閆海霞 黃昌艷 張自斌 崔學(xué)強(qiáng) 鄧杰玲 關(guān)世凱 卜朝陽

摘 ?要??以貴港報(bào)春苣苔的葉片為外植體，研究不同培養(yǎng)基對(duì)其不定芽誘導(dǎo)和增殖、愈傷組織誘導(dǎo)與分化以及生根的影響。結(jié)果表明，外植體葉片以縱切為宜，不定芽誘導(dǎo)最適培養(yǎng)基為MS+6-BA?4.0 mg/L+IAA?1.5 mg/L，愈傷組織誘導(dǎo)最適培養(yǎng)基為MS+6-BA?3.0～5.0?mg/L+2，4-D?0.5～1.0?mg/L，不定芽誘導(dǎo)率以及愈傷組織誘導(dǎo)率均為100.00%;愈傷在MS+KT?1.0 mg/L+NAA?0.2 mg/L+potato 30 g/L+banana?30 g/L+apple 20 g/L+coconut juice 100 mL/L培養(yǎng)基上分化系數(shù)達(dá)12.64;不定芽在MS+ZT?1.0 mg/L+NAA?0.10 mg/L+potato 30 g/L+banana 30 g/L+apple 20 g/L+coconut juice 100 mL/L培養(yǎng)基的增殖系數(shù)為8.55;不定芽在3/4?MS+NAA?0.01～0.05 mg/L+活性炭1.0～3.0 g/L培養(yǎng)基上的生根率為100.00%。綜上所述，葉片縱切后能通過不定芽途徑以及愈傷組織途徑建立貴港報(bào)春苣苔的組織培養(yǎng)技術(shù)體系，在該體系下不定芽增殖系數(shù)高、愈傷分化高，組培苗生根好。

關(guān)鍵詞 ?貴港報(bào)春苣苔;組織培養(yǎng);再生體系;天然提取物中圖分類號(hào)??S68??????文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼??A

Tissue?Culture and?Plant?Regeneration of?Leaves?of?Primulina guigangensis

YAN Haixia，?HUANG Changyan，?ZHANG?Zibin，?CUI?Xueqiang， DENG?Jieling，?GUAN Shikai，?BU Zhaoyang^*

Flower Research Institute， Guangxi Academy of Agricultural Sciences， Nanning， Guangxi?530007， China

Abstract ?The effects of different media on the primary induction， adventitious buds proliferation， callus differentiation and rooting culture were investigated?using the leaves of?P. guigangensisas?the explants. The results showed that the rip cutting was the suitable method; the suitable medium for adventitious buds regeneration was MS+6-BA?4.0 mg/L+IAA?1.5 mg/L; the suitable medium for callus induction was MS+6-BA?3.0–5.0 mg/L+2，4-D?0.5–1.5 mg/L; both rate of adventitious buds induction and rate of callus induction were 100.00%; the suitable medium for callus differentiation was MS+KT?1.0 mg/L+NAA?0.2 mg/L+potato 30 g/L+banana 30 g/L+apple 20 g/L+coconut juice 100 mL/L， and the differentiation coefficient?was 12.64; the suitable medium for adventitious buds proliferation?was MS+ZT?1.0 mg/L+NAA?0.10 mg/L+potato 30 g/L+banana 30 g/L+apple 20 g/L+coconut juice 100 mL/L， and the multiplication coefficient?was 8.55; the suitable medium for rooting culture was 3/4?MS+NAA?0.01–0.05 mg/L+active carbon 1.0–3.0 g/L and the rooting rate was 100%.?It was concluded that?the leaves rip cutting could be used to establish?the?tissue culture system ofP. guigangensisby the regeneration?methods of adventitious buds and callus which had high induction and proliferation rates of adventitious buds and good rooting growth.

Keywords ?Primulina guigangensis;?tissue culture; regeneration system; natural extracts

DOI10.3969/j.issn.1000-2561.2019.01.015

貴港報(bào)春苣苔（Primulina guigangensis）為苦苣苔科報(bào)春苣苔屬的多年生草本植物。該種于2011年在廣西貴港市樟木鎮(zhèn)海拔約160 m的石灰?guī)r山區(qū)首次發(fā)現(xiàn)^[1]。其對(duì)環(huán)境的要求較苛刻，生態(tài)位極為狹小，種群數(shù)量正在逐漸減少，因此開展物種保護(hù)的研究十分必要，對(duì)其進(jìn)行人工繁殖研究獲得種苗能用于遷地保護(hù)和自然回歸。貴港報(bào)春苣苔可用種子播種和葉片扦插繁殖2種方式，種子繁殖常受種源及發(fā)芽率的影響，葉片扦插繁殖所需時(shí)間長，繁殖系數(shù)小，而組培快繁具有周期短、易成規(guī)模、繁殖后代品質(zhì)優(yōu)良的優(yōu)點(diǎn)，是人工繁殖的有效途徑之一。該技術(shù)目前在報(bào)春苣苔屬的其他植物上已有相關(guān)報(bào)道，且逐年增多^[2-12]。但貴港報(bào)春苣苔的組培快繁技術(shù)未見相關(guān)報(bào)道。因此，建立貴港報(bào)春苣苔的組培快繁體系，對(duì)進(jìn)一步保護(hù)和利用該物種具有十分重要的意義。

報(bào)春苣苔屬植物多數(shù)沒有分枝，也沒有明顯的地上莖，貴港報(bào)春苣苔也具有該屬的這一典型特征;此外，花朵、種子等器官又都受季節(jié)條件的限制，尤其種子極細(xì)小，采收煩瑣，而葉片取材容易，對(duì)母株的傷害極小，是理想的外植體類型。故本研究以貴港報(bào)春苣苔的葉片為外植體，對(duì)初代培養(yǎng)、增殖培養(yǎng)、生根培養(yǎng)的適宜培養(yǎng)基以及移栽關(guān)鍵技術(shù)進(jìn)行探討，以期建立離體快繁體系，為其今后的遺傳轉(zhuǎn)化以及報(bào)春苣苔屬的野生花卉資源的保護(hù)和利用研究提供理論基礎(chǔ)。

1??材料與方法

1.1材料

1.1.1 ?植物材料??貴港報(bào)春苣苔于2015年12月引種，并在廣西壯族自治區(qū)農(nóng)業(yè)科學(xué)院花卉研究所觀賞植物研發(fā)中心人工馴化6個(gè)月，生長健壯、無病蟲害（圖1A，圖1B）。實(shí)驗(yàn)于2016年8月—2017年7月開展。

1.1.2 ?培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件??基本培養(yǎng)基為MS、1/2 MS、1/4 MS和3/4 MS。MS培養(yǎng)基中的白砂糖為30?g/L，瓊脂為6?g/L，pH 5.4～5.8;1/2 MS培養(yǎng)基的大量元素和白砂糖含量為MS培養(yǎng)基中的1/2，其余成分的含量和MS培養(yǎng)基相同;1/4 MS培養(yǎng)基的大量元素和白砂糖含量為MS培養(yǎng)基中的1/4，其余成分的含量和MS培養(yǎng)基相同;3/4 MS培養(yǎng)基的大量元素和白砂糖含量為MS培養(yǎng)基中的3/4，其余成分的含量和MS培養(yǎng)基相同。

培養(yǎng)基中添加的植物生長調(diào)節(jié)劑有6-糠氨基嘌呤（激動(dòng)素，KT）、萘乙酸（NAA）、吲哚乙酸（IAA）、2，4-二氯苯氧乙酸（2，4-D）、6-芐氨基腺嘌呤（6-BA）和玉米素（ZT）。

培養(yǎng)條件：溫度（25±1）?℃，光照強(qiáng)度2000 lx，光照時(shí)間12～14 h/d。

1.2方法

1.2.1 ?外植體的處理與初代誘導(dǎo)??取貴港報(bào)春苣苔幼嫩葉片，在流水下沖洗10～15?min后，在超凈工作臺(tái)上先用棉球蘸取75%酒精拭擦葉片表面，無菌蒸餾水沖洗5次，然后將葉片在75%酒精中浸泡10 s，無菌蒸餾水沖洗5次，再用0.1%升汞（加數(shù)滴吐溫-20）浸泡8?min，無菌蒸餾水沖洗5次。將滅菌好的葉片按如下方法切割：橫切（垂直中脈在葉片中間切割，圖1C）、縱切（沿著葉片中脈切割，圖1D），同時(shí)切去葉片四周少許組織，保證四周均有傷口。然后將橫切葉片、縱切葉片接入初代培養(yǎng)基中，葉片正面朝上，葉背朝下。培養(yǎng)40 d，觀察葉片誘導(dǎo)情況并記錄，計(jì)算誘導(dǎo)率。不定芽以具有1對(duì)以上葉片的組培芽計(jì)（以下同）。

1.2.2 ?愈傷組織分化??（1）不同植物生長調(diào)節(jié)劑。在僅附加了KT、NAA這2種植物生長調(diào)節(jié)劑的培養(yǎng)基中進(jìn)行分化培養(yǎng)。

（2）不同種類、不同含量天然提取物對(duì)愈傷組織分化的影響。在（1）篩選出來的培養(yǎng)基上添加不同種類、不同含量的天然提取物，以此為培養(yǎng)基進(jìn)行分化培養(yǎng)。

（3）不同天然提取物組合對(duì)愈傷組織分化的影響。將（2）篩選出來的培養(yǎng)基進(jìn)行不同天然提取物的組合，以此為培養(yǎng)基進(jìn)行分化培養(yǎng)。

本節(jié)中的目標(biāo)培養(yǎng)物均為從葉片誘導(dǎo)出來的愈傷組織，切成1?cm×1?cm大小接入分化培養(yǎng)基中，培養(yǎng)30?d，培養(yǎng)期間每隔3 d觀察培養(yǎng)情況，30?d后統(tǒng)計(jì)新產(chǎn)生的不定芽數(shù)，計(jì)算分化系數(shù)。

1.2.3 ?增殖培養(yǎng)??方法參照1.2.2節(jié)，目標(biāo)培養(yǎng)物為具有1對(duì)以上葉片的不定芽，培養(yǎng)30?d，培養(yǎng)期間每隔3?d觀察培養(yǎng)情況，30?d后統(tǒng)計(jì)新產(chǎn)生的不定芽數(shù)，計(jì)算增殖系數(shù)。

1.2.4 ?生根培養(yǎng)??（1）基本培養(yǎng)基的篩選。選取生長健壯，具有2對(duì)以上葉片的植株，轉(zhuǎn)接于不同的基本培養(yǎng)基中。

（2）附加植物生長調(diào)節(jié)劑培養(yǎng)基的篩選。在（1）篩選出來的培養(yǎng)基上添加不同植物生長調(diào)節(jié)劑，以此為培養(yǎng)基進(jìn)行生根培養(yǎng)。培養(yǎng)40 d后，統(tǒng)計(jì)生根數(shù)、主根數(shù)量、生根時(shí)間，計(jì)算生根率。

1.2.5 ?移栽??選取具有2對(duì)以上葉片、根數(shù)較多、

根長適中的組培瓶苗置于溫室大棚中先帶蓋煉苗7?d，然后揭蓋煉苗3?d，取出洗凈基部培養(yǎng)基再進(jìn)行移栽?；|(zhì)采用泥炭混合珍珠巖，體積比為2∶1。移栽后置于遮陰通風(fēng)處，保持基質(zhì)濕潤。移栽組培苗100株，20 d后統(tǒng)計(jì)移栽成活率。

1.2.6 ?測(cè)定指標(biāo)的計(jì)算??不定芽誘導(dǎo)率=產(chǎn)生不定芽的葉片數(shù)/接種葉片數(shù)×100%;愈傷誘導(dǎo)率=產(chǎn)生愈傷組織的葉片數(shù)/接種葉片數(shù)×100%;分化系數(shù)=新不定芽數(shù)/接種愈傷數(shù);增殖系數(shù)=新不定芽數(shù)/接種不定芽數(shù);生根率=生根數(shù)/接種數(shù)×?100%。

1.3數(shù)據(jù)處理

各培養(yǎng)階段的實(shí)驗(yàn)處理材料數(shù)為100個(gè)，進(jìn)行3次重復(fù)，數(shù)據(jù)均為3次重復(fù)的平均值。采用Excel 2003、SPSS 19.0等軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)與處理，其中多重比較采用Duncans方法。

2??結(jié)果與分析

2.1初代誘導(dǎo)

由表1可知，切割方式相同的各處理之間，IAA處理組的不定芽誘導(dǎo)率顯著高于2，4-D處理組的不定芽誘導(dǎo)率（該值為0），但2，4-D處理組的愈傷誘導(dǎo)率顯著高于IAA處理組的愈傷誘導(dǎo)率（該值為0）。即不論切割方式如何，添加了IAA的培養(yǎng)基可誘導(dǎo)產(chǎn)生不定芽，但不能誘導(dǎo)產(chǎn)生愈傷組織，而添加了2，4-D的培養(yǎng)基則可誘導(dǎo)產(chǎn)生愈傷組織，不能誘導(dǎo)產(chǎn)生不定芽。當(dāng)培養(yǎng)基附加的植物生長調(diào)節(jié)劑相同時(shí)，縱切的不定芽誘導(dǎo)率以及愈傷誘導(dǎo)率均顯著高于橫切的。此外，處理2的縱切葉片在MS+6-BA?4.0 mg/L+IAA?1.5 mg/L培養(yǎng)基上培養(yǎng)時(shí)，獲得的不定芽數(shù)顯著高于其他處理，但其誘導(dǎo)時(shí)間和其他處理間無顯著差異。由此可知，雖然葉片縱切、橫切均可直接誘導(dǎo)出不定芽（圖1E）和愈傷組織（圖1F）。但在30 d的培養(yǎng)時(shí)間內(nèi)，從愈傷組織并未分化出不定芽。因此，葉片以縱切為宜，不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS+6-BA 4.0?mg/L+IAA 1.5?mg/L，愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS+6-BA 3.0～5.0 mg/L+2，4-D 0.5～1.5?mg/L，不定芽誘導(dǎo)率以及愈傷組織誘導(dǎo)率均為100.00%。

2.2愈傷組織分化

通過表2的方差分析可得，在培養(yǎng)基上附加KT和NAA，隨著濃度的變化，分化系數(shù)有所差異。當(dāng)KT濃度相同時(shí)，隨NAA濃度增加，分化系數(shù)先上升后下降;其中KT濃度為0.5和1.0?mg/L時(shí)，隨NAA濃度增加，分化系數(shù)的上升和下降都有顯著差異;KT濃度為1.5?mg/L時(shí)，隨NAA濃度增加，分化系數(shù)上升有顯著差異，但下降差異不顯著。當(dāng)NAA濃度相同時(shí)，隨KT濃度的增加，分化系數(shù)的變化不同;NAA濃度為0.1 mg/L時(shí)，分化系數(shù)有上升的趨勢(shì);NAA濃度為0.2、0.3?mg/L時(shí)，分化系數(shù)呈先上升后下降的趨勢(shì)，但前者變化顯著，后者的下降變化無顯著差異。由此表明，附加適宜濃度的植物生長調(diào)節(jié)劑對(duì)愈傷的分化以及生長有利，其中，在培養(yǎng)基MS+KT 1.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L上，分化系數(shù)最高，獲得的芽多，極少玻璃化，不定芽長勢(shì)健壯（圖1G），是適宜的分化培養(yǎng)基。

通過表3可以看出，與對(duì)照Y₅相比，添加了天然提取物的分化系數(shù)因種類、含量不同而不同。隨著提取物含量的增加，分化系數(shù)均呈先上升后下降的趨勢(shì)，但不同提取物的分化系數(shù)的變化略有差異。當(dāng)添加土豆或椰汁時(shí)，隨著含量增加，分化系數(shù)的變化存在顯著差異;在土豆含量為30?g/L、椰汁含量為100?mL/L時(shí)，分化系數(shù)分別為該附加物的最大值。當(dāng)添加香蕉時(shí)，隨著含量增加，分化系數(shù)的變化在下降后差異顯著，含量為30 g/L時(shí)的分化系數(shù)最高。當(dāng)添加蘋果時(shí)，隨著含量的增加，分化系數(shù)的上升存在顯著差異，下降后分化系數(shù)的變化無顯著差異，當(dāng)蘋果含量為20 g/L時(shí)，分化系數(shù)達(dá)到最大值。由此可知，培養(yǎng)基MS+KT 1.0 mg/L+NAA 0.2?mg/L上分別添加土豆30?g/L、香蕉30?g/L、蘋果20?g/L、椰汁100?mL/L，有利于愈傷的分化，獲得不定芽多，無玻璃化，不定芽長勢(shì)健壯。

通過對(duì)表4進(jìn)行方差分析可知，在植物生長調(diào)節(jié)劑KT為1.0?mg/L以及NAA為0.2?mg/L的條件下，培養(yǎng)基中添加了天然提取物的分化系數(shù)顯著高于未添加提取物的分化系數(shù)，并且添加了4種天然提取物的分化系數(shù)（12.64）顯著高于添加2或3種提取物的培養(yǎng)基的分化系數(shù)，培養(yǎng)基中添加了2種天然提取物的分化系數(shù)顯著低于添加了3種的。此外，添加了天然提取物的所有處理，其愈傷組織的分化情況均表現(xiàn)為不定芽多，無玻璃化，不定芽的長勢(shì)健壯。因此，適宜的愈傷分化培養(yǎng)基為MS+KT 1.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L+土豆30 g/L+香蕉30 g/L+蘋果20 g/L+椰汁100 mL/L，分化系數(shù)達(dá)12.64，植株長勢(shì)好，健壯（圖1H）。

2.3不定芽的增殖培養(yǎng)

由表5可知，當(dāng)ZT（或NAA）濃度相同時(shí)，隨著NAA（或ZT）濃度的增加，增殖系數(shù)呈現(xiàn)增加后降低的趨勢(shì)。其中，當(dāng)NAA濃度為0.5和1.0?mg/L時(shí)，增殖系數(shù)隨ZT濃度的增加先顯著增加后顯著降低，而濃度為0.15?mg/L時(shí)，增殖系數(shù)的變化不顯著;當(dāng)ZT濃度為0.5和1.5 mg/L時(shí)，增殖系數(shù)顯著增加，而降低則不顯著，濃度為1.0 mg/L時(shí)的增加以及降低的變化都有顯著差異。培養(yǎng)基J₅即MS+ZT 1.0?mg/L+NAA 0.10?mg/L的增殖系數(shù)最高，和其他培養(yǎng)基有顯著差異，在此培養(yǎng)基上的芽點(diǎn)多且極少玻璃化，不定芽長勢(shì)優(yōu)，是適宜的基本培養(yǎng)基（圖1I）。

由表6可知，與對(duì)照培養(yǎng)基MS+ZT 1.0 mg/L+ NAA 0.10?mg/L相比，附加不同種類和含量的天然提取物，其增殖系數(shù)有所增加也有所降低。添加土豆和香蕉，隨著含量的增加，增殖系數(shù)呈現(xiàn)先顯著增加后顯著下降的趨勢(shì)，30?g/L時(shí)的增殖系數(shù)最高，芽點(diǎn)多，無玻璃化，不定芽長勢(shì)優(yōu)。添加蘋果和椰汁，隨著含量增加，其增殖系數(shù)亦呈先上升后下降的趨勢(shì)，其中添加蘋果后的增殖系數(shù)升降均顯著，但在下降到一定數(shù)值后變化不再顯著，在20 g/L時(shí)的增殖系數(shù)最大;添加椰汁的增殖系數(shù)上升不顯著，在100?mL/L時(shí)達(dá)最大值，在150?mL/L以后的增殖系數(shù)變化不顯著。由此表明，在培養(yǎng)基MS+ZT 1.0?mg/L+NAA?0.10?mg/L上分別添加土豆30 g/L、香蕉30 g/L、蘋果20?g/L、椰汁100?mL/L時(shí)，增殖系數(shù)均為添加同種提取物時(shí)的最大值，是適宜的添加量，有利于增殖。

通過對(duì)表7的方差分析可知，附加了提取物的培養(yǎng)基的增殖系數(shù)顯著高于對(duì)照的增殖系數(shù)，并且隨著天然提取物種類數(shù)量的增加，增殖系數(shù)呈上升趨勢(shì)。添加2種的增殖系數(shù)顯著低于3種、4種的，添加3種的增殖系數(shù)顯著低于4種的，即培養(yǎng)基MS+ZT 1.0 mg/L+NAA 0.10 mg/L+土豆30?g/L+香蕉30?g/L+蘋果20?g/L+椰汁100?mL/L的增殖系數(shù)（8.55）顯著高于其他培養(yǎng)基。因此，培養(yǎng)基MS+ZT 1.0?mg/L+NAA 0.10?mg/L+土豆30?g/L+香蕉30 g/L+蘋果20 g/L+椰汁100 mL/L是不定芽增殖的適宜培養(yǎng)基，增殖系數(shù)為8.55，芽點(diǎn)多，無玻璃化，不定芽長勢(shì)優(yōu)（圖1J）。

2.4生根培養(yǎng)

由表8可知，MS培養(yǎng)基的生根率、平均根數(shù)顯著低于其他3種培養(yǎng)基，1/2 MS、1/4 MS、3/4 MS培養(yǎng)基的生根率無顯著差異，但平均根數(shù)差異達(dá)顯著水平，其中3/4 MS培養(yǎng)基平均根數(shù)顯著高于其他培養(yǎng)基，且其生根時(shí)間顯著少于其他培養(yǎng)基。因此，培養(yǎng)基3/4 MS適宜作生根培養(yǎng)的基本培養(yǎng)基，在此培養(yǎng)基上植株生長健壯，葉片濃綠，根系多，根無愈傷組織。

由表9分析可得，培養(yǎng)基的生根率均為100.00%，無顯著差異。但NAA和活性炭的含量不同，平均根數(shù)和生根時(shí)間也有所不同。當(dāng)NAA濃度相同時(shí)，隨活性炭含量的增加，平均根數(shù)先增加后降低。其中NAA濃度大于0.3?mg/L時(shí)，平均根數(shù)、生根時(shí)間無顯著差異;當(dāng)NAA為0.1 mg/L時(shí)，生根時(shí)間差異不顯著。由此可得，適宜生根的培養(yǎng)基為3/4 MS+NAA 0.01～0.05 mg/L+活性炭1.0～3.0 g/L，生根率為100.00%，根系發(fā)達(dá)，植株健壯（圖1K）。

2.5移栽

移栽后的組培苗放在溫度為15～30?℃，空氣濕度為90%以上，光照2000～4000 lx的環(huán)境中，并保持基質(zhì)濕潤。20?d后，成活率可達(dá)100.00%（圖1L）。

3??討論

多數(shù)報(bào)春苣苔屬植物沒有分枝，也沒有明顯的地上莖，而花朵、種子等器官又受季節(jié)條件的限制，故莖段、花朵、種子均不適宜作為外植體，而葉片取材容易，對(duì)母株的傷害極小，是理想的外植體類型?，F(xiàn)有的報(bào)春苣苔屬植物的組培快繁研究多以葉片為外植體，但對(duì)葉片的處理方式?jīng)]有進(jìn)行深入研究。本研究對(duì)葉片進(jìn)行橫切、縱切后，平鋪插入培養(yǎng)基中，結(jié)果得出不同的葉片切割方式對(duì)初代誘導(dǎo)的影響不同，縱切的不定芽誘導(dǎo)率以及愈傷誘導(dǎo)率均顯著高于橫切的，縱切獲得的不定芽數(shù)量較多。葉片切割方式不同，產(chǎn)生的不定芽數(shù)量不同，這一觀點(diǎn)在葉插繁殖中已獲證明。如疏花報(bào)春苣苔、百壽報(bào)春苣苔和王氏報(bào)春苣苔采用全葉插（不切割）、1/2或1/3下段方式扦插獲得的子株少，中上段扦插獲得的子株多^[13]。螞蟥七、牛耳朵和尖萼唇柱苣苔以橫切兩段式葉插，上半部分形成子株最多，而全葉插和兩段式葉插的下半部分形成子株較少^[14]，原因是全葉插和兩段式葉插的下半部分帶葉柄葉片，因只有葉柄能接觸基質(zhì)，因此形成子株數(shù)量較少，而兩段式葉插的上半部不僅能在切斷的主脈處形成子株，在次級(jí)較粗側(cè)脈亦能形成子株，因此形成子株數(shù)量多。但弄崗報(bào)春苣苔同樣采用了全葉插和兩段式葉插的扦插方式，卻發(fā)現(xiàn)葉片橫切兩段式的上部分獲得的子株較全葉插和兩段式葉插的下半部分子株少^[15]，具體原因還有待于進(jìn)一步研究。本研究規(guī)避了葉片接觸培養(yǎng)基不均的問題，以平鋪的方式接觸培養(yǎng)基。結(jié)果表明，縱切的不定芽誘導(dǎo)率以及愈傷誘導(dǎo)率均顯著高于橫切的，縱切獲得不定芽顯著高于橫切的。原因可能是，一方面葉脈部分薄壁細(xì)胞多，運(yùn)輸營養(yǎng)物質(zhì)的能力強(qiáng);另一方面不定芽多數(shù)是從傷口處發(fā)生，而縱切中帶傷口葉脈接觸的培養(yǎng)基面積大，橫切僅有部分帶傷口葉脈接觸培養(yǎng)基。因此，葉片縱切形成的不定芽多^[16]。

天然提取物一般從植物材料中提取，有效成分為氨基酸、酶、植物激素。本研究采用了4種天然提取物：土豆、香蕉、蘋果、椰汁。此類提取物常用于蘭花的組培研究中，如在基本培養(yǎng)基中添加適當(dāng)?shù)南憬赌?、椰乳可在一定程度上促進(jìn)蝴蝶蘭原球莖的增殖^[17]，添加10%馬鈴薯汁有利于鐵皮石斛原球莖的增殖和芽的分化^[18]，添加土豆汁對(duì)文心蘭的增殖具有促進(jìn)效果^[19]，添加香蕉汁更有利于原球莖的分化和組培苗生根^[20]。而在苦苣苔科植物的組培中并未見相關(guān)報(bào)道。本研究采用這4種天然提取物，研究了單一使用以及組合使用對(duì)不定芽增殖以及愈傷組織分化的影響，結(jié)果得出，單一添加土豆30?g/L、香蕉30?g/L、蘋果20 g/L、椰汁100 mL/L時(shí)，增殖系數(shù)、分化系數(shù)均為添加同種附加物時(shí)的最大值;組合添加時(shí)，添加4種的分化系數(shù)顯著高于添加2、3種的，添加2種附加物的分化系數(shù)顯著低于添加了3種附加物的分化系數(shù)，這和張超等^[21]的觀點(diǎn)是一致的：將2～3種有機(jī)附加物進(jìn)行組合添加，效果常優(yōu)于單獨(dú)添加，原因可能是不同有機(jī)附加物組合的營養(yǎng)成分更為豐富。

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