易凌霄+陳東紅

摘要：產(chǎn)香微生物多與人類的日常生活息息相關(guān)，廣泛參與面包、醬油、醋、酒、酸奶、泡菜等食品的生產(chǎn)。植物內(nèi)生菌由于生長環(huán)境的獨特性，已經(jīng)成為新型微生物資源開發(fā)的重要途徑之一。綜述了目前關(guān)于植物產(chǎn)香內(nèi)生菌的研究進展，并提出了該領(lǐng)域需深入探討的問題和可能的研究趨勢。

關(guān)鍵詞：植物內(nèi)生菌；產(chǎn)香；食品；揮發(fā)性成分

中圖分類號：Q936 文獻標(biāo)識碼：A 文章編號：0439-8114（2016）20-5169-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.20.001

Abstract： The aroma microorganisms are closely related to the daily life of human being， and widely involved in the production of bread， soy sauce， vinegar， wine， yoghurt， pickles and so on. Because of the unique growth microenvironment， endophytic organisms have become a new way of the exploration of novel microbial resources. Research progress on the endophytes is reviewed， and problems for further study and future research trends are proposed.

Key words： endophyte； aroma-producing； food； volatile constituent

植物性天然香料是以特定植物的花、果、葉、莖、根、皮、子或樹脂等為原料，采用物理方法分離出的具有芳香氣味的易揮發(fā)性有機混合物，大多數(shù)呈油狀或膏狀，少數(shù)呈樹脂狀或半固態(tài)狀[1]。植物性天然香料歷史悠久，種類繁多，應(yīng)用廣泛。例如，在糖果軟飲、罐頭泡菜、煙酒類等食品加工行業(yè)和餐飲業(yè)可作為抗氧化劑和保鮮劑，具有抑臭、調(diào)香、賦味等功效，因而可以提高食品的質(zhì)量和檔次[2-5]。在工業(yè)中，可制成驅(qū)蟲劑、防霉劑與消毒劑等日用品。在化妝品行業(yè)中，可用來制備天然香味劑及營養(yǎng)劑。在醫(yī)藥領(lǐng)域可應(yīng)用于增強免疫力、抗衰老、抗菌消炎、抗癌以及神經(jīng)系統(tǒng)的鎮(zhèn)定等方面[6]。另外，還可以摻入牙膏、洗滌劑、塑料橡膠、紙張文具等與人類息息相關(guān)的生活工作用品。

植物內(nèi)生菌（Endophyte）是指生活在健康植物組織內(nèi)部，但不引起植物病害的微生物，具有豐富的物種多樣性。內(nèi)生菌不是生物分類學(xué)單位，而是一個生態(tài)學(xué)概念[7]。這些微生物與宿主植物長時間共生，增強或賦予宿主抗病、抗逆、固氮等能力，或通過其代謝產(chǎn)物促進植物生長。植物內(nèi)生菌可以產(chǎn)生與宿主相同或不同的具有生物活性的次生代謝產(chǎn)物，如生物堿類、肽類、甾體類、萜類、酚類、醌類、脂肪族類、異香豆素類等。植物內(nèi)生菌構(gòu)成了一座新的微生物資源庫，對其進行深入研究和開發(fā)利用具有重要的學(xué)術(shù)理論價值和廣泛的應(yīng)用前景[8，9]。

產(chǎn)香微生物是指能夠產(chǎn)生芳香性氣味的微生物，多屬于乳酸菌、雙歧桿菌、酵母菌或霉菌類，在奶制品、釀酒、制醋或醬油、泡菜、香料香精加工產(chǎn)業(yè)中有著廣泛的應(yīng)用。同時產(chǎn)香微生物也是香煙加工工藝中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，可有效改善和修飾煙氣，降低雜氣和刺激性，提高卷煙質(zhì)量[10-12]。另外，利用微生物發(fā)酵來生產(chǎn)香料可以有效控制一些植物源香料（如香蘭素、香豆素和洋茉莉醛等）在提取過程中對環(huán)境的污染[13]，還可以進行工廠化生產(chǎn)并減少對耕地面積的占用。

迄今為止，關(guān)于產(chǎn)香微生物或者植物內(nèi)生菌的報道不勝枚舉，但有關(guān)植物產(chǎn)香內(nèi)生菌的報道比較有限。對該領(lǐng)域的研究進展初步進行了總結(jié)，以期對植物產(chǎn)香內(nèi)生菌的系統(tǒng)研究和開發(fā)利用提供一定的啟發(fā)和思路。

1 植物產(chǎn)香內(nèi)生菌的研究進展

1.1 荔枝產(chǎn)香內(nèi)生菌

荔枝（Litchi chinensis）是無患子科荔枝屬亞熱帶常綠喬木。其果實與香蕉、菠蘿、龍眼并稱為“南國四大果品”。荔枝果肉富含糖分、蛋白質(zhì)和維生素，具重要的食用價值；其根、葉、果肉、果核均可入藥；其木材堅實耐腐，具有重要經(jīng)濟價值。周麗娟等[14]從市售荔枝中分離純化得到了5株純系微生物，發(fā)現(xiàn)其中有一株代謝產(chǎn)物香氣優(yōu)雅、甜潤、生長迅速，標(biāo)號為lizhi-1。用GC-MS的方法對該純系菌株發(fā)酵液的香氣成分進行分析，發(fā)現(xiàn)其主要成分為β-苯乙醇、糠醛及十六酸，還有2，3-丁二醇、1-十六烷醇等常見致香成分。將發(fā)酵液處理后用微量噴霧器均勻地噴加于不同品牌卷煙的葉片上，經(jīng)感官評價表明，發(fā)酵成分的加入使煙香更加柔和、細(xì)膩和甜潤[14]。因此，植物產(chǎn)香內(nèi)生菌資源的篩選為煙用香精香料產(chǎn)品的開發(fā)提供了更多選擇。

1.2 西瓜產(chǎn)香內(nèi)生菌

西瓜（Citrullus lanatus）為葫蘆科西瓜屬植物，堪稱“盛夏之王”，具有清熱解暑、瀉火除煩、降血壓等功效，營養(yǎng)和藥用價值都很高。朱宇等[15]從市售新鮮西瓜中分離得到3株純系微生物，1株為酵母，兩株為細(xì)菌。將生長迅速且產(chǎn)香優(yōu)良的酵母XG-01作為進一步研究對象。通過GC-MS對比其發(fā)酵前后種子液成分的變化，發(fā)現(xiàn)苯、胺、酚等物質(zhì)轉(zhuǎn)化成了酸和醇等主要香氣成分物質(zhì)。其中酸類物質(zhì)和醇類物質(zhì)分別占峰面積的55.06%和42.64%。

1.3 萵苣產(chǎn)香內(nèi)生菌

萵苣（Lactuca sativa），又名萵筍，是菊科萵苣屬一年生植物。萵苣可分為葉用和莖用兩類。其莖葉中含有萵苣素，能增強胃液的分泌，刺激消化，增進食欲，并具有鎮(zhèn)痛和催眠作用[16]。高健等[17]從健康莖用萵苣空腔中的淺乳白色膏狀物中分離到1株能產(chǎn)香的酵母類真菌G0901，經(jīng)形態(tài)、生理生化和分子水平鑒定為異常威克漢姆酵母（Wickerhamomyces anomalus）。通過GC-MS分析發(fā)現(xiàn)該菌株的揮發(fā)性成分主要為烯烴類和醇類兩大類，其中前者主要包括檸檬烯（含量20%）、月桂烯、香檜烯、α-蒎烯和羅勒烯等，后者主要包括3-甲基-1-丁醇、苯乙醇和2-辛醇等。除此之外，還有少量的酯類如醋酸戊酯等其他物質(zhì)[17]。

1.4 花椒產(chǎn)香內(nèi)生菌

花椒（Zanthoxylum bungeanum）是蕓香科花椒屬灌木，其果實可作為調(diào)味品和中草藥。劉蘇萌等[18]從健康花椒莖中的內(nèi)生菌中分離純化出12株純系微生物。其中1株產(chǎn)香明顯的編號為1（2）。進一步鑒定發(fā)現(xiàn)該產(chǎn)香菌屬于交鏈孢霉屬（Alternaria sp.）。利用GC-MS對其發(fā)酵產(chǎn)物進行分析，發(fā)現(xiàn)該菌發(fā)酵液揮發(fā)性成分主要為十八烯（8.79%）、六氫吡咯并[1，2-a]吡嗪-1，4-二酮（6.79%）、雙環(huán)[2.2.2]辛烷-1-羧酸（6.24%）、3-羥基-2丁酮（4.67%）、[1，2-a]吡嗪-1，4-二羰基-3-苯甲基-萘吲哚（4.10%）、3-（2-甲基）六氫吡咯并[1，2-a]吡嗪-1，4-二酮（3.83%）、3-（2-甲基）六氫吡咯并[1，2-a]吡嗪-1，4-二酮（3.83%）、5-二十碳烯（3.72%）、5-異亞丙基-3，3-二甲基二氫呋喃（3.54%）、2-氨基-丙二醇（3.27%）、月桂酸（3.25%）、1，2-苯二甲酸丁基二甲基酯（2.97%）、鄰苯二甲酸二異丁酯（2.82%）[18]。

1.5 香茅草產(chǎn)香內(nèi)生菌

香茅草（Cymbopogon citratus）別名包茅，為多年生禾本科植物，可用作香料和調(diào)味品，還具有平喘、止咳、抗菌等多種藥效。楊黎華等[19]從香茅草的葉片、葉鞘和莖中共分離純化得到31株內(nèi)生真菌，其中葉片9株、葉鞘11株、莖11株。聞香評定實驗發(fā)現(xiàn)真菌菌株XCJ-1發(fā)酵液具有清甜香和花香。鑒定該菌株為長喙殼屬。并通過氣相色譜/質(zhì)譜儀對其香味成分進行分離鑒定。共檢出74種化合物：酯類化合物有9種，醇類化合物有9種，酸類化合物有6種，酮類化合物有4種，烯烴類化合物有19種，吡嗪類化合物有3種，其中有乙縮醛二乙醇（9.09%）、檸檬烯（9.09%）、月桂烯（2.60%）、月桂醛（3.64%）等多種香料成分。

1.6 百合產(chǎn)香內(nèi)生真菌

西伯利亞百合（Lilium Siberia）為多年生草本植物。百合具有營養(yǎng)、滋補、醫(yī)藥等廣泛用途，是集食用、藥用、觀賞于一身的重要經(jīng)濟植物。百合花還含有揮發(fā)性油，可以提取香精，在食品、化妝品行業(yè)中有著重要應(yīng)用價值。王麗娟等[20]對西伯利亞百合根莖部的內(nèi)生菌進行分離純化，得到了10株純系微生物，其中有1株產(chǎn)香濃郁的菌株（編號為CMZ01），初步鑒定為毛霉屬（Mucor sp.）。GC-MS分析顯示菌株CMZ01發(fā)酵液揮發(fā)性成分主要為4-戊烯-2-醇、嘧啶、1，2-苯二甲酸丁基二甲基酯、9，12-十八碳二烯酸（Z，Z）、1-丁醇，2-甲基、苯乙醇、鄰苯二甲酸二丁酯、三十四烷、4-庚醇，其含量分別占67.29%、3.42%、2.04%、1.72%、1.38%、1.53%、1.22%、1.29%、1.05%。

1.7 生姜產(chǎn)香內(nèi)生菌

生姜（Zingiber officinale）為姜科多年生宿根草本植物，其根狀莖歷來作為調(diào)味品和藥物使用，可開胃健脾、防暑降溫提神、殺菌消毒、抑制腫瘤等。姜精油作為生姜的主要深加工產(chǎn)品，是符合國內(nèi)外市場需求的具有較高價值的香精和藥用原料。王麗娟等[21]從市售生姜的根狀莖中分離純化得到17株純系微生物，通過發(fā)酵液香味物質(zhì)評價，篩選出4株具有明顯香氣的菌株（分別命名為CYL01、CYL02、CYL04、CYL06）。經(jīng)過菌落形態(tài)鑒別和顯微觀察發(fā)現(xiàn)這4株純系微生物所在菌屬分別是炭角菌屬、囊孢霉屬、毛霉屬和囊孢霉屬。經(jīng)聞香評定發(fā)現(xiàn)菌株CYL01香氣濃郁，利用GC-MS對其發(fā)酵產(chǎn)物進行進一步分析，發(fā)現(xiàn)該菌株代謝產(chǎn)物的香氣成分主要為3-羥基-2-丁酮（44.08%）、3-（1，1-二甲基乙基）-噻吩（5.4%）、3，4-二氫-8-羥基-3-甲基異香豆素（6.19%）、1，2-苯二甲酸丁基二甲基酯（5.68%）等。所有揮發(fā)性成分中酮類和酯類所占比例最大，酮類有10種，占總含量的50.94%，酯類有7種，占總含量的17.73%。

1.8 香莢蘭產(chǎn)香內(nèi)生菌

香莢蘭（Vanilla planifolia）又名香子蘭、香草蘭、香草，是熱帶雨林中的一種多年生大型蘭科香料植物。內(nèi)含170多種芳香成分及17種人體所需的氨基酸，香韻獨特而又無法人工合成，廣泛應(yīng)用于食品、化妝品、煙草等行業(yè)，素有“天然香料皇后”的美稱[22]。香莢蘭果莢有滋補和興奮作用，可用于治療抑郁癥和風(fēng)濕等疾病，具有極高的藥用價值，同時已應(yīng)用到各類食品、茶飲、香水、保健品中。天然香莢蘭制品中的主要香味成分包括香蘭素、香草酸、丁香酚、愈創(chuàng)木酚等。李雪梅等[23]從香莢蘭植株不同部位（氣生根、莖、葉、豆莢）中分離到24株菌。發(fā)現(xiàn)1株產(chǎn)香濃郁的菌株，編號為Van-1a。對菌株的碳氮源利用情況等生理特征進行試驗，結(jié)合形態(tài)觀察結(jié)果確定其為芽孢桿菌（Bacillus sp.），來自香莢蘭氣生根。采用GC-MS鑒定出10種主要揮發(fā)性香味成分：香蘭素（0.69%）、香草酸（0.12%）、丁香酚（2.97%）、4-乙烯基愈創(chuàng)木酚（70.31%）、4-乙基愈創(chuàng)木酚（相對含量0.75%）、4-丙基愈創(chuàng)木酚（0.09%）、4，4-二聯(lián)愈創(chuàng)木酚（1.63%）、1-丁醇（0.34%）、3-羥基-2-丁酮（0.05%）、2-乙基-1-己醇（0.18%）。

1.9 銀杏產(chǎn)香內(nèi)生菌

銀杏（Ginkgo biloba）是現(xiàn)存裸子植物中最古老的孑遺植物，具有活化石的美譽。其具有重要的經(jīng)濟、園林、生態(tài)、藥用、美容等價值。蔣繼宏等[24] 對由江蘇省藥用植物生物技術(shù)重點實驗室分離純化到的銀杏產(chǎn)香內(nèi)生菌Fusarium sp的揮發(fā)油進行分析。利用GC-MS分離得到了24個組分。該菌株揮發(fā)油中主要含十六烷酸乙酯、2，6-二叔丁基對甲酚、異丁酸芳樟（基）酯、鄰苯二甲酸二丁酯、2-乙基-1-十二烷醇、β-新丁子香烯、順式-α，α，5-三甲基-5-四氫乙烯基-2-甲醇呋喃、4-羥基-4-甲基-2-戊酮等。

2 小結(jié)與展望

植物內(nèi)生菌代表了一類重要的微生物種質(zhì)資源庫，對新物種的發(fā)現(xiàn)和新型功能微生物的挖掘意義重大。目前關(guān)于植物內(nèi)生菌的研究已有大量報道，但依舊方興未艾。然而，涉及植物體內(nèi)產(chǎn)香內(nèi)生菌的報道數(shù)量有限，體系有待完善，主要集中在個別水果、蔬菜、花卉和藥用植物上，同時也僅僅做了初步研究，分析了菌的歸類種屬、香氣組成成分和初步應(yīng)用等，因此還有許多方面需要進一步探討。首先，對植物內(nèi)生菌獨特生活微環(huán)境的模擬程度決定了新型微生物分離的成效。因此采用多種類型的培養(yǎng)基以及利用宿主自身材料加工制備而成的培養(yǎng)基，聯(lián)合不同的培養(yǎng)條件進行有效分離是關(guān)鍵之一。其次，可以對香料植物的不同部位進行產(chǎn)香內(nèi)生菌的分離，另外一些非香料植物也可能含有產(chǎn)香內(nèi)生菌，但因為不是優(yōu)勢菌而被忽略。第三，可利用產(chǎn)生香料物質(zhì)中間產(chǎn)物的內(nèi)生菌進一步化學(xué)修飾并最終制備香料。第四，可以通過變換產(chǎn)香內(nèi)生菌的宿主來改良植物的產(chǎn)香性能，而不引起植物發(fā)病。第五，可以利用微生物發(fā)酵技術(shù)對常溫下氣態(tài)的化學(xué)香料成分進行有效收集。第六，可以通過對產(chǎn)香內(nèi)生菌與宿主的次生代謝合成的機理進行深入研究，并且通過基因改良技術(shù)創(chuàng)建新的產(chǎn)香菌株。

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