謝少利，劉家有，王碧娟，黃紅梅，李靜佳，趙小波，鄧世山，侯令密

（1.川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院 甲狀腺乳腺外科，四川 南充 637000；2.川北醫(yī)學(xué)院解剖教研室，四川 南充 637000；3.川北醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院 內(nèi)科，四川 南充 637000）

三陰性乳腺癌（TNBC）是乳腺癌分子分型中的一種特殊亞型，因其特殊的生物學(xué)特性，導(dǎo)致TNBC進展快、預(yù)后差成為其典型特點[1]。因為缺乏內(nèi)分泌治療和靶向治療的特異位點，到目前為止，對TNBC的治療陷入瓶頸，臨床上尚無有效的綜合治療手段。蛋白質(zhì)為生命功能的執(zhí)行者，在機體內(nèi)其產(chǎn)生與降解維持著動態(tài)平衡。泛素-蛋白酶體系統(tǒng)途徑（ubiquitin proteasome system，UPS）廣泛參與蛋白質(zhì)的降解，因為特異性的泛素蛋白連接酶E3，導(dǎo)致其降解蛋白質(zhì)具有高度選擇性[2]。泛素蛋白連接酶E3A（UBE3A）又稱E6-AP（E6 associated protein，E6-AP），屬于含有HECT結(jié)構(gòu)的E3泛素蛋白連接酶家族成員，研究證實，細胞內(nèi)大量的基因編碼的蛋白質(zhì)如P53、c-myc、P27等可通過UBE3A介導(dǎo)的泛素-蛋白酶體系統(tǒng)降解，從而促進腫瘤的發(fā)生發(fā)展[3]。筆者在前期實驗[4-5]發(fā)現(xiàn)，通過慢病毒介導(dǎo)敲低UBE3A后，乳腺癌細胞MDA-MB-231細胞的增殖能力降低、細胞的侵襲能力減低以及細胞周期發(fā)生明顯改變，提示UBE3A在乳腺癌細胞中扮演著重要角色，但其具體參與機制還不明確。本實驗對敲低UBE3A前后進行差異蛋白質(zhì)分析，以檢測UBE3A前后TNBC細胞株MDA-MB-231細胞蛋白水平的表達差異，探討UBE3A敲低后乳腺癌細胞生物學(xué)行為改變的可能機制。

1 材料與方法

1.1 實驗對象

人TNBC細胞株MDA-MB-231，購于中國科學(xué)院細胞總庫。將MDA-MB-231細胞分為UBE3A敲低組與對照組，分別轉(zhuǎn)染shRNA-UBE3A片段與對細胞無影響的shRNA片段。

1.2 主要實驗儀器

倒置顯微鏡、熒光顯微鏡等購于德國Leica；酶標(biāo)儀、SDS-PAGE電泳儀、轉(zhuǎn)膜儀、成像儀、PCR儀購于美國Bio-Rad；雙向電泳儀、掃描儀購于美國GE。

1.3 實驗主要試劑

RPMI-1640培養(yǎng)基、胎牛血清購于美國HyClone；目的片段、GV-115中國上海吉凱基因化學(xué)技術(shù)有限公司；脂質(zhì)體Lipo-2000、Trans IT購于美國Invitrogen；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、PCR引物購于物美國Thermo；2-D clean-up kit、2-D Quant Kit、Immobiline DryStrip Cover Fluid、IPG Buffer pH 3-10 NL購于美國Pharmacia。

1.4 實驗方法

1.4.1 細胞培養(yǎng)及慢病毒感染常規(guī)方法培養(yǎng)MDA-MB-231以及用于包裝慢病毒的239T細胞；按上海吉凱基因提供的慢病毒包裝步驟包裝慢病毒載體并將其定量；待目的細胞融合度達到約30%～40%時，加入適宜量慢病毒，12 h后更換培養(yǎng)基；感染72 h后熒光顯微鏡下觀察GFP的表達情況，熒光率大于90%者，可用于后續(xù)實驗。

1.4.2 提取各組細胞總蛋白質(zhì)及蛋白純化及定量取生長狀態(tài)良好的細胞，按蛋白提取試劑盒步驟常規(guī)提取各組細胞總蛋白；按GE提供的操作步驟進行純化及定量細胞總蛋白，確定后續(xù)實驗的準(zhǔn)確性。

1.4.3 雙向電泳（two-dimensional electrophoresis，2-DE）第一向等點聚焦IEF：室溫平衡18 cm IPG預(yù)制干膠條至少15 min；取蛋白質(zhì)樣品340 μL（約2.0 mg）進行上樣；將IPG干膠條膠面朝下置于水化盤中蛋白樣品溶液上；緩慢加入2 mL礦物油覆蓋IPG干膠條；按表1步設(shè)置等電聚焦程序進行IEF等點聚焦；結(jié)束后去除礦物油，取出膠條，加適當(dāng)體積的SDS-DTT平衡緩沖液進行搖動平衡15 min；取出后再加入適當(dāng)體積的SDS-碘乙酰胺平衡緩沖液再次搖動平衡15 min。第二向SDS-PAGE電泳：配制12%的丙烯酰胺凝膠后常規(guī)灌膠；取平衡后的膠條，使之與聚丙烯酰胺凝膠膠面完全接觸，凝膠的上方加入低熔點瓊脂糖封膠液，放置5 min使其凝固；在電泳槽加入電泳緩沖液后，起始時用的低電電壓，觀察溴酚藍指示劑，待指示劑在完全走出IPG膠條后，并濃縮成一條線后，再加大電壓，待溴酚藍指示劑達到底部邊緣時，停止電泳。

表118 cm IPG膠條IEF程序設(shè)定Table 1 Protocol for IEF of 18 cm strip

1.4.4 差異蛋白質(zhì)點選取電泳結(jié)束后取出凝膠，將膠放入考馬斯亮藍染色液中染色3 h；反復(fù)更換脫色液直至蛋白點明顯、背景清楚；置于掃描儀上掃描凝膠；利用PDQuest7.1軟件選取差異大于1倍以上的蛋白質(zhì)點。

1.4.5 差異蛋白質(zhì)點的串聯(lián)質(zhì)譜檢測取切取的差異蛋白質(zhì)點，-20℃冷凍保存，交由生工生物工程（上海）股份有限公司進行基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜（MALDI-TOF-TOF-MS/MS）檢測差異蛋白質(zhì)。

1.4.6 差異蛋白點的生物信息學(xué)分析進入DAVID及Sting網(wǎng)址，對差異蛋白質(zhì)進行GO分類，得到生物過程（biological process，BP）、分子功能（molecular function，MF）和細胞組分（cellular component，CC）各層面的相關(guān)生物學(xué)信息。

2 結(jié) 果

2.1 雙向電泳結(jié)果及差異蛋白質(zhì)點生物信息分析

敲低UBE3A前后進行2-DE尋找差異蛋白質(zhì)點，運用PD Quest 7.1軟件進行分析，選出28個差異蛋白質(zhì)點（圖1）。選取28差異蛋白質(zhì)點進行質(zhì)譜分析，鑒定出差異表達蛋白質(zhì)共28個，排除重復(fù)的后有24個蛋白質(zhì)（表2）。本實驗最終得到28個差異蛋白質(zhì)點，其中有實驗組有4個蛋白質(zhì)相對陰性對照組高表達，有24個相對低表達。將其Map到DAVID數(shù)據(jù)庫中與Homo Species匹配的記錄有23個。對已識別的23個差異蛋白開展了進一步的分析。能夠進行生物學(xué)途徑、細胞成分、分子功能注釋分類的蛋白質(zhì)分別為23個（100%）、20個（87%）和23個（100%）。差異性蛋白質(zhì)在DAVID數(shù)據(jù)庫中按照GO的5個層次進行分析，每一層次有部分交叉，且部分概念分類內(nèi)也有交叉。所以各分類的百分比之和可能超過100%。差異性蛋白質(zhì)在KEGG數(shù)據(jù)庫的代謝和信號傳導(dǎo)通路涉及蛋白酶體、糖代謝等見表3。

2.2 String Tool分析差異蛋白質(zhì)之間相互關(guān)系

本實驗中運用StringTool對鑒定的差異蛋白質(zhì)進行相互作用預(yù)測，發(fā)現(xiàn)這些差異蛋白質(zhì)中有23個蛋白質(zhì)有著直接或者間接的聯(lián)系（圖2）。線越粗代表相互聯(lián)系越強。

圖12-DE圖片 A：對照組；B：UBE3A敲低組Figure 1 2-DE pictures A:Control group;B:UBE3A knock-down group

表2 差異蛋白質(zhì)點信息Table 2 Information of the spots of differentially expressed proteins

表3 差異性蛋白質(zhì)在KEGG數(shù)據(jù)庫的代謝和信號傳導(dǎo)通路Table 3 The metabolism and transduction pathways of the differentially expressed proteins in KEGG database

圖2 差異蛋白質(zhì)相互關(guān)系Figure 2 Interactions of the differentially expressed proteins

3 討 論

蛋白質(zhì)是生命功能的執(zhí)行者，機體蛋白質(zhì)的產(chǎn)生與降解維持著動態(tài)平衡。其產(chǎn)生受基因調(diào)控，其降解主要通過兩種途徑，即溶酶體途徑和UPS，后者具有高度選擇性[2]。UPS由泛素（UB）、泛素活化酶E1、泛素結(jié)合酶E2、泛素蛋白連接酶E3、泛素延長酶E4、去泛素化酶DUB（DUB）和26S的蛋白酶體組成，在UPS中由于E3酶獨特的結(jié)構(gòu)和功能域，決定了其介導(dǎo)的靶蛋白降解反應(yīng)的高度選擇性與特異性[2]。UBE3A屬于含有HECT結(jié)構(gòu)的E3泛素蛋白連接酶家族成員。目前的研究表明，UBE3A蛋白定位在細胞核中，作為甾醇類激素受體的共激活因子調(diào)節(jié)下游基因的轉(zhuǎn)錄參與天使綜合征（angelic syndrome，AS）[6-7]，研究證實，細胞內(nèi)大量的基因編碼的蛋白質(zhì)如P53、c-myc、P27等可通過UBE3A介導(dǎo)的泛素-蛋白酶體系統(tǒng)降解，從而促進腫瘤的發(fā)生發(fā)展[3]。蛋白質(zhì)組學(xué)（proteomics）即是研究細胞、組織乃至生物體蛋白質(zhì)組及蛋白質(zhì)變化規(guī)律的學(xué)科，目前蛋白質(zhì)組學(xué)研究首選的蛋白質(zhì)分離技術(shù)仍是2-DE技術(shù)[8-9]。本次實驗將2-DE的差異蛋白點進行串聯(lián)質(zhì)譜分析，能得到具體的蛋白質(zhì)信息，將差異蛋白信息在DAVID以及String Tool在線數(shù)據(jù)庫進行生物信息學(xué)分析，以探討敲低UBE3A后乳腺癌細胞發(fā)生生物學(xué)行為改變的機制[10]，為后續(xù)的研究提供思路。

本實驗中2-DE凝膠圖譜選取差異表達蛋白質(zhì)共28個，有4個蛋白質(zhì)在UBE3A敲低組相對對照組高表達，24個相對低表達。鑒定結(jié)果中有4個相同的蛋白質(zhì)。根據(jù)在2-DE凝膠圖譜及鑒定結(jié)果顯示位于不同的位置的部分蛋白質(zhì)，但是質(zhì)譜鑒定結(jié)果為同一種蛋白質(zhì)，這可能是因為這些蛋白存在多種不同的翻譯后修飾形式，也有可能是部分多亞基蛋白被解離成單個亞基，或者部分蛋白質(zhì)發(fā)生了共價鍵的解離，能夠改變蛋白的等電點及相對分子量，所以在雙向電泳圖譜上同一種蛋白質(zhì)可能位于不同的位置。

將這24個差異蛋白質(zhì)Map到DAVID數(shù)據(jù)庫中與Homo Species匹配的記錄有23個，剩余的1個可能因為還沒有完整的基因及蛋白功能注釋信息，因而不能識別。對已識別的23個差異蛋白開展了進一步的蛋白質(zhì)的GO分析。能夠進行生物學(xué)途徑BP、細胞成分CC、分子功能MF注釋分類的蛋白質(zhì)分別為23個（100%）、20個（87.7%）和23個（100%）。因這些差異性蛋白質(zhì)在DAVID數(shù)據(jù)庫中按照GO的5個層次進行分析，每一層次有部分交叉，且部分概念分類內(nèi)也有交叉，所以各分類的百分比之和會超過100%。同時在KEGG分析中顯示，在這些差異蛋白質(zhì)中，PGK1、2集中參與了糖的有氧酵解和糖異生；蛋白酶體α亞基2、5及蛋白酶體β亞基4參與組成蛋白酶體，行使蛋白質(zhì)的降解功能。

現(xiàn)今，在世界范圍內(nèi)腫瘤與糖尿病是兩大主要的慢性疾病[11]，目前大部分研究表明糖代謝紊亂與惡性腫瘤息息相關(guān)[12-13]。大量的研究表明血糖的高水平或糖尿病能增加患乳腺癌的風(fēng)險且增加乳腺癌患者的病死率[12,14-16]。PGK1是糖酵解過程中的關(guān)鍵酶之一，能夠?qū)⒁粋€磷酸轉(zhuǎn)移到ADP上形成ATP[17]，此外，其還參與了多種生物學(xué)功能如腫瘤的血管生成[18]、DNA的復(fù)制與修復(fù)[19]。目前的研究表明PGK1與多種腫瘤相關(guān)如肝癌[19]、結(jié)腸癌[20]、胃癌[21]等。Sun等[22]最近的研究發(fā)現(xiàn)PGK1參與乳腺癌治療過程中耐紫杉醇，降低了乳腺癌的治療效果。在本實驗中也發(fā)現(xiàn)敲低UBE3A后PGK1表達減少，乳腺癌細胞浸潤與轉(zhuǎn)移能力也降低，所以猜想PGK1參與的糖酵解途徑發(fā)生的改變促使了UBE3A敲低后乳腺癌細胞的浸潤與轉(zhuǎn)移能力減弱。

降解蛋白質(zhì)的UPS是一個依賴ATP高度有序的級聯(lián)酶促反應(yīng)過程。在一系列酶的作用下將泛素標(biāo)記的靶蛋白運送到26S的蛋白酶酶體上進行降解反應(yīng)[23]。其中26S的蛋白酶體是一個由20S核心蛋白顆粒和2個19S調(diào)節(jié)顆粒構(gòu)成的多亞基蛋白酶復(fù)合體。20S的核心是由7個相同的α亞基和7個相同的β亞基對稱排列構(gòu)成的2個環(huán)形的桶狀結(jié)構(gòu)組成，外部的α環(huán)圍繞著內(nèi)部的β環(huán)，每個環(huán)各有7個相同的亞基，即為α1～α7和β1～β7[24]。Kondakova等[25]研究在人類多種腫瘤中26S蛋白酶體功能時發(fā)現(xiàn)，蛋白酶體的降解功能與各亞基的含量不同有很大的關(guān)系。UBE3A作為UPS系統(tǒng)中關(guān)鍵酶之一，在本研究中發(fā)現(xiàn)，通過敲低UBE3A前后，參與組成蛋白酶體的α2、β4、α5亞基含量發(fā)生改變，其降解蛋白的功能也發(fā)生了改變，部分具有重要功能的蛋白質(zhì)降解發(fā)生改變。因此，筆者認為在敲低UBE3A后乳腺癌的浸潤與增值能力降低可能就是蛋白酶體功能發(fā)生改變的結(jié)果。

為了解敲低UBE3A前后差異蛋白質(zhì)之間相互作用關(guān)系，本研究利用String Tool蛋白相互作用數(shù)據(jù)庫對這些差異蛋白質(zhì)間的相互作用進行預(yù)測和分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)這些差異蛋白質(zhì)中，有23種蛋白質(zhì)在蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)圖上同時出現(xiàn)，說明這些蛋白質(zhì)存在直接或間接的關(guān)系，線條越粗，關(guān)系越密切。可以推測這些差異蛋白質(zhì)之間存在著某些功能聯(lián)系，且這些功能聯(lián)系與敲低UBE3A后乳腺癌細胞的增殖與浸潤能力有關(guān)。其中HSPA8、PSM、HYOU1、HNRNPA2B1、HMGB1、Annexin A2、HDGF、NME1關(guān)系較為緊密。這些蛋白質(zhì)均與腫瘤的浸潤與轉(zhuǎn)移相關(guān)，這給予了很好的啟發(fā)，可選取這幾個蛋白用于乳腺癌的研究及下一步功能驗證。當(dāng)然本實驗還有些許不足，這些差異蛋白質(zhì)與UBE3A之間到底是什么關(guān)系，他們之間通過什么途徑相互作用還有待進一步的研究。這也為后續(xù)研究提供方向。

敲低UBE3A后，TNBC細胞株MDA-MB-231在泛素-蛋白酶體系統(tǒng)功能與糖代謝功能方面發(fā)生變化，這可能是敲低UBE3A后乳腺癌細胞生物學(xué)行為改變的原因。當(dāng)然這些差異蛋白質(zhì)與UBE3A之間到底是什么關(guān)系，他們之間通過什么途徑相互作用還有待進一步的研究。