檢測(cè)器飽和,引起定性錯(cuò)誤,綜合以上考慮,確立自動(dòng)進(jìn)樣條件下采用0.5 mL的果汁量。

        2.4氯化鈉的選擇

        氯化鈉的加入可產(chǎn)生鹽析效應(yīng),降低揮發(fā)物在水中的溶解性,使得揮發(fā)物更易揮發(fā),進(jìn)入頂空空間,被萃取頭吸附[18-20]。綜合圖3和表4可知,增加氯化鈉添加量使得分子量小的成分先上升后下降,而相對(duì)而言,則呈明顯遞減的趨勢(shì),己酸己酯尤為明顯;羅勒烯呈遞減趨勢(shì),而芳樟醇在添加0.1 g時(shí)增加明顯,這可能是因?yàn)槁然c增大了溶液的離子強(qiáng)度,使得基質(zhì)降低了對(duì)揮發(fā)性成分的束縛[21],使得芳樟醇從西番蓮中大量揮發(fā)出來,增強(qiáng)了萃取的效果。雖然,增加氯化鈉使得西番蓮果汁香氣整體種類和總峰面積有所增加,但是主要揮發(fā)性成分總峰面積減少,總峰面積百分比減少,這可能是由于萃取頭可吸附的揮發(fā)性成分是有限的,萃取成分增加會(huì)導(dǎo)致原有主要揮發(fā)性成分比例相應(yīng)減弱。揮發(fā)性成分種類增加的同時(shí)也造成了主要揮發(fā)性成分物質(zhì)的峰面積百分比下降,綜合考慮,選擇不添加氯化鈉的原汁作為測(cè)試樣品。

        2.5萃取溫度的選擇

        溫度對(duì)西番蓮果汁的主要揮發(fā)性成分有較大影響(圖4)。隨著溫度的增加,分子量較小的酯類隨著萃取溫度的升高逐漸減少,在60?℃以上,其他成分也有相同的趨勢(shì)。從組成成分來看,40?℃對(duì)分子量較小的成分有較好的吸附效果,60?℃對(duì)分子量較大的成分有較好的吸附效果,這可能是因?yàn)橄銡馕镔|(zhì)與萃取頭之間存在著吸附與解吸的動(dòng)態(tài)平衡,升高溫度加速分子運(yùn)動(dòng),加快香氣物質(zhì)的傳質(zhì)速率,使香氣物質(zhì)易于揮發(fā)到頂空氣體中被萃取頭吸附[21-22]。低溫使得分子量較小的成分先揮發(fā)到頂空被萃取頭吸附,分子量較大的成分揮發(fā)較少,適當(dāng)?shù)母邷厥沟梅肿恿看蟮某煞珠_始大量揮發(fā)至頂空,頂空氣體成分比例發(fā)生改變,分子量小的成分萃取頭吸附隨之減少,吸附分子量大的成分則增加,但溫度繼續(xù)升高導(dǎo)致主要揮發(fā)性成分在頂空氣體所占比例下降,在萃取頭涂層和頂空氣體中的分配系數(shù)下降,使得吸附能力下降,這印證了表5中主要揮發(fā)性成分總峰面積百分比減少的趨勢(shì)。考慮到溫度過高可能使揮發(fā)性成分發(fā)生一系列的化學(xué)變化,不能較好地反映樣品真實(shí)的香氣特征,且部分主要揮發(fā)性成分在60?℃時(shí)萃取到的含量過小,不利于分析,所以選取40?℃作為萃取溫度。若只對(duì)其中幾種含量較高的成分進(jìn)行分析萃取,則溫度為60?℃更佳。

        2.6萃取時(shí)間的選擇

        固相微萃取的萃取時(shí)間與主要揮發(fā)性成分在萃取頭涂層分配平衡吸附的時(shí)間有關(guān),萃取頭在接近平衡時(shí)延長時(shí)間無意義,需找尋合適的萃取時(shí)間,使得各主要揮發(fā)性成分在萃取頭涂層的分配最合適。從圖5可知,隨著萃取時(shí)間增長,各主要揮發(fā)性成分大致都是增長的趨勢(shì)。由于萃取時(shí)間短,分子量較大的揮發(fā)性成分未大量進(jìn)入頂空氣體,則分子量較小的物質(zhì)被萃取頭大量吸附,隨時(shí)間延長,分子量較大的物質(zhì)進(jìn)入頂空層,主要揮發(fā)性成分的總峰面積也隨之增長,再延長時(shí)間,導(dǎo)致其他揮發(fā)性成分增多,使得主要揮發(fā)性成分的總峰面積百分比開始遞減。在20 min后主要揮發(fā)性成分的總峰面積開始有所下降(表6)。本著節(jié)約時(shí)間和能源的原則考慮,20 min的總峰面積較高,且各主要揮發(fā)性成分分布均勻較適于其他萃取時(shí)間,以20 min作為萃取時(shí)間。

        2.7 HS-SMPE-GC-MS分析西番蓮的風(fēng)味成分

        采用固相微萃取法,取0.5 mL西番蓮果汁,不加入氯化鈉,使用65?μm的DVB/PDMS萃取頭,在40?℃下萃取20 min的條件下結(jié)合GC-MS,得到總離子流圖(圖6)。

        通過HS-SPME-GC-MS分析得到西番蓮的揮發(fā)性成分62種,種類由多到少分別為酯類29種(71.58%)、醇類11種(12.51%)、醛類8種(3.13%)、酮類6種(5.34%)、烯烴類5種(5.37%)、酸類2種(0.47%)。其中西番蓮揮發(fā)成分中酯類物質(zhì)為主要成分,其次是醇類,酮類、烯烴類雖種類偏少但是也有一定的貢獻(xiàn)。西番蓮中檢測(cè)可鑒定的揮發(fā)性成分總峰面積為98.40%,質(zhì)譜成分中14種主要揮發(fā)性成分占總峰面積的72.69%。表明此分析方法可以較為全面地表示出西番蓮揮發(fā)性成分。

        3??討論

        利用GC-O-MS結(jié)合保留指數(shù)確定主要成分的方法,直觀地找到有香味的物質(zhì),使得選取條件時(shí)更具針對(duì)性。焦嬌等[23]通過使用GC-O-MS確定了紅棗發(fā)酵酒中的重要的揮發(fā)性成分;苗愛清等[24]利用GC-O-MS對(duì)烏龍茶的香氣成分進(jìn)行了分析,確定了其主要揮發(fā)性成分;何聰聰?shù)?sup>[25]使用SPME結(jié)合GC-O-MS對(duì)鮮榨西瓜汁揮發(fā)性成分進(jìn)行了分析,確定了西瓜汁中重要揮發(fā)性成分。

        使用自動(dòng)進(jìn)樣,可以在減少樣品使用量的同時(shí)避免人為誤差,獲得較穩(wěn)定的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù),可能是由于有效的攪拌可加速分析物的擴(kuò)散速度降低靜態(tài)水膜的干擾[26],所以樣品少量的揮發(fā)成分量便足夠被吸附檢測(cè)。

        韓素芳等[27]檢測(cè)中使用與本研究不同的萃取頭,由于選取指標(biāo)的不同,且使用不同的色譜柱,從而造成選取差別。本研究中氯化鈉的添加量、溫度變化趨勢(shì)與韓素芳等[27]研究結(jié)果一致。由于研究目的不同,本文做了不同選擇。本研究認(rèn)為,添加氯化鈉后,揮發(fā)性成分并未獲得較大差距;而低溫可在節(jié)省能源的同時(shí)不易發(fā)生其他化學(xué)變化,萃取時(shí)攪拌均勻受熱穩(wěn)定,低溫已滿足需求。

        本研究發(fā)現(xiàn)在不同溫度某些主要揮發(fā)性成分有不同的萃取效果,在今后的研究中可針對(duì)不同的揮發(fā)性成分的最適揮發(fā)溫度,采用不同溫度測(cè)定。隨著科技的發(fā)展有望出現(xiàn)固相微萃取溫度可分段式處理,根據(jù)所需對(duì)萃取溫度進(jìn)行分段增加溫度的方法,使得不同的揮發(fā)性成分能較好地被吸附到萃取頭上,從而實(shí)現(xiàn)固相微萃取的更優(yōu)結(jié)果。

        此檢測(cè)方法能快速、有效地反映西番蓮的真實(shí)揮發(fā)性成分,優(yōu)于對(duì)主要揮發(fā)性成分進(jìn)行檢測(cè)研究,有利于探究不同品種/產(chǎn)地西番蓮之間的香氣區(qū)別、其香氣成分在加工中的變化及西番蓮果汁香氣保持的方法等,也可進(jìn)一步深入研究其香氣與其他化合物之間的聯(lián)系。

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