段博芳，李錫慧，肖榮海，艾 軍，趙勝蘭，趙 珍，相德才，楊子江，孫洪正，張文東

（1.云南省動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，昆明 650051；2. 云南出入境檢疫檢驗(yàn)局，昆明 650228；3. 云南省畜牧獸醫(yī)科學(xué)院，昆明 650224；4. 昆明市疾病預(yù)防控制中心，昆明 650228）

小反芻獸疫（pestedes petits ruminants，PPR）又稱羊瘟，是由小反芻獸疫病毒（Pestedes petits ruminants virus，PPRV）感染山羊、綿羊等小反芻動(dòng)物引起的一種高度接觸性傳染病[1]。發(fā)病動(dòng)物主要表現(xiàn)為發(fā)熱、口炎、腹瀉和肺炎等癥狀。世界動(dòng)物衛(wèi)生組織將其列為必須報(bào)告的動(dòng)物疫病，我國將其列為進(jìn)出境動(dòng)物檢疫的一類動(dòng)物疫病。PPR 具有較高的死亡率，在首次暴發(fā)流行的動(dòng)物群里死亡率高達(dá)50%～80%，可造成破壞性的影響。

1942年，PPR首次報(bào)道于西非的科特迪瓦；1970～1972年，PPR擴(kuò)散至東非蘇丹[2]；1987年印度發(fā)生PPR疫情[3]。20世紀(jì)80年代至今，與我國鄰近的國家，如印度、尼泊爾、巴基斯坦、哈薩克斯坦、坦薩克斯坦和蒙古等國家都報(bào)道過PPR疫情的發(fā)生。在我國，PPR疫情于2007年7月首次發(fā)生在西藏阿里地區(qū)，2008、2010年P(guān)PR在西藏局部流行。2011年至2013年10月，國內(nèi)未出現(xiàn)PPR發(fā)生和流行的報(bào)道。2013年11月，新疆伊犁州霍城縣突然出現(xiàn)PPR疫情，隨后在全國呈現(xiàn)快速擴(kuò)散態(tài)勢，2014年后全國大部分省份均有疫情（http://www.syj.moa.gov.cn/）發(fā)生。近年來，我國PPR一直呈散發(fā)或點(diǎn)發(fā)狀態(tài)。

世界動(dòng)物衛(wèi)生組織（Office international des épizooties，OIE）推薦的小反芻獸疫抗體檢測方法為中和試驗(yàn)和ELISA試驗(yàn)。Libeau等[4]應(yīng)用桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)了PPRV N 蛋白，同時(shí)利用PPRV免疫BALB/c小鼠，制備針對PPRV N蛋白的單克隆抗體。在獲得表達(dá)蛋白和單抗的基礎(chǔ)上，結(jié)合商品化的HRPO標(biāo)記的兔抗鼠二抗，利用過氧化氫-OPD顯色，建立了檢測PPRV抗體的C-ELISA 方法。商品化的PPRV C-ELISA抗體檢測試劑盒目前僅見于英國BDSL公司和法國CIRAD實(shí)驗(yàn)室聯(lián)合（簡稱BDSL-CIRAD）研制試劑盒。這種試劑盒價(jià)格高，每次購買包裝量大，不適合于國內(nèi)檢測的實(shí)際需要。有研究顯示試劑盒檢測時(shí)與RPV有交叉反應(yīng)，只適用于無RPV的地區(qū)[5]。本研究將自主研發(fā)的C-ELISA試劑盒與國際通用PPRV C-ELISA抗體檢測試劑盒進(jìn)行比較分析，為臨床上選用性價(jià)比高、使用方便、特異性高的C-ELISA試劑盒提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 試劑盒 自主研發(fā)的小反芻獸疫病毒C-ELISA抗體檢測試劑盒，簡稱“YN PPRV C-ELISA試劑盒”，由云南出入境檢驗(yàn)檢疫局檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心動(dòng)檢實(shí)驗(yàn)室研制與開發(fā)。國際通用小反芻獸疫病毒PPRV C-ELISA抗體檢測試劑盒，簡稱“ID VET 試劑盒”，由法國ID-VET實(shí)驗(yàn)室研制與生產(chǎn)。

1.1.2 樣品 本研究中664份已知來源的臨床羊、牛血清由云南動(dòng)物疾病預(yù)防與控制中心提供，其中山羊血清416份，牛血清248份，分別采自騰沖市、德宏傣族景頗族自治州、鎮(zhèn)康縣、耿馬傣族佤族自治縣、昆明市、昌寧縣、景谷傣族彝族自治縣、石林彝族自治縣、會澤縣等地。

1.2 方法

1.2.1 兩種試劑盒檢測結(jié)果 參照YN PPRV C-ELISA試劑盒說明書進(jìn)行操作，檢測664份待檢血清，檢測時(shí)設(shè)立強(qiáng)陽性、弱陽性、陰性、HRP羊抗鼠二抗對照；參照ID VET PPRV C-ELISA抗體檢測試劑盒操作說明書進(jìn)行操作，檢測664份待檢血清，檢測時(shí)設(shè)立陽性、陰性對照。檢測結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)參照試劑盒內(nèi)說明書。

1.2.2 YN PPRV C-ELISA抗體檢測試劑盒可重復(fù)性試驗(yàn) 采用YN PPRV C-ELISA抗體檢測試劑盒分別檢測已知背景血清15份，其中強(qiáng)陽性血清5份，弱陽性血清5份，陰性血清5份，在相同的條件下進(jìn)行批內(nèi)和批間可重復(fù)性試驗(yàn)。

1.2.2.1 批內(nèi)可重復(fù)性試驗(yàn) 隨機(jī)抽取批號為1504001、1504002、1504003的試劑盒各5個(gè)。每份樣品做5個(gè)重復(fù)，對5份強(qiáng)陽性血清，5份弱陽性血清，5份陰性血清樣品進(jìn)行檢測。

1.2.2.2 批間可重復(fù)性試驗(yàn) 使用3個(gè)不同批次的檢測試劑盒（批號1504001、1504002、1504003）對5份強(qiáng)陽性血清，5份弱陽性血清，5份陰性血清樣品進(jìn)行檢測。

2 結(jié)果與討論

2.1 兩種試劑盒檢測結(jié)果 YN PPRV C-ELISA抗體試劑盒與ID VET PPRV C-ELISA試劑盒檢測結(jié)果顯示，檢測結(jié)果同為陽性和陰性血清分別是314份、336份，YN PPRV C-ELISA抗體試劑盒陽性而ID VET PPRV C-ELISA試劑盒陰性血清7份，YN PPRV C-ELISA抗體試劑盒陰性而ID VET PPRV C-ELISA試劑盒陽性血清4份。

YN PPRV C-ELISA抗體試劑盒相對ID VET PPRV C-ELISA試劑盒的符合率、敏感性、特異性分別為98.34%、97.82%、97.96%，結(jié)果詳見表1，兩者一致性用Kappa值表示，Kappa=0.97。Kappa=（P0-PC）/(1-PC)，P0=0.9834，PC=0.5005（P0代表觀察符合率，PC代表機(jī)遇符合率）。

反映試驗(yàn)判定的結(jié)果與標(biāo)準(zhǔn)診斷結(jié)果的一致性的2個(gè)指標(biāo)是符合率和Kappa值，而反映試驗(yàn)結(jié)果的真實(shí)性是特異性和敏感性。結(jié)果顯示，YN PPRV C-ELISA抗體檢測試劑盒相對ID PPRV C-ELISA抗體檢測試劑盒的符合率和Kappa值分別是98.34%、0.97，特異性和敏感性分別為97.96%、97.82%。以上指標(biāo)結(jié)果表明，由云南出入境檢驗(yàn)檢疫局檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心自主研發(fā)的PPRV C-ELISA抗體檢測試劑盒與OIE小反芻獸疫參考實(shí)驗(yàn)室推薦的試劑盒相比，檢測結(jié)果具有高的可重復(fù)性、真實(shí)性和穩(wěn)定性。

2.2 YN PPRV C-ELISA抗體檢測試劑盒的可重復(fù)性試驗(yàn)

2.2.1 批內(nèi)可重復(fù)性試驗(yàn) 試劑盒批號為1504001試驗(yàn)結(jié)果見表1，試劑盒批號為1504002試驗(yàn)結(jié)果見表2，試劑盒批號為1504003試驗(yàn)結(jié)果見表3。

表1 1504001批內(nèi)重復(fù)試驗(yàn)結(jié)果Table 1 The inter-assay results of No.1504001

表2 1504002 批內(nèi)重復(fù)試驗(yàn)結(jié)果Table 2 The inter-assay results of No.1504002

表3 1504003批內(nèi)重復(fù)試驗(yàn)結(jié)果Table 3 The inter-assay results of No.1504003

1504001檢測結(jié)果顯示陽性血清（強(qiáng)陽性、弱陽性）批內(nèi)變異系數(shù)為0%～0.05%，陰性批內(nèi)變異系數(shù)為0.67%～2.25%。1504002檢測結(jié)果顯示陽性血清（強(qiáng)陽性、弱陽性）批內(nèi)變異系數(shù)為0%～0.05%，陰性批內(nèi)變異系數(shù)為0.63%～3.55%。1504003檢測結(jié)果顯示陽性血清（強(qiáng)陽性、弱陽性）批內(nèi)變異系數(shù)為0.01%～0.05%，陰性批內(nèi)變異系數(shù)為0.69%～1.05%。

2.2.2 批間可重復(fù)性試驗(yàn) 試劑盒批號為1504001、1504002、1504002批間可重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果見表4。檢測結(jié)果陽性血清（強(qiáng)陽性、弱陽性）批間變異系數(shù)為0.01%～0.06%，陰性血清批間變異系數(shù)為0.57%～1.45%。

表4 批間重復(fù)試驗(yàn)結(jié)果Table 4 The inter-assay results of kit

可重復(fù)試驗(yàn)結(jié)果顯示，YN PPRV C-ELISA抗體檢測試劑盒批次和批內(nèi)檢測結(jié)果表明該方法簡便、快速、有效，具有高度的可重復(fù)性，可用于大規(guī)模臨床樣品的檢測。

控制凈化小反芻獸疫是當(dāng)前我國所面臨的一個(gè)重要問題。本研究中自主研發(fā)的試劑盒使用具有臨床診斷意義的N 蛋白單克隆抗體[6]，僅能與PRRV主要特異抗原反應(yīng)。與進(jìn)口試劑盒（ID VET試劑盒）檢測比較，結(jié)果顯示YN PPRV C-ELISA試劑盒在動(dòng)物疫病群體檢測中可用于動(dòng)物小反芻獸疫的監(jiān)測，而且其成本低廉，操作簡便，對實(shí)驗(yàn)條件要求不高，不需要無菌條件，自動(dòng)化程度相對較高，在大規(guī)模樣品檢測中具有很大優(yōu)勢 。