魯鳳民 曾婉嘉 文夏杰 廖昊 鄒軍 王雷婕 席婧媛 王建文 王杰 陳香梅

慢性乙型肝炎病毒(HBV)感染是我國病毒性肝炎、肝硬化和肝癌的最主要致病因素，我國現(xiàn)有慢性HBV感染者約7 800萬人，慢性乙型肝炎(CHB)患者約2 400萬人[1]。隨著疾病進展，約20%～40% CHB患者將發(fā)展為肝硬化、肝硬化失代償?shù)冉K末期肝病及肝癌[2]。我國的肝癌患者占全世界新發(fā)肝癌病例的50%以上，且80%以上的病例與慢性HBV感染有關(guān)。因此對CHB患者開展及時、規(guī)范的抗病毒治療以阻斷疾病進展，減少終末期肝病的發(fā)生至關(guān)重要。

目前臨床上使用的抗病毒藥物主要有長效干擾素和核苷(酸)類藥物(NAs)。NAs抑制病毒復制的作用更為明顯，且口服方便、不良反應(yīng)相對較少，在臨床上被廣泛使用。但無論是NAs還是長效干擾素，各大指南目前僅推薦對有明顯肝臟炎癥及肝纖維化、肝硬化的CHB患者進行抗病毒治療。本文總結(jié)了當前CHB在實驗室診斷和治療療效監(jiān)測中遇到的新問題，同時也討論了近期發(fā)現(xiàn)的CHB新型標志物的臨床應(yīng)用價值，并對這些標志物在CHB抗病毒治療中的應(yīng)用進行展望。

一、慢性HBV感染的自然史

慢性HBV感染是一個病毒復制與宿主免疫相互作用的動態(tài)過程，其自然史可分為四個時期，分別是免疫耐受期、免疫清除期、低活動或非復制期和再活動期。免疫耐受期的血清HBV DNA水平很高，但肝臟的免疫病理損傷輕微，ALT正?；騼H略升高，稱為HBeAg陽性慢性HBV感染。隨著機體免疫耐受狀態(tài)被打破進入免疫清除期，患者出現(xiàn)典型的慢性肝炎癥狀，也稱為HBeAg陽性CHB。持續(xù)的免疫應(yīng)答會使部分CHB患者的病毒復制被控制，肝臟炎癥得到改善，反映病毒活躍復制的HBeAg轉(zhuǎn)陰，進入免疫控制期，即HBeAg陰性慢性HBV感染。其中有些患者會發(fā)生病毒復制再激活，并引發(fā)肝臟炎癥損傷，成為HBeAg陰性CHB患者(圖1)。

二、CHB抗病毒治療相關(guān)實驗室診斷和療效監(jiān)測中遇到的新問題

(一)如何確定亟需抗病毒治療的CHB患者，并使其得到及時治療？

因活動性肝臟炎癥會加速疾病進展，需要及早進行抗病毒治療，因此，包括ESAL/APASL/AASLD在內(nèi)的各大指南均以血清HBV DNA、血清ALT水平和肝臟疾病嚴重程度來聯(lián)合評判是否開始CHB的抗病毒治療。目前臨床上多以ALT的異常升高作為肝臟炎癥損傷的判定指標，但多項研究顯示，有13.8%～47.65%的CHB患者盡管存在明顯的肝臟炎癥損傷，但ALT并無明顯升高[3]。考慮到ALT指標不足以完全反映肝臟損傷，各大指南進一步補充將肝臟有中度或以上的纖維化或炎癥壞死作為抗病毒治療的指征。肝組織活檢是目前診斷肝纖維化和肝臟炎癥的金標準，但由于其有創(chuàng)性和潛在風險，難以在臨床上廣泛應(yīng)用。為發(fā)現(xiàn)這些ALT不升高但需要治療的患者，臨床上亟需一些新的可用于肝臟炎癥診斷和肝纖維化嚴重程度評估的指標，以及時甄別需要抗病毒治療的CHB患者。

圖1 慢性HBV感染的自然史(修改自文獻)[2]

(二)如何對NAs抗病毒治療的療效進行評估與監(jiān)測？

HBV DNA水平不僅是決定患者是否進行抗病毒治療的重要依據(jù)，同時也是評價患者病毒學應(yīng)答的指標。然而，在接受新一代NAs如恩替卡韋或替諾福韋酯治療1年后，患者的HBV DNA轉(zhuǎn)陰率(下降至檢測下限之下)分別為67%和76%。那么，血清HBV DNA轉(zhuǎn)陰后該如何繼續(xù)進行抗病毒療效評價？雖然NAs藥物能使血清HBV DNA迅速轉(zhuǎn)陰，但若此時停藥往往會出現(xiàn)病毒學反彈甚至病情加重，因此現(xiàn)有指南均推薦對患者進行1～3年不等的鞏固治療或長期治療；且對HBeAg陰性的患者要長期治療直至血清HBsAg消失，即患者獲得“臨床治愈”。然而，很少一部分患者可以獲得HBsAg轉(zhuǎn)陰，同時缺乏其他評估患者停藥風險的可靠指標，所以臨床上NAs藥物的停藥指征并不具有可操作性?？紤]到停藥有較高的復發(fā)風險，多數(shù)指南在推薦停藥的同時強調(diào)了抗病毒治療用藥的長期性。而長期用藥又給CHB患者帶來經(jīng)濟、社會和心理學上的壓力，對患者依從性也是一個考驗。如何確定這些患者的治療終點以及部分患者是否可以安全停藥，也是極具爭議的臨床問題。

總之，目前CHB的實驗室檢測存在亟需解決的兩大問題：(1)尋找新的用于評估肝臟炎癥和纖維化嚴重程度的指標，及早鑒別需抗病毒治療的CHB患者，使其及時得到治療；(2)尋找新的用于NAs藥物鞏固治療階段評價患者病毒學應(yīng)答的指標，以反映共價閉合環(huán)狀DNA(cccDNA)的存在及活性，為接受NAs鞏固治療的CHB患者提供個體化的停藥風險指導。

三、近期發(fā)現(xiàn)的CHB相關(guān)新型標志物及其臨床應(yīng)用價值

(一)用于確定抗病毒適宜人群的新型標志物

血清中乙型肝炎核心抗體(抗-HBc)是HBV既往感染和正在感染的重要標志。乙型肝炎核心抗原(HBcAg)免疫原性強，能夠刺激機體產(chǎn)生強烈的免疫反應(yīng)，所以急性HBV感染恢復后的很長一段時間內(nèi)抗-HBc都是陽性。臨床常規(guī)開展的抗-HBc檢測只能定性反映是否感染過HBV。最近，夏寧邵團隊開發(fā)了抗-HBc定量檢測試劑。臨床研究表明，血清抗-HBc定量水平與慢性HBV感染自然史的不同時期有著非常密切的關(guān)系，免疫耐受期抗-HBc水平相對較低，免疫清除期抗-HBc水平較高，而在非活動HBsAg攜帶或者低復制期時抗-HBc水平很低。此外，ALT正常但可能存在肝臟損傷和炎癥的慢性HBV感染者，其血清抗-HBc水平也更高，提示抗-HBc定量水平與肝臟炎癥狀態(tài)密切相關(guān)[4]。因此血清抗-HBc定量檢測可以彌補部分因ALT未升高導致的CHB患者漏診。

高爾基體蛋白73(GP73)之前一直被認為是肝癌的診斷標志物，但我們和其他實驗室的研究發(fā)現(xiàn)，血清GP73實際上是一個反映肝纖維化及肝硬化的標志物[5-6]。近期的一系列研究結(jié)果表明，血清GP73與肝臟炎癥活動度具有相關(guān)性(相關(guān)系數(shù)0.524)，可能也是肝臟炎癥的潛在標志物。進一步研究發(fā)現(xiàn)，對于HBeAg陽性或陰性的CHB患者，GP73對中度以上的肝臟炎癥活動度的ROC曲線下面積分別為0.782和0.841。通過多因素分析，將適用于肝臟炎癥活動度診斷的指標如AST、GGT組合，建立肝臟炎癥活動的聯(lián)合診斷模型HIM(hepatic inflammation diagnosis model)。對于中度以上炎癥活動度診斷效能ROC曲線達到0.898。值得強調(diào)的是，這種基于GP73的肝臟炎癥診斷模型的曲線下面積在ALT不升高(即ALT<40)的CHB患者中能達到0.873，且診斷效能穩(wěn)定[7]。同期發(fā)表的國內(nèi)另外一項研究也顯示，血清GP73是一個肝臟炎癥損傷的指標，特別在ALT<2 ULN的患者中，GP73對于中度以上炎癥活動度診斷ROC曲線下面積可達0.806[8]。據(jù)此我們建議，未來應(yīng)開展更多的臨床研究，在進一步完善GP73的肝硬化診斷應(yīng)用的同時，優(yōu)化基于GP73的肝臟炎癥診斷模型，為ALT不升高的CHB患者肝臟炎癥精準鑒別提供無創(chuàng)診斷手段。

為進一步驗證GP73升高與肝臟炎癥活動度有關(guān)，我們的研究中納入了一個抗病毒治療縱向研究隊列。對該組患者進行連續(xù)血清學檢測發(fā)現(xiàn)，隨著抗病毒治療后肝臟炎癥的有效控制，血清GP73水平和ALT一樣明顯下降，但GP73的下降在時相上略有延遲[7]。這或許間接支持了我們的觀點，GP73是一個肝臟再生修復指標，即：肝臟炎癥損傷致ALT從肝細胞釋放入血；為修復損傷的肝組織，殘存肝細胞GP73表達隨即增加，參與代償性肝再生的啟動，相對應(yīng)血清GP73水平升高[9]；隨著病毒復制被抑制，肝臟的炎癥得到改善，伴隨肝細胞損傷的緩解，ALT隨即復常，肝細胞再生也隨著肝臟的修復而停止，不再需要GP73高表達以促進肝細胞增殖，血清GP73也隨即復常。我們在該研究中也發(fā)現(xiàn)具有促炎和促肝細胞再生修復作用的白細胞介素6能夠轉(zhuǎn)錄激活GP73的表達。近期王建設(shè)團隊還探索了GP73測定在兒童不同病因肝病中的診斷應(yīng)用，以肝穿刺病理學診斷為金標準，在3歲以下兒童中GP73與肝臟纖維化程度及炎癥活動度具有相關(guān)性。以臨床使用的肝硬化診斷模型APRI為對照，GP73對于3歲以下兒童的中度以上肝纖維化的診斷能力優(yōu)于APRI[10]。

(二)用于抗病毒治療療效監(jiān)測和評估的新型標志物及其臨床應(yīng)用

我們前期研究發(fā)現(xiàn)，慢性HBV感染者血清中除了Dane顆粒外，還存在HBV RNA病毒樣顆粒(圖2)[11]。HBV RNA病毒樣顆粒中含有HBV前基因組RNA(pgRNA)，在NAs抗病毒治療下其水平能更好地反映肝細胞內(nèi)cccDNA的存在及轉(zhuǎn)錄活躍狀態(tài)[12]。據(jù)此我們推測，NAs抗病毒治療時血清HBV DNA和HBV RNA的同時持續(xù)消失(低于檢測下限)是真正的病毒學應(yīng)答[13]。而且，HBV RNA在HBV DNA消失后很長一段時間內(nèi)仍可以被檢測到[14]，聯(lián)合HBV DNA和HBV RNA的總核酸檢測也更能反映cccDNA的活性[15]；張文宏團隊的工作更顯示了抗病毒治療下患者血清HBV RNA水平與肝臟炎癥損傷的相關(guān)性[12]。因此，研制HBV DNA和HBV RNA的聯(lián)合檢測具有顯著的臨床意義。

圖2 CHB患者血清中存在HBV RNA樣病毒顆粒[11,16]

CHB患者抗病毒治療的理想治療終點是“臨床治愈”，即血清HBsAg消失，伴有或不伴有抗-HBs陽轉(zhuǎn)。但很多研究都發(fā)現(xiàn)，長期用藥、尤其是當HBeAg轉(zhuǎn)陰后，血清HBsAg與cccDNA相關(guān)性顯著下降，且低水平HBsAg陽性并不能證明肝臟內(nèi)仍有cccDNA存在[17]。對于這一現(xiàn)象，目前較為公認的解釋是整合于宿主基因組上的HBV DNA片段也能轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生HBsAg[18]。因此，臨床上亟需新的能真實反映肝組織cccDNA消失或靜默的指標，以判定接受延長鞏固治療的患者是否已經(jīng)獲得“病毒學治愈”?？煽康腸ccDNA檢測技術(shù)對于判定CHB的病毒學治愈至關(guān)重要。目前，精準cccDNA檢測的最大挑戰(zhàn)是如何排除松弛環(huán)狀雙鏈DNA(rcDNA)的干擾。由于cccDNA是轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生pgRNA的唯一來源，而pgRNA又是逆轉(zhuǎn)錄合成病毒rcDNA負鏈的唯一模板，所以rcDNA的存在不僅間接反映了cccDNA的存在，更提示其處于轉(zhuǎn)錄活躍狀態(tài)。據(jù)此我們認為，在檢測患者肝組織內(nèi)是否存在有感染潛能的病毒核酸時，并不需要區(qū)分rcDNA和cccDNA。但考慮到慢性HBV感染中整合病毒DNA的普遍存在，有必要建立一種能有效區(qū)分有病毒復制能力的rcDNA/cccDNA與無復制能力的整合HBV DNA的檢測技術(shù)。我們前期研究發(fā)現(xiàn)，整合HBV DNA片段的斷端主要集中在HBV直接重復區(qū)(direct repeat，DR)1和DR2附近[19]，也是HBV 基因組的缺口(Gap)區(qū)1592～1826附近，整合片段斷端的這一特征與雙鏈線性DNA是HBV整合主要來源的報導相一致?；谡螲BV DNA片段的這些特征，我們建立了一對單跨rcDNA缺口引物，使之能有效擴增rcDNA或cccDNA，但由于兩引物在整合的線性HBV DNA片段上的方向相反，故不能擴增整合HBV片段[20]。

血清HBV核心抗原相關(guān)抗原(HBcrAg)包括HBeAg、HBcAg以及分子量為22 kDa的前核心蛋白p22cr，與HBV RNA一樣，只能來源于pgRNA，而pgRNA只能從cccDNA轉(zhuǎn)錄而來，因此HBcrAg能反映肝組織內(nèi)cccDNA的水平和轉(zhuǎn)錄活性，且兩者具有很強的相關(guān)性[21]。此外，NAs不能直接作用于HBcrAg，所以HBV DNA低于檢測下限后，HBcrAg仍可被檢測。徐東平團隊的最新研究發(fā)現(xiàn)了抗病毒治療時代患者血清中HBV DNA、HBV RNA、HBcrAg和HBsAg等指標的動態(tài)變化規(guī)律(圖3)[14]。目前困惑在于，現(xiàn)有HBcrAg試劑盒的檢出下限卻顯著高于HBeAg檢測試劑。

需要強調(diào)的是，盡管我們和其他實驗室的研究結(jié)果共同提示，HBV RNA和HBcrAg是目前比較理想的反映cccDNA轉(zhuǎn)錄活性的血清學指標，可以很好地用于CHB患者抗病毒治療HBV DNA低于檢測下限后的病毒學應(yīng)答的監(jiān)測。但血清HBV RNA和HBcrAg是否可作為評估停藥風險的指標，尚缺乏進一步的研究。另外還需要注意，對長期接受抗病毒治療的CHB患者判定其是否達到病毒學治愈時，只有在這些患者血清中有關(guān)HBV的病原學指標均低于檢測下限時，才有行肝臟穿刺術(shù)進行肝組織cccDNA檢測的必要。另外，肝穿刺活檢cccDNA檢測也可用于隱匿性HBV感染的診斷。

圖3 NAs治療下患者血清HBV DNA、RNA、HBcrAg和HBsAg動態(tài)變化示意圖[14]

綜上所述，我們建議：(1)考慮增加抗-HBc定量和血清GP73測定，以在非常規(guī)肝穿刺活檢的情況下，使有明顯肝臟炎癥損傷的患者得到及時的抗病毒治療，減少肝硬化終末期肝病發(fā)生；另一方面，對于正在接受NAs藥物抗病毒治療的患者，在靈敏試劑檢測血清HBV DNA低于檢測下限后，應(yīng)加測HBV RNA或HBcrAg，以對處于鞏固治療階段的患者病毒學應(yīng)答進行監(jiān)測，并評估鞏固治療后的停藥風險等。作為曾經(jīng)的HBV感染高流行國家，我們在通過乙型肝炎疫苗預防接種已有效減少新發(fā)感染的同時，對確診需要治療的CHB患者進行精準的干預治療，以減少終末期肝病的發(fā)生。