申子平，孔慶娟，郭丹丹

（長治職業(yè)技術(shù)學(xué)院動物科學(xué)系，長治 046000）

大腸桿菌屬于豬體內(nèi)的常駐菌，一旦免疫力下降或環(huán)境變化就會引起仔豬發(fā)病。隨著養(yǎng)殖規(guī)模的不斷擴大，晉東南養(yǎng)豬場豬大腸桿菌病頻繁發(fā)生。由于流行的大腸桿菌抗原血清型尚不明確，防治效果較差。本研究對晉東南地區(qū)10個縣區(qū)的養(yǎng)豬場進行取樣，進行大腸桿菌的分離、培養(yǎng)和鑒定及藥敏試驗。以明確晉東南豬大腸桿菌病的抗原血清型，進一步找出治療該病的高效藥物。

1 材料與方法

1.1 病料 在晉東南地區(qū)沁縣、武鄉(xiāng)、襄垣、黎城、平順、沁源、長子、長治、壺關(guān)和陵川等10個縣的15個養(yǎng)豬場，采集具有大腸桿菌病典型癥狀的病豬或病死豬的直腸內(nèi)糞便，或者截取豬的十二指腸作為病料，共采集51份。

1.2 試劑 營養(yǎng)瓊脂和營養(yǎng)肉湯購自上海哈靈生物科技有限公司；麥康凱培養(yǎng)基購自上海博微生物科技有限公司；微量生化鑒定管購自廣東環(huán)凱有限公司；藥敏片購自杭州微生物試劑有限責(zé)任公司；伊紅美藍瓊脂購自廣東環(huán)凱有限公司；大腸桿菌O抗原定型血清購自寧波天潤生物藥業(yè)有限公司。

1.3 大腸桿菌的分離、培養(yǎng) 在伊紅美藍瓊脂培養(yǎng)基上無菌接種病料，37℃培養(yǎng)24 h，挑取有金屬光澤、紫黑色的單菌落，涂片、染色，鏡檢判斷[1]。挑取鏡檢后的單菌落分別接種到營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、營養(yǎng)肉湯和麥康凱培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)24 h，鏡檢。挑取在麥康凱瓊脂上生長的磚紅色單菌落[2]，接種于營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)24 h后，保存于4℃?zhèn)溆谩?/p>

1.4 生化試驗 挑取純化后的菌落，按照常規(guī)方法進行生化反應(yīng)試驗[3]。生化試驗有15項：葡萄糖、賴氨酸、甘露醇、鳥氨酸、麥芽糖、MR、吲哚、果糖、尿素、VP、枸椽酸鹽和H2S等。

1.5 分離菌血清型鑒定 用2 mL含有石碳酸（0.5%）的生理鹽水洗下純化擴繁后的培養(yǎng)物，稀釋后密封于玻璃管內(nèi)，121℃滅菌2 h，備用。用微量移液器吸取滅菌后的待測液，加1滴到玻板上。另換槍頭吸取單因子定型血清，滴1滴到抗原內(nèi)，立即混勻，靜置5 min后觀察結(jié)果。如果出現(xiàn)凝集現(xiàn)象明顯，則為陽性。滅菌后的待測液和生理鹽水混合液作為空白對照[4]。

1.6 分離菌毒力試驗 選取體重20 g左右的小白鼠，分為實驗組和對照組，每組小白鼠3只。取純化培養(yǎng)后的細菌接種于營養(yǎng)肉湯，37℃培養(yǎng)24 h，培養(yǎng)后計數(shù)并稀釋。每只小鼠腹腔接種0.3 mL稀釋后的細菌液，而對照組小鼠則腹腔接種0.3 mL滅菌后的生理鹽水。接種后仔細觀察小鼠存活情況，做好記錄。取病死鼠的病料接種于麥康凱瓊脂上培養(yǎng)，挑取培養(yǎng)后的菌落染色鏡檢。使3只小鼠菌死亡的菌株為強毒力菌株；可致2只小鼠死亡的菌株為中等毒力菌株；僅致1只小鼠死亡的菌株為低毒力菌株；無死亡為無毒株的標(biāo)準[5]。

1.8 藥敏試驗 測定用K-B紙片法進行[6]。用于測定的藥物包括：頭孢吡肟、阿莫西林、環(huán)丙沙星、頭孢唑啉、阿米卡星、鏈霉素、利福平、呋喃唑酮、頭孢曲松、卡那霉素、氟苯尼考和氧氟沙星等[7]。采用藥物的抑菌圈直徑（d）來判斷細菌對該藥物的敏感性：d≥16 mm為敏感；d＜10 mm為耐藥；10 mm≤d＜15 mm為中介。

2 結(jié)果與討論

2.1 培養(yǎng)與鏡檢結(jié)果 經(jīng)培養(yǎng)與鏡檢初步確定，51份病料中47份可分離到大腸桿菌。菌落在麥康凱瓊脂上為紅色；在伊紅美藍培養(yǎng)基上為帶金屬光澤的紫黑色單菌落；在營養(yǎng)瓊脂上為邊緣規(guī)則的光滑圓形菌落，且呈灰白色的半透明狀；在營養(yǎng)肉湯中呈渾濁樣，管底有白色沉淀，管上有菌環(huán)，聞管口有臭味。用分離菌涂片，染色后鏡檢，可見分離菌為無芽孢的革蘭氏陰性菌，兩端鈍圓且染色略深，分布分散，偶有幾個連于一起。

2.2 分離菌生化試驗 對47株分離菌進行15項生化試驗，結(jié)果見表1。在生化試驗中葡萄糖、賴氨酸、甘露醇、鳥氨酸、麥芽糖、MR、吲哚、果糖幾個項目的試驗陽性率為100%[8]，而在尿素、VP、枸椽酸鹽和H2S項目的陽性率為0%（表1）。分離細菌符合大腸桿菌的特性。

2.3 分離菌血清型鑒定 47株分離細菌確定O抗原的有42株，沒有確定類型的有5株。42株分離菌共有12個血清型，主要有O138、O2、O107和O152，分別占已定型菌的19.05%、14.29%、11.90%和11.90%，合計占已定型菌株數(shù)的57.14%（表2）。由此可見，O138、O2、O107和O152是晉東南地區(qū)豬大腸桿菌主要血清型。因此，在預(yù)防該菌引起的仔豬疾病時應(yīng)以O(shè)138、O2、O107和O152血清型為主要對象。

2.4 毒力測定 實驗組小鼠出現(xiàn)了呼吸急促、拉稀等癥狀，并有大量小鼠相繼死亡。47株分離菌中具有強致死力的菌株數(shù)為25株，占53.19%；有38株引起小鼠死亡，占到總數(shù)的80.85%。小鼠的死亡時間主要集中在接種后24 h。典型的病變?yōu)楦纬鲅⒛[大，心包淤血，脾腫大等。47株分離大腸桿菌中有9株大腸桿菌沒有引起小鼠死亡。另外，對照組的小鼠沒有出現(xiàn)死亡情況，剖檢也無病理變化[9]。說明，在晉東南存在的豬源大腸桿菌致病力很強。養(yǎng)豬時應(yīng)該對仔豬黃、白痢和水腫病重視[10]。

表1 分離菌生化試驗結(jié)果Table 1 Biochemical test result of E.coli isolates

表2 分離菌血清型鑒定Table 2 Identifi cation serotyping of E. coli isolates

表3 分離菌毒力強弱測定結(jié)果Table 3 Virulence measurement result of E. coli isolates

表4 38株大腸桿菌對15種藥物的敏感情況Table 4 Sensitivity of 38 E. coli isolates to 15 kinds of drugs

2.5 藥敏試驗 采用15種藥物對致小鼠死亡的38株細菌進行了敏感性測定，結(jié)果見表4。分離的大腸桿菌菌株對頭孢吡肟敏感性最強（敏感率89.47%），其次是阿米卡星（敏感率81.58%）、呋喃唑酮（敏感率73.68%）和氧氟沙星；中介毒株對氟苯尼考最為敏感（敏感率68.42%）；而對利福平敏感性最低，耐藥性最強，其次是阿莫西林和大觀霉素。所以在該區(qū)治療仔豬黃、白痢和水腫病時應(yīng)首選頭孢吡肟，其次是阿米卡星、呋喃唑酮和氧氟沙星；少用慶大霉素和氟苯尼考；禁用利福平、阿莫西林和大觀霉素等作用效果差的藥物。

經(jīng)過近幾年的調(diào)查，發(fā)現(xiàn)晉東南地區(qū)的養(yǎng)豬場獸醫(yī)人員短缺，許多養(yǎng)殖人員不具備科學(xué)用藥知識，由于引起豬大腸桿菌病的血清型種類過多，隨意用藥造成了細菌的抗藥性增加[11]。

大腸桿菌引起的仔豬疾病較多，在晉東南廣泛流行，有的豬場大腸桿菌對仔豬致死率達到了50%，甚至更高。本調(diào)查為晉東南豬大腸桿菌病的有效預(yù)防和治療提供了理論基礎(chǔ)。