楊署光 陳月異 李言 張世鑫 張曉飛 曾霞

摘? 要? 膠乳被認(rèn)為是橡膠樹(shù)的一種與傷害應(yīng)答相關(guān)聯(lián)的保護(hù)物質(zhì)。割膠可以顯著促進(jìn)橡膠生物合成，且此促進(jìn)作用與激活乳管細(xì)胞中橡膠生物合成相關(guān)基因的表達(dá)相關(guān)，但相關(guān)性大小尚不清楚。本文通過(guò)qPCR分析了正常割膠條件下，6個(gè)橡膠生物合成相關(guān)基因HbHRT2、HbSRPP、HbREF、HbHMGR1、HbHRT1、HbGAPDH在5個(gè)橡膠樹(shù)魏克漢種質(zhì)和5個(gè)1981IRRDB種質(zhì)膠乳中的表達(dá)情況。結(jié)果顯示：這6個(gè)基因在魏克漢種質(zhì)中的表達(dá)水平顯著高于1981IRRDB種質(zhì)，分別是后者的1.05～14.62、0.97～4.26、1.46～12.56、0.83～2.99、0.43～7.54、1.92～11.31倍，平均值是后者的7.54、2.55、5.69、1.71、2.71、4.91倍。相關(guān)性分析表明，這些基因的表達(dá)與橡膠樹(shù)干膠產(chǎn)量呈正相關(guān)，其中，HbREF和HbGAPDH的表達(dá)水平與干膠產(chǎn)量之間的相關(guān)性最高，有望作為橡膠樹(shù)產(chǎn)量育種的分子指標(biāo)。

關(guān)鍵詞? 巴西橡膠樹(shù);割膠;橡膠生物合成;基因表達(dá)

中圖分類(lèi)號(hào)? S31? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼? A

在亞馬遜森林，橡膠樹(shù)與其他10多種橡膠屬植物共存，而所有橡膠樹(shù)種均為雌雄同株，并有優(yōu)先異交的習(xí)性[1-2]，因此，橡膠樹(shù)是一個(gè)高度雜合的物種復(fù)合體[3]，其種群/種屬間存在高頻的基因流動(dòng)[4-9]。1876年，魏克漢（Wickham）從巴西收集了7萬(wàn)多粒橡膠樹(shù)種子，獲得了少量的種子苗。20世紀(jì)初，有20多株種子苗被成功引種到東南亞，成為該地區(qū)幾乎所有橡膠樹(shù)種植園的先祖。1920s以前，橡膠樹(shù)主要通過(guò)種子和芽接的方式繁殖。1920s以后，人們開(kāi)始了雜交育種工作[10-11]。經(jīng)驗(yàn)表明，從雜交授粉開(kāi)始到完成系列選育種過(guò)程耗時(shí)30多年[12]。由于引種馴化時(shí)間短，目前栽培的幾乎所有無(wú)性系品種以及仍在選擇中的基因型與亞馬遜森林野生祖先相隔不到10代，這對(duì)于一個(gè)大面積種植的樹(shù)種來(lái)說(shuō)世代數(shù)太少[4]。人工雜交育種到目前也才進(jìn)入到第四代?？梢?jiàn)，橡膠樹(shù)大規(guī)模種植和遺傳改良的歷史并不長(zhǎng)。雖然絕大部分無(wú)性系起源于19世紀(jì)引種到亞洲的所謂‘魏克漢樹(shù)，但由于大多數(shù)的栽培品種仍包含足夠的等位基因多樣性，這使得遺傳改良成為可能[4， 13]。研究表明，橡膠樹(shù)種群間的基因結(jié)構(gòu)還沒(méi)有明顯的分離，不同來(lái)源種質(zhì)間共享80%左右的等位基因[4]。以魏克漢種質(zhì)為親本雜交獲得的F1代的產(chǎn)量變異系數(shù)高達(dá)50.7%～ 100.1%[14-16]。

天然橡膠是巴西橡膠樹(shù)的重要次生代謝產(chǎn)物，來(lái)源于類(lèi)異戊二烯代謝途徑，涉及一系列橡膠生物合成關(guān)鍵酶[17]，如橡膠延伸因子（rubber elongation factor， REF）[18]、小橡膠粒子膜蛋白（small rubber particle protein， SRPP）[19]、3-羥基-3-甲基戊二酸單酰輔酶A還原酶（3-hydro xy-3-methylglutaryl coenzyme A reductase， HM G R）[20]、橡膠轉(zhuǎn)移酶（Hevea brasiliensis rubber transferase， HRT）[21]等。橡膠樹(shù)的產(chǎn)量性狀是一種典型的次生產(chǎn)量性狀，由反復(fù)合理的收獲脅迫（割膠）形成[22]。割膠后流出的膠乳是乳管細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)，是橡膠樹(shù)應(yīng)答傷害的相關(guān)保護(hù)物質(zhì)。研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞質(zhì)中的3-磷酸甘油醛脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase， G A PDH;主要是參與糖酵解反應(yīng)）基因可以響應(yīng)多種脅迫反應(yīng)，在植物抗逆過(guò)程中發(fā)揮重要調(diào)控作用[23]。割膠后，與膠乳再生和防衛(wèi)相關(guān)的基因表達(dá)增強(qiáng)，同時(shí)伴隨著蛋白合成效率的提高，從而使膠乳的代謝活性增加。機(jī)械傷害和割膠可以顯著促進(jìn)乳管的分化[24]，顯著提高REF[17， 25]、SRPP[19， 25]、FPS[26]等和乳膠生物合成相關(guān)基因的表達(dá)[27]。但是，橡膠生物合成相關(guān)基因的表達(dá)與橡膠產(chǎn)量的相關(guān)性尚不清楚。本研究通過(guò)分析橡膠生物合成相關(guān)基因的表達(dá)與橡膠產(chǎn)量的相關(guān)性，旨在找到與產(chǎn)量相關(guān)的分子標(biāo)記，這對(duì)于育種周期長(zhǎng)的橡膠樹(shù)產(chǎn)量育種而言具有重要的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值?？蔀檠芯肯鹉z樹(shù)產(chǎn)量形成的調(diào)控機(jī)理、開(kāi)發(fā)新型的產(chǎn)量刺激劑提供理論基礎(chǔ)，為研發(fā)橡膠樹(shù)產(chǎn)量早期預(yù)測(cè)技術(shù)、通過(guò)轉(zhuǎn)基因育種等途徑提高橡膠樹(shù)產(chǎn)量提供備選基因。

1? 材料與方法

1.1? 材料

實(shí)驗(yàn)材料是割齡為10 a的巴西橡膠樹(shù)（Hevea brasiliensis）的5份魏克漢種質(zhì)和5份1981IRRDB種質(zhì)。其中5份魏克漢種質(zhì)是經(jīng)過(guò)人工選育的橡膠樹(shù)品種PR107、RRIM600、熱墾628、熱墾525和熱墾523;5份1981IRRDB種質(zhì)未經(jīng)人工選育，編號(hào)為RO/CM/10 44/160、MT/IT/13 29/8、RO/C/8 24/104、RO/I/103 107、RO/CM/10 44/454。這些實(shí)驗(yàn)樹(shù)種植于中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院試驗(yàn)場(chǎng)。

DNaseⅠ購(gòu)自天根公司。反轉(zhuǎn)錄試劑盒RevertAidTM H Minus First Strand cDNA Synthesis Kit購(gòu)自Ferments公司。qPCR試劑SYBR? Ppermix Ex TaqTM Ⅱ（2×）（Tli RNaseH Plus）購(gòu)自大連寶生物公司（TaKaRa Japan）。其他生化試劑均為進(jìn)口或國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭Ｒ锖铣捎蒊nvitrogen公司完成。

1.2? 方法

1.2.1? 材料處理? 每個(gè)種質(zhì)隨機(jī)挑選3株，在生產(chǎn)中正常割膠（S/2D d3：二分之一樹(shù)圍，陽(yáng)刀，三天一刀）的第十刀，收集前10 min流出的膠乳，每個(gè)種質(zhì)均取3株的等體積混合樣，用于提取膠乳總RNA。

1.2.2? 總RNA的提取與cDNA的合成? 膠乳總RNA提取參照曾日中等[28]的方法。cDNA第一鏈的合成根據(jù)試劑盒的操作步驟進(jìn)行：取1 μg膠乳總RNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈，稀釋10倍后作為qPCR分析的模板。

1.2.3? 基因表達(dá)分析? （1）qPCR反應(yīng)。qPCR反應(yīng)體系為20 μL，其中SYBR? Ppermix Ex TaqTM Ⅱ（2×）10 μL、上游引物0.4 μL、下游引物0.4 μL（引物濃度為10 μmol/L，反應(yīng)體系中每條引物終濃度均為0.2 μmol/L）、cDNA模板1 μL、ddH2O 8.2 μL。qPCR反應(yīng)在LightCycler? Capillaries（20 ?l，Roche）毛細(xì)管中完成，在Roche Diagnostics公司的Light Cycler Real Time PCR擴(kuò)增儀中運(yùn)行，實(shí)驗(yàn)操作按儀器使用說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，qPCR反應(yīng)程序：95 ℃ 30 s;95 ℃ 5 s，60 ℃ 20 s，72 ℃ 20 s，共40個(gè)循環(huán)，然后進(jìn)行溶解曲線分析（60～95 ℃，0.2 ℃/S），運(yùn)行結(jié)束后冷卻至40 ℃。每個(gè)樣品做2次技術(shù)性重復(fù)，Cq標(biāo)準(zhǔn)差控制在0.2以?xún)?nèi)。利用LightCycler Software 4.05軟件采集qPCR反應(yīng)的Cq值。（2）qPCR引物篩選。根據(jù)

GenBank登錄的基因的cDNA全長(zhǎng)序列設(shè)計(jì)qPCR引物。以10倍梯度稀釋的cDNA為摸板制備標(biāo)準(zhǔn)曲線，獲得目的基因qPCR引物的擴(kuò)增效率，選擇擴(kuò)增效率在85%以上的引物對(duì)開(kāi)展實(shí)驗(yàn);通過(guò)溶解曲線峰的數(shù)目判斷引物的特異性，選擇具有單一的溶解曲線峰的引物對(duì)開(kāi)展實(shí)驗(yàn);獲得的qPCR產(chǎn)物通過(guò)測(cè)序印證。該研究所用引物見(jiàn)表1。（3）基因表達(dá)分析。根據(jù)“Q=2△Cq= 2min Cq-Sample Cq”計(jì)算基因的表達(dá)值（Q），以Hb18S作為內(nèi)參基因，根據(jù)“E=Q目的基因/Q內(nèi)參基因”分析目的基因的相對(duì)表達(dá)值（E）。樣本間相對(duì)基因表達(dá)倍數(shù)[29]可直觀的反映出彼此間表達(dá)差異的大小，根據(jù)“F=EA/EB”分析樣本A對(duì)樣本B的基因相對(duì)表達(dá)倍數(shù)（folds，F(xiàn)）。根據(jù)“變異系數(shù)（C·V）=標(biāo)準(zhǔn)差（s）/平均數(shù)（）×100%”分析基因表達(dá)倍數(shù)的變異系數(shù)。

1.3? 數(shù)據(jù)處理

用Excel 2003軟件作圖，用SPSS軟件的Duncan檢驗(yàn)進(jìn)行多重比較分析。用Excel TTEST（Array 1，Array 2，Tails 1，Type 1）進(jìn)行成對(duì)比較分析。用SPSS軟件分析基因表達(dá)和參照曾霞等[30]的方法獲得的干膠產(chǎn)量的Pearson相關(guān)性。

2? 結(jié)果與分析

2.1? qPCR引物篩選

以10倍梯度稀釋的cDNA為摸板制備標(biāo)準(zhǔn)曲線，獲得目的基因qPCR引物的擴(kuò)增效率在89%～98%之間（圖1A）;溶解曲線分析表明，各個(gè)基因的引物均獲得單一的溶解曲線峰、無(wú)模板對(duì)照（NTC）無(wú)擴(kuò)增產(chǎn)物，表明qPCR沒(méi)有任何非特異性的擴(kuò)增（圖1B）。

2.2? 橡膠樹(shù)種質(zhì)間橡膠生物合成相關(guān)基因的表達(dá)分析

qPCR分析表明，HbHRT2（圖2A）和HbSRPP（2B）僅在1個(gè)（20%）1981IRRDB種質(zhì)中達(dá)到魏克漢種質(zhì)的表達(dá)水平;HbHMGR1（圖2D）僅在1（20%）個(gè)魏克漢種質(zhì)中低至1981IRRDB種質(zhì)的表達(dá)水平;HbHRT1（圖2E）僅有2個(gè)（40%）魏克漢種質(zhì)顯著高于1981IRRDB種質(zhì)的表達(dá)水平，3個(gè)（60%）魏克漢種質(zhì)和1981IRRDB種質(zhì)中表達(dá)水平相當(dāng);值得注意的是，HbREF（圖2C）和HbGAPDH（圖2F）在所有魏克漢種質(zhì)中的表達(dá)量均極顯著高于1981IRRDB種質(zhì)。統(tǒng)計(jì)分析表明，這6個(gè)基因在魏克漢種質(zhì)組的表達(dá)水平均顯著高于1981IRRDB種質(zhì)組，其中HbHRT2、HbSRPP、HbREF和HbGAPDH差異極顯著（圖2H）;80%的魏克漢種質(zhì)中，6個(gè)基因表達(dá)的平均值均顯著高于1981IRRDB種質(zhì)（圖2G）。

魏克漢種質(zhì)分別對(duì)1981IRRDB種質(zhì)的基因表達(dá)倍數(shù)的結(jié)果表明（表2），優(yōu)勢(shì)表達(dá)基因是HbHRT2、HbREF和HbGAPDH，平均表達(dá)倍數(shù)分別為7.54、5.69和4.91倍，最大倍數(shù)均超過(guò)10倍。但是，同一基因在不同種質(zhì)間的表達(dá)倍數(shù)有明顯差異，變異系數(shù)分別為58.26%（HbHRT2）、74.00%（HbHRT1）、40.40%（HbSRPP）、69.43%（HbREF）、36.09%（HbHMGR1）、62.33%（HbGAPDH）。值得注意的是，HbGAPDH在5個(gè)魏克漢種質(zhì)對(duì)1981IRRDB種質(zhì)的表達(dá)倍數(shù)均

A.通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出qPCR的擴(kuò)增效率為89%～98%;縱坐標(biāo)：Cp值，橫坐標(biāo)：模板濃度的對(duì)數(shù)。B.通過(guò)溶解曲線分析qPCR擴(kuò)增的特異性，均獲得單一的溶解曲線峰，并且無(wú)模板對(duì)照（NTC）無(wú)擴(kuò)增，說(shuō)明qPCR沒(méi)有任何非特異性的擴(kuò)增;在18S的擴(kuò)增中，雖然NTC有很少的一點(diǎn)擴(kuò)增（Cp =31.1±2.2），但Cp值遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于樣品的Cp值（9.5±0.3），因此對(duì)定量無(wú)影響;縱坐標(biāo)：熒光（530 nm）強(qiáng)度，橫坐標(biāo)：溫度（65～95 ℃）。

2.3? 橡膠樹(shù)種質(zhì)間橡膠生物合成相關(guān)基因與干膠產(chǎn)量的相關(guān)性分析

Pearson相關(guān)性分析結(jié)果表明，HbSRPP、

HbREF和HbGAPDH基因表達(dá)與干膠產(chǎn)量均呈顯著相關(guān)（p<0.05）;值得注意的是，HbREF和HbGAPDH基因表達(dá)與干膠產(chǎn)量呈極顯著相關(guān)（p<0.01）（表3）。

橫坐標(biāo)（A～G）：從左到右（1～10）依次代表魏克漢種質(zhì)PR107、RRIM600、熱墾628、熱墾525、熱墾523以及1981IRRDB種質(zhì)RO/CM/10 44/160、MT/IT/13 29/8、RO/C/8 24/104、RO/I/103 107、RO/CM/10 44/454;G. 每個(gè)種質(zhì)的基因相對(duì)表達(dá)量為HbHRT2， HbSRPP， HbREF， HbHMGR1， HbHRT1和 HbGAPDH這6個(gè)基因表達(dá)值的平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差;H. 每個(gè)基因的相對(duì)表達(dá)量為5個(gè)魏克漢種質(zhì)或5個(gè)1981IRRDB種質(zhì)中的平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差;不同大寫(xiě)字母或**表示組間差異極顯著（p<0.01），不同小寫(xiě)字母或

3? 討論

割膠促進(jìn)橡膠樹(shù)合成天然橡膠，2次割膠之間的橡膠再生涉及到橡膠合成酶基因的誘導(dǎo)表達(dá)調(diào)控[27]。割膠可以顯著提高REF[18， 25]、SRPP[19， 25]等橡膠合成酶基因的表達(dá)。因此，應(yīng)可通過(guò)研究橡膠合成酶基因在不同干膠產(chǎn)量種質(zhì)中的表達(dá)差異來(lái)篩選產(chǎn)量相關(guān)的分子標(biāo)記。

一般認(rèn)為變異幅度大于2倍的基因?yàn)椴町惐磉_(dá)基因[29]。魏克漢種質(zhì)組膠乳中HbHRT2、HbSRPP、HbREF、HbHRT1和HbGAPDH基因的表達(dá)水平平均是1981IRRDB種質(zhì)組的2倍以上，表明這5個(gè)基因是兩組種質(zhì)的差異表達(dá)基因;其中HbHRT2、HbREF和HbGAPDH的表達(dá)差異最大。HbREF和HbGAPDH基因表達(dá)與橡膠樹(shù)種質(zhì)干膠產(chǎn)量的Pearson相關(guān)性高，有望作為橡膠樹(shù)產(chǎn)量育種的侯選分子標(biāo)記。

一個(gè)假設(shè)在訓(xùn)練數(shù)據(jù)上能夠獲得比其他假設(shè)更好的擬合，但是在訓(xùn)練數(shù)據(jù)外的數(shù)據(jù)集上卻不能很好地?cái)M合數(shù)據(jù)，此時(shí)認(rèn)為這個(gè)假設(shè)出現(xiàn)了過(guò)擬合的現(xiàn)象。出現(xiàn)這種現(xiàn)象的主要原因是訓(xùn)練數(shù)據(jù)中存在噪音或者訓(xùn)練數(shù)據(jù)太少[31]。需要注意的是，該研究的樣本數(shù)量有限，存在過(guò)度擬合的可能性，因此，該研究結(jié)果需要擴(kuò)大群體進(jìn)一步印證。

盡管個(gè)別基因在個(gè)別1981IRRDB種質(zhì)中已達(dá)到魏克漢種質(zhì)的表達(dá)水平，但4個(gè)（80%）魏克漢種質(zhì)中這6個(gè)基因的整體平均表達(dá)水平極顯著高于1981IRRDB種質(zhì)，1個(gè)（20%）魏克漢種質(zhì)中這6個(gè)基因的整體平均表達(dá)水平顯著高于4個(gè)（80%）1981IRRDB種質(zhì)，表明它們?cè)谡{(diào)控橡膠生物合成過(guò)程中具有協(xié)同作用。

該研究的5個(gè)魏克漢種質(zhì)中，RRIM600的親本組合為T(mén)jirl×PB86[14-15]，熱墾628的親本組合為IAN873×PB235[14]，熱墾525的親本組合為INA873×RRIM803[15]，熱墾523的親本組合為IAN873×PB260[14];PR107為初生代無(wú)性系[16， 32]，RRIM600為次生代無(wú)性系[13， 33]，熱墾628、熱墾525、熱墾523為四生代無(wú)性系。5個(gè)1981IRRDB種質(zhì)RO/CM/10 44/160、MT/IT/13 29/8、RO/C/8 24/104、RO/I/103 107、RO/CM/10 44/454分別來(lái)自巴西的不同地區(qū)，種植名稱(chēng)中的字母表示來(lái)源地的代號(hào)。10份種質(zhì)間具有一定的多樣性，并且他們的產(chǎn)量都是經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期測(cè)定的結(jié)果，因此該研究的結(jié)果具有一定的可靠性。

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