王蔚 魏日鳳 郭雅玲

摘? 要? 本研究利用單因素試驗(yàn)結(jié)合L9（34）正交試驗(yàn)，以10個(gè)傳感器特征值為考察指標(biāo)，確定了茶樣量、平衡溫度、平衡時(shí)間3種因素的最佳萃取條件。結(jié)果表明，不同萃取條件對(duì)不同傳感器響應(yīng)值的影響程度不同，平衡溫度對(duì)絕大多數(shù)傳感器特征值的影響最大，而平衡時(shí)間的影響最小。試驗(yàn)得出的電子鼻檢測(cè)烏龍茶揮發(fā)物的最優(yōu)條件為：平衡溫度100 ℃，平衡時(shí)間45 min，茶樣量為3 g。在此萃取條件下試驗(yàn)重復(fù)性好，傳感器響應(yīng)曲線較為密集平穩(wěn)且響應(yīng)值最高，可將13個(gè)不同品種的烏龍茶明顯區(qū)分開。該試驗(yàn)為烏龍茶香氣的快速客觀判別提供了有效的電子鼻檢測(cè)方法。

關(guān)鍵詞? 烏龍茶;電子鼻;正交試驗(yàn);最優(yōu)萃取條件;揮發(fā)性成分

中圖分類號(hào)? S571.1? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼? A

烏龍茶屬半發(fā)酵茶，因其具有豐富多樣而又獨(dú)特的花果香，深受消費(fèi)者喜愛。茶葉的香氣作為茶葉品質(zhì)鑒定的重要因子之一，密切影響茶葉品質(zhì)等級(jí)的劃分，其品質(zhì)評(píng)價(jià)和組成成分的分析一直是茶葉科研領(lǐng)域的一項(xiàng)重要課題。為了客觀系統(tǒng)地檢測(cè)烏龍茶的揮發(fā)物以進(jìn)行產(chǎn)地判別、真?zhèn)闻袆e、香型歸類，運(yùn)用儀器輔助檢測(cè)烏龍茶揮發(fā)物意義重大。

茶葉香氣分析方法有感官審評(píng)法、電子鼻分析法、GC-O分析法及GC-MS（氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀）分析法等。其中電子鼻是一種與生物嗅覺原理相似的儀器，氣味分子被傳感器吸附，產(chǎn)生的信號(hào)經(jīng)處理加工與傳輸，再經(jīng)模式識(shí)別做出判斷，最終實(shí)現(xiàn)快速識(shí)別簡(jiǎn)單或復(fù)雜氣體[1]。電子鼻既能識(shí)別單一揮發(fā)性有機(jī)化合物，又能對(duì)復(fù)雜的氣味給出整體綜合判別，不僅具備傳統(tǒng)常規(guī)儀器[2]分析的客觀性、不易疲勞、重現(xiàn)性好等優(yōu)點(diǎn)，而且易獲得被測(cè)樣品的氣味整體信息，具有操作簡(jiǎn)單、鑒別速度快、成本低、無損檢測(cè)等優(yōu)點(diǎn)。目前電子鼻已廣泛應(yīng)用于不同貯藏時(shí)間[3]、不同等級(jí)[4-5]、不同產(chǎn)地[6]、不同加工工藝[7]、不同沖泡條件[8]等茶樣的研究。也有不少人對(duì)樣品的處理方式以及電子鼻檢測(cè)參數(shù)等進(jìn)行了優(yōu)化。2013年，敖存等[9]實(shí)驗(yàn)中通過比較不同茶樣量、茶水比、水浴溫度和時(shí)間條件下茶葉的香氣特點(diǎn)，確定了茶粉法、噴霧法和葉底法的方法參數(shù)。結(jié)果表明，茶粉法條件下，電子鼻不同傳感器的響應(yīng)值較高，重復(fù)性較好，并能夠良好地反映感官評(píng)審結(jié)果，較好地區(qū)分不同等級(jí)龍井茶香氣質(zhì)量差異，明顯好于其他3種方法。2017年，高林等[10]研究發(fā)現(xiàn)，茶粉法相比茶湯法，響應(yīng)值略低，但是茶粉法具有較好的重復(fù)性和區(qū)分性，操作簡(jiǎn)單，也不會(huì)對(duì)儀器造成損害，適用于普洱茶電子鼻的分析。2018年，何魯南等[6]分別用干茶法、茶湯法、葉底法對(duì)茶樣香氣進(jìn)行采集。結(jié)果表明，相較于其他方法，葉底法對(duì)不同貯藏地的普洱茶的區(qū)分效果更佳。但是前人研究中使用的樣品處理方法多為葉底、茶湯、完整的干茶樣或者茶粉加水，用茶粉直接進(jìn)行電子鼻檢測(cè)的較少。

本研究以肉桂為材料，通過單因素和正交試驗(yàn)，對(duì)影響電子鼻靈敏度的主要因素的參數(shù)進(jìn)行了優(yōu)化，確定了較佳的平衡溫度、平衡時(shí)間和茶樣量3個(gè)樣品前處理方法參數(shù)，建立了烏龍茶香氣物質(zhì)的可靠分析方法，并對(duì)該方法進(jìn)行了穩(wěn)定性考察以及烏龍茶樣品的檢測(cè)，以期為烏龍茶天然香氣成分的開發(fā)和利用、判別產(chǎn)地、鑒定真?zhèn)翁峁┛茖W(xué)依據(jù)。

1? 材料與方法

1.1? 材料

選取2017年正巖肉桂（烏龍茶，福建省武夷山市宏業(yè)茶業(yè)有限公司），磨碎，過40目篩，裝于鋁箔袋，密封備用。

iNose型電子鼻，上海昂申智能科技有限公司，由10個(gè)金屬傳感器按一定陣列組合而成，傳感器及其響應(yīng)的揮發(fā)性成分見表1;靈敏度為萬分之一的電子分析天平，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司;WK-400B高速藥物粉碎機(jī)，山東青州市精誠(chéng)機(jī)械有限公司;KQ-600KDE型高功率數(shù)控超聲波清洗機(jī)，昆山市超聲儀器有限公司;電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司;40目標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)篩，上虞市銀河測(cè)試儀器廠;60 mL頂空瓶，廈門儀譜儀器有限公司。

1.2? 方法

1.2.1? 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)? 選取平衡溫度、平衡時(shí)間、茶樣量這3個(gè)因素同時(shí)作為考察因素，首先采用單因素試驗(yàn)確定其較優(yōu)水平變化范圍后，再采用正交試驗(yàn)優(yōu)化并確定烏龍茶揮發(fā)物的最佳電子鼻檢測(cè)分析條件。

（1）單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)。每個(gè)處理重復(fù)5次，比較不同處理下各傳感器的特征值（包括最大值與穩(wěn)定值）大小，同時(shí)考察傳感器特征值絕對(duì)值的RSD值大小。

平衡溫度設(shè)定為20、40、60、80、100、120 ℃。

根據(jù)呂海鵬等[11]的研究結(jié)果及預(yù)試驗(yàn)結(jié)果，將平衡時(shí)間設(shè)定為15、30、45、60、75 min。

根據(jù)電子鼻頂空瓶大小，將茶樣量設(shè)定為0.5、1、2、3、4 g。

（2）正交試驗(yàn)影響因素及水平的選擇。根據(jù)單因素試驗(yàn)篩選出較優(yōu)的平衡溫度、平衡時(shí)間以及茶樣量條件范圍，分別選擇3個(gè)水平，其中平衡溫度為60、80、100 ℃，平衡時(shí)間為15、30、45 min，茶樣量為1、2、3 g。以電子鼻10個(gè)傳感器的特征值及其響應(yīng)曲線的線形為考察指標(biāo)，選用L9（34）正交試驗(yàn)表（表2）得出最優(yōu)條件。

1.2.2? 電子鼻測(cè)定方法? （1）電子鼻條件。電子鼻載氣為凈化空氣（相對(duì)濕度在60% ± 1%），氣體流量為0.8 L/min，采樣時(shí)間為300 s，等待時(shí)間為10 s，樣品清洗時(shí)間為360 s。

（2）電子鼻測(cè)定方法。準(zhǔn)確稱取一定質(zhì)量的烏龍茶茶粉（精確至0.0001 g）置于60 mL頂空瓶?jī)?nèi)備用，設(shè)置好樣品的平衡溫度與平衡時(shí)間。單因素試驗(yàn)中每個(gè)樣品重復(fù)測(cè)定5次，正交試驗(yàn)每個(gè)樣品重復(fù)測(cè)定3次，穩(wěn)定性試驗(yàn)樣品重復(fù)測(cè)定5次。命名時(shí)重復(fù)1為編碼-1、重復(fù)2為編碼-2，其他依此類推。

步驟：開機(jī)后儀器預(yù)熱（30 min）→清洗傳感器3次（每次120 s）至各傳感器響應(yīng)值趨向于 1.0000 →檢測(cè)樣品（自帶清洗傳感器 120 s，等待時(shí)間 10 s，信號(hào)采集）→記錄對(duì)應(yīng)的特征響應(yīng)值→保存數(shù)據(jù)。

（3）穩(wěn)定性考察。取烏龍茶茶樣3 g，重復(fù)5次，按最終的優(yōu)化參數(shù)進(jìn)樣和檢測(cè)。得到結(jié)果后，分別考察電子鼻10個(gè)傳感器特征值的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）。

1.3? 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)采用Excel軟件進(jìn)行極差分析并作圖，采用SPSS 21軟件鄧肯法進(jìn)行方差分析。

2? 結(jié)果與分析

2.1? 單因素試驗(yàn)結(jié)果

對(duì)從電子鼻系統(tǒng)中導(dǎo)出的特征值進(jìn)行方差分析，結(jié)果表明茶樣量、平衡溫度對(duì)10個(gè)傳感器均有極顯著影響，平衡時(shí)間只對(duì)s1、s2、s4有極顯著影響，對(duì)其他傳感器均無顯著性影響。

2.1.1? 平衡溫度對(duì)電子鼻各傳感器響應(yīng)值的影響? 隨著平衡溫度的升高，烏龍茶電子鼻10個(gè)傳感器響應(yīng)值的最大值與穩(wěn)定值逐漸增大（圖1）。平衡溫度為20 、40 ℃時(shí)，10個(gè)傳感器的響應(yīng)值無顯著性差異，平衡溫度為40 、60 ℃時(shí)，除了s1、s8，其他8個(gè)傳感器的響應(yīng)值也均無顯著性差異。除了s3同類子集中的組均值大小排序?yàn)?20 ℃> 100 ℃>80 ℃>60 ℃>20 ℃>40 ℃，其他9個(gè)傳感器特征值同類子集中的組均值從大到小排序均為120 ℃>100 ℃>80 ℃>60 ℃>40 ℃>20 ℃。當(dāng)平衡溫度為20 ℃和40 ℃時(shí)，電子鼻響應(yīng)值最大值較低（最高值僅至3.5），且線條雜亂不平穩(wěn);當(dāng)平衡溫度為120 ℃時(shí)，電子鼻響應(yīng)值最大值較高，可達(dá)22左右，但同一個(gè)處理重復(fù)性差，檢測(cè)結(jié)束時(shí)，s1、s2、s6、s10等傳感器響應(yīng)值仍有較大下降趨勢(shì)，不穩(wěn)定，表明電子鼻中仍有一部分氣體物質(zhì)沒有檢測(cè)完。而當(dāng)平穩(wěn)溫度為60、80、100 ℃時(shí)，電子鼻響應(yīng)值線性流暢平穩(wěn)，響應(yīng)值最大值與穩(wěn)定值較高，穩(wěn)定值的RSD值除80 ℃中s1與s9小于6.5%，其余均小于5%，表明這3個(gè)溫度梯度均具有較好的重復(fù)性，故選擇60、80、100 ℃繼續(xù)進(jìn)行正交試驗(yàn)。

圖 1? 不同平衡溫度下10個(gè)傳感器穩(wěn)定值的大小

Fig. 1? Steady-state values of 10 sensors at different equilibrium temperatures

2.1.2? 平衡時(shí)間對(duì)電子鼻各傳感器響應(yīng)值的影響? 平衡時(shí)間只對(duì)s1、s2、s4的響應(yīng)值有極顯著影響，對(duì)其他傳感器均無顯著性影響（圖2）。s2、s4平衡時(shí)間為15 min時(shí)，同類子集中的組均值最大，其次是30和45 min，雖然s1平衡時(shí)間為75和60 min時(shí)該傳感器響應(yīng)值比較高，但30、45與60 min的響應(yīng)值無顯著性差異，綜合考慮后選擇15、30、45 min進(jìn)行正交試驗(yàn)。

2.1.3? 茶樣量對(duì)電子鼻各傳感器響應(yīng)值的影響? 從圖3可知，隨著茶樣量的增多，傳感器特征值平均值整體上呈上升趨勢(shì)，3 g接近平臺(tái)期。s1、s3、s8、s9同類子集中的組均值大小排序?yàn)? g >

4 g > 2 g > 1 g > 0.5 g，對(duì)于其他傳感器而言，同類子集中的組均值大小排序均為4 g > 3 g > 2 g >

1 g > 0.5 g，除了s3、s5、s6、s7、s8、s10中3 g與4 g有顯著性差異外，其他傳感器3 g與4 g的響應(yīng)值均無顯著性差異。大多數(shù)傳感器中1 g的響應(yīng)值均顯著大于0.5 g的響應(yīng)值（除了s8、s9），同時(shí)1、2、3 g彼此之間有顯著性差異（除了s3和s8）。綜合考慮，選擇1、2、3 g進(jìn)行正交試驗(yàn)。

2.2.1? 正交試驗(yàn)極差分析? 電子鼻優(yōu)化出的最優(yōu)傳感器為s3、s4、s5、s7、s10。由表4中的極差（R值）分析結(jié)果可以看出，10個(gè)傳感器由極差分析得出的較優(yōu)組合均為A3B1C3，即100 ℃、45 min、3 g。3個(gè)因素對(duì)s2、s4、s6響應(yīng)值影響大小的排序?yàn)椴铇恿?平衡溫度>平衡時(shí)間（C>A>B）。對(duì)其他傳感器而言，平衡溫度對(duì)其響應(yīng)值影響最大，其中s1、s5、s7、s9、s10的因素影響力大小排序?yàn)椋胶鉁囟?茶樣量>平衡時(shí)間（A>C>B），s3、s8的因素影響力大小排序?yàn)槠胶鉁囟?平衡時(shí)間>茶樣量（A>B>C）。

2.2.2? 正交試驗(yàn)方差分析? 正交試驗(yàn)對(duì)電子鼻10個(gè)傳感器響應(yīng)值影響的方差分析見表5。平衡溫度對(duì)所有傳感器均有極顯著影響。平衡時(shí)間對(duì)s1、s3、s8、s9有極顯著影響，對(duì)s5、s7有顯著性影響，對(duì)s2、s4、s6、s10無顯著性影響。茶樣量對(duì)s3無顯著性影響，對(duì)其他傳感器均有極顯著影響。

由方差分析可知，以平衡溫度為考察指標(biāo)時(shí)，10個(gè)傳感器同類子集中的組均值大小排序均為100 ℃>80 ℃>60 ℃，且100 ℃的響應(yīng)值均與80 ℃和60 ℃有極顯著差異，故最優(yōu)平衡溫度為100 ℃。

以平衡時(shí)間為考察指標(biāo)時(shí)，10個(gè)傳感器同類子集中的組均值最大的平衡時(shí)間均為45 min，不考慮對(duì)電子鼻響應(yīng)值無顯著影響的4個(gè)傳感器，除了s7外，其他傳感器中45 min的響應(yīng)值大小與15、30 min均有極顯著差異，故最優(yōu)平衡時(shí)間為45 min。

以茶樣量為考察指標(biāo)時(shí)，10個(gè)傳感器同類子集中的組均值大小排序均為3 g>2 g>1 g，且s1、s2、s4、s5、s7、s9、s10中3 g的響應(yīng)值均與2 g存在顯著差異，故最優(yōu)茶樣量為3 g。

綜上由方差分析得出的最優(yōu)組合為A3B1C3，即100 ℃、45 min、3 g，與極差分析結(jié)果相同。

2.2.3? 正交試驗(yàn)結(jié)果分析? 根據(jù)正交試驗(yàn)的極差分析與方差分析結(jié)果，得出烏龍茶電子鼻檢測(cè)的最優(yōu)條件為A3B1C3，即平衡溫度100 ℃，平衡時(shí)間45 min，茶樣量3 g。

2.3? 電子鼻方法學(xué)考察

為考察優(yōu)化方法的穩(wěn)定性，對(duì)烏龍茶茶樣進(jìn)行5次重復(fù)取樣，分別以優(yōu)化的參數(shù)進(jìn)樣分析。結(jié)果表明，在5次重復(fù)中，除了s6、s7、s10的特征值平均值RSD小于7%，其余傳感器的特征值平均值RSD均小于5%，說明該方法的穩(wěn)定性較好，符合檢測(cè)要求。用這個(gè)方法作為烏龍茶香氣分析檢測(cè)手段試驗(yàn)結(jié)果真實(shí)可靠，為烏龍茶香氣組分的進(jìn)一步研究打下了良好的基礎(chǔ)。

圖4為電子鼻采集烏龍茶樣品香氣的傳感器響應(yīng)信號(hào)強(qiáng)度圖。橫坐標(biāo)表示采集時(shí)間，縱坐標(biāo)表示傳感器響應(yīng)強(qiáng)度，每條曲線表示1個(gè)傳感器在300 s內(nèi)的響應(yīng)信號(hào)變化值（相對(duì)電導(dǎo)率G/G0）。從圖4可以看出，從測(cè)定的初始階段到樣品氣體的平穩(wěn)過程中，其變化是先曲線上升后下降，最后趨于平緩，其中s1（氨氣、胺類）、s2（硫化氫、硫化物）、s6（甲烷、沼氣、碳?xì)浠衔铮┑捻憫?yīng)值變化比其他傳感器更高。通過電子鼻傳感器對(duì)烏龍茶茶樣揮發(fā)性物質(zhì)的響應(yīng)試驗(yàn)可知，電子鼻對(duì)烏龍茶揮發(fā)性物質(zhì)有明顯的響應(yīng)，且每一個(gè)傳感器對(duì)其響應(yīng)值各不相同，表明利用電子鼻系統(tǒng)識(shí)別不同品類烏龍茶可行。

2.4? 電子鼻檢測(cè)最優(yōu)條件下不同烏龍茶的香氣輪廓考察

在電子鼻檢測(cè)最優(yōu)條件下，對(duì)13個(gè)不同品種烏龍茶（奇丹、肉桂、水仙、矮腳烏龍、十里香、雀舌、金觀音、黃觀音、北斗、梅占、半天腰、瑞香、奇蘭）的香氣分別進(jìn)行了檢測(cè)，結(jié)果見圖5和圖6。主成分分析（Principal Component Analysis，PCA）利用降維的思想，把多指標(biāo)轉(zhuǎn)化為少數(shù)幾個(gè)綜合指標(biāo)，簡(jiǎn)化分析過程[12-14]，而線性判別分析（linear discrimination analysis，LDA）注重類別的差異以及各種組之間的距離分析[5]。在PCA和LDA中氣味特征越相似，數(shù)據(jù)分布越緊密，氣味特征差異越大，數(shù)據(jù)分布越分散。

在PCA圖中（圖5），2個(gè)主成分累計(jì)貢獻(xiàn)率為87.1%，表明該結(jié)果可有效區(qū)分不同品種烏龍茶的氣味，但部分烏龍茶數(shù)據(jù)組發(fā)生重疊，如十里香、半天腰、雀舌與黃觀音、金觀音與肉桂，而在LDA圖中（圖6），13個(gè)茶樣的電子鼻數(shù)據(jù)組之間基本無重疊（僅十里香、瑞香、雀舌輕微重疊），區(qū)分度較好，這主要是PCA與LDA的運(yùn)算模式不同，但是在本研究中LDA更有利于不同品種烏龍茶的區(qū)分。

13個(gè)茶樣中，奇丹、奇蘭、金觀音、黃觀音、半天腰分布在LDA圖的外源，彼此之間差異較大，且與其他茶樣分隔開來，說明這幾個(gè)茶樣具有獨(dú)特的香氣品質(zhì)，可以與其他茶樣明顯區(qū)分，而肉桂與水仙差異不大，雀舌、瑞香、北斗、十里香緊密聚合，顯示出相近的品質(zhì)特征。

3? 討論

目前，通過電子鼻檢測(cè)茶葉香氣，主要通過采集茶葉中干茶[15]、葉底或茶湯[16]香氣、茶湯香氣的直接混合制備法[17]的方式進(jìn)行分析。前3種多存在樣品內(nèi)重復(fù)性差、樣品間差異性不顯著等問題，而最后一種將茶和冷水直接在頂空瓶中混合，當(dāng)需要檢測(cè)此茶樣時(shí)，才要求在同一溫度下頂空加熱同一時(shí)間使之釋放香氣，然后取香氣進(jìn)入電子鼻，具有香氣不易散失、客觀性強(qiáng)、保證樣品間的香氣可比性、提高試驗(yàn)效率等優(yōu)點(diǎn)，同時(shí)使電子鼻傳感器的響應(yīng)強(qiáng)度提高[17]。但在本研究中，前期預(yù)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)加水的茶樣經(jīng)過一段時(shí)間的平衡加熱后，電子鼻檢測(cè)出來的雷達(dá)圖不穩(wěn)定，響應(yīng)曲線多波動(dòng)，效果不好，故采用茶粉法進(jìn)行單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)。

通過對(duì)烏龍茶揮發(fā)性成分電子鼻工藝的單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)分析，以10個(gè)傳感器的響應(yīng)值為依據(jù)，確定了烏龍茶揮發(fā)性成分電子鼻檢測(cè)的最佳參數(shù)，即平衡溫度為100 ℃，平衡時(shí)間為45 min，茶樣量為3 g。在此基礎(chǔ)上，對(duì)13個(gè)不同品種的烏龍茶香氣進(jìn)行了電子鼻檢測(cè)，觀察電子鼻對(duì)其分類效果，發(fā)現(xiàn)LDA對(duì)茶樣的區(qū)分效果由于PCA，且在LDA圖中，13個(gè)茶樣的電子鼻數(shù)據(jù)組之間基本無重疊（僅十里香、瑞香、雀舌輕微重疊），區(qū)分度較好，說明優(yōu)化的方法適用于烏龍茶香氣物質(zhì)的檢測(cè)。綜上，本研究建立了適用于烏龍茶香氣物質(zhì)分析的儀器分析可靠方法，該方法操作簡(jiǎn)便快捷，實(shí)踐性強(qiáng)，為烏龍茶提供了電子鼻快速檢測(cè)判別的試驗(yàn)方法。

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