宋洋, 楊艷, 任芳

(中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院， 遼寧 沈陽 110000)

卵巢癌是女性癌癥死亡的第5大原因，也是世界上致死率最高的婦科腫瘤[1]。因卵巢癌發(fā)病較為隱匿，就診時有超過60%的患者已發(fā)展到晚期。盡管對卵巢癌用腫瘤切除手術(shù)配合鉑類或紫杉烷類化療藥物進(jìn)行積極治療，但其5年生存率仍然只有40%[2]。人類基因組序列數(shù)據(jù)顯示，只有2%的基因編碼了蛋白質(zhì)，因此大多數(shù)轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物都被認(rèn)為是非編碼RNA(non-coding RNA，ncRNA)，其中長度>200個堿基的ncRNA被稱為長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA，lncRNA)[3]。lncRNA已被證明與多種人類疾病以及腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，這其中也包括卵巢癌[4]。研究發(fā)現(xiàn)lncRNASNHG1能夠促進(jìn)肺癌[5]、肝癌[6]以及胃癌[7]等的惡性發(fā)展，但對卵巢癌的作用還未見報道。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1臨床樣本 收集2014年5月～2018年10月進(jìn)行手術(shù)的上皮性卵巢癌以及癌旁組織22對(患者在手術(shù)前未經(jīng)放化療治療)。組織標(biāo)本取材后迅速置于-80 ℃超低溫冰箱中保存。

1.1.2細(xì)胞株 人卵巢癌細(xì)胞SK-OV-3、OV-90、TOV-112D、HO-8910購自上海中喬新舟生物科技有限公司，CAOV3購自武漢普諾賽生命科技有限公司。SK-OV-3細(xì)胞和HO-8910細(xì)胞培養(yǎng)于含有雙抗以及15%胎牛血清的PRMI-1640培養(yǎng)液中，其余細(xì)胞均培養(yǎng)于42.5% MCDB105(含1.5 g/L碳酸氫鈉)及42.5% M199(含2.2 g/L碳酸氫鈉)培養(yǎng)液中，同時加入15%胎牛血清以及1%的雙抗。細(xì)胞置于含有5% CO2的37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，常規(guī)消化傳代，選用對數(shù)生長期的細(xì)胞進(jìn)行實驗。

1.1.3主要試劑 細(xì)胞培養(yǎng)液以及胎牛血清均購自Gibco，NC siRNA、lncRNASNHG1 siRNA及NC mimic和miR-199a-3p mimic委托上海吉瑪基因合成，Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑購自Invitrogen公司，TRLzol試劑以及TIANSeq M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶購自百泰克生物技術(shù)有限公司，SYBR Green qPCR Mix購自TOYOBO公司，CCK-8檢測試劑購自日本同仁公司，pMIR-reporter熒光素酶載體購自美國Ambion公司，雙熒光素酶檢測試劑盒購自Promega公司。

1.2 方法

1.2.1Real-time PCR 采用TRLzol試劑提取總RNA并通過TIANSeq M-MLV反轉(zhuǎn)錄成cDNA，實驗過程均嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行操作。采用SYBR Green qPCR Mix進(jìn)行Real-time PCR反應(yīng)，反應(yīng)條件為95 ℃ 10 min，95 ℃ 10 s、60 ℃ 30 s、72℃ 10 s，35個循環(huán)后檢測其溶解曲線并分析樣本Ct值。以GAPDH為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法計算mRNA的相對表達(dá)量。SNHG1的正向引物為5′-AGGCTGAAGTTACAGGTC-3′，反向引物為5′-TTGGCTCCCAGTGTCTTA-3′；GAPDH正向引物為5′-GTCAACGGATTTGGTCTGTATT-3′，反向引物為5′-AGTCTTCTGGGTGGCAGTGAT-3′。

1.2.2細(xì)胞轉(zhuǎn)染 將對數(shù)生長期的細(xì)胞接種于6孔板中，待細(xì)胞增長到70%融合時采用Lipofectamine 2 000轉(zhuǎn)染試劑進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染，按照試劑盒說明書操作。實驗設(shè)置對照組、NC siRNA轉(zhuǎn)染組和SNHG1 siRNA轉(zhuǎn)染組。SNHG1 siRNA的序列為5′-CAGCAGTTGAGGGTTTGCTGTGTAT-3′，將此序列打亂后經(jīng)分析不干擾任何基因表達(dá)的序列作為NC siRNA序列。

1.2.3CCK-8實驗 按照1.0×103個細(xì)胞每孔的密度將細(xì)胞接種至96孔板。分別于細(xì)胞轉(zhuǎn)染后的0、24、48、72及96 h時加入10 μL的CCK-8試劑，2 h后于酶標(biāo)儀上測量OD450值。

1.2.4雙熒光素酶檢測 分別將含有SNHG1野生型序列(5′-TGACCACTTTCGTAAACTACTGA-3′)的質(zhì)粒WT-SNHG1和突變型序列(5′-TGACCACTTTCGTAACGATGACA-3′)的質(zhì)粒MUT-SNHG1與miR-199a-3p mimic或NC mimic共轉(zhuǎn)染至293T細(xì)胞內(nèi)，24 h后采用雙熒光素酶檢測試劑檢測各組的熒光強度。以熒光素酶pGL-3.0為內(nèi)參，分析各組的熒光素酶的活性。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

采用GraphPad Prism 7.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。用t檢驗進(jìn)行兩組間的差異比較、單因素方差分析進(jìn)行3組間的差異比較，P<0.05被認(rèn)為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 LncRNA SNHG1在卵巢癌、癌旁組織以及卵巢癌細(xì)胞株中的表達(dá)

Real-time PCR結(jié)果表明(圖1)，卵巢癌組織lncRNASNHG1表達(dá)水平高于癌旁組織[(0.038±0.057)vs (0.010±0.007)]，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。卵巢癌細(xì)胞株CaOV3和OV-90中l(wèi)ncRNASNHG1的表達(dá)水平最高(圖1)，因此選擇這兩株細(xì)胞用于后續(xù)研究。

2.2 siRNA下調(diào)癌細(xì)胞株的lncRNA SNHG1表達(dá)

如圖2所示，OV-90細(xì)胞中SNHG1 siRNA組與NC siRNA組比較，lncRNASNHG1的表達(dá)水平分別為(0.37±0.06)和(0.99±0.10)，兩組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；CaOV3細(xì)胞中SNHG1 siRNA組和NC siRNA組lncRNASNHG1的表達(dá)水平分別為(0.19±0.09)和(0.96±0.09)，兩組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)果表明SNHG1 siRNA有效下調(diào)了兩株細(xì)胞中l(wèi)ncRNASNHG1的表達(dá)，而轉(zhuǎn)染NC siRNA未影響lncRNASNHG1的表達(dá)。

(1)與癌組織比較，P<0.05圖1 卵巢癌組織、癌旁組織及癌細(xì)胞株中l(wèi)ncRNA SNHG1的表達(dá)Fig.1 Expression of lncRNA SNHG1 in ovarian cancer tissue, the adjancet tissues and cancer cell strains

注：A為OV-90，B為CaOV3；(1)與NC siRNA組比較，P<0.05圖2 轉(zhuǎn)染siRNA后OV-90及CaOV3卵巢癌細(xì)胞株中l(wèi)ncRNA SNHG1的表達(dá)Fig.2 Expression of lncRNA SNHG1 after transfection with siRNA

2.3 下調(diào)lncRNA SNHG1對卵巢癌細(xì)胞增殖的影響

如圖3所示，與NC siRNA轉(zhuǎn)染組比較，轉(zhuǎn)染SNHG1 siRNA 48 h時，OV-90細(xì)胞的增殖能力顯著降低(P<0.05)，而CaOV3細(xì)胞在SNHG1 siRNA轉(zhuǎn)染24 h后細(xì)胞增殖能力顯著降低(P<0.05)。此結(jié)果表明下調(diào)lncRNASNHG1能夠抑制卵巢癌細(xì)胞的增殖。

(1)與NC siRNA組比較， P<0.05圖3 下調(diào)lncRNA SNHG1對細(xì)胞增殖的影響Fig.3 Effects of down-regulation of lncRNA SNHG1 on cell proliferation

2.4 lncRNA SNHG1對miR-199a-3p的調(diào)控作用

雙熒光素酶結(jié)果顯示，野生型SNHG1與miR-199a-3p mimic共轉(zhuǎn)染能夠顯著降低雙熒光素酶的活性，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。而將SNHG1與miR-199a-3p的結(jié)合序列突變的突變型SNHG1與miR-199a-3p mimic共轉(zhuǎn)染則不影響雙熒光素酶的活性，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見圖4。此結(jié)果表明lncRNASNHG1能夠通過miR-199a-3p特異性結(jié)合序列吸附miR-199a-3p、進(jìn)而調(diào)控其表達(dá)。

(1)與MUT-SNHG1+miR-199a-3p mimic組比較， P<0.05圖4 lncRNA SNHG1對miR-199a-3p的調(diào)控作用Fig.4 Regulatory effects of lncRNA SNHG1 on miR-199a-3p

3 討論

現(xiàn)已證明許多l(xiāng)ncRNA在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮了重要作用，lncRNA表達(dá)的異常也已被作為多種腫瘤的預(yù)后標(biāo)志物，如lncRNAAFAP1-AS1[8]、lncRNAUCA1[9]等。lncRNASNHG1位于11號染色體，在多種腫瘤組織中異常高表達(dá)并且能夠促進(jìn)肺癌[5]、肝癌[6]、胃癌[7]、食管癌[10]以及前列腺癌[11]細(xì)胞的增殖，并且與這些腫瘤的不良預(yù)后密切相關(guān)。然而lncRNASNHG1在卵巢癌中的作用還未見報道。本研究分析了22對卵巢癌及癌旁組織，結(jié)果發(fā)現(xiàn)lncRNASNHG1在卵巢癌中的表達(dá)水平顯著高于癌旁組織，因此本研究推測lncRNASNHG1在卵巢癌的發(fā)展中也發(fā)揮了重要作用。

眾所周知，異常增殖是腫瘤細(xì)胞的標(biāo)志之一，抑制腫瘤細(xì)胞的增殖是抗腫瘤研究的關(guān)鍵所在[12-14]。前人研究發(fā)現(xiàn)下調(diào)lncRNASNHG1能夠抑制胃癌細(xì)胞的增殖、克隆形成以及細(xì)胞周期轉(zhuǎn)換[7]。在肺癌細(xì)胞中下調(diào)lncRNASNHG1不僅能夠抑制肺癌細(xì)胞的增殖還能夠誘導(dǎo)其凋亡[5]。類似的作用在其他腫瘤細(xì)胞中也多次被證明[15-17]。本研究在已明確lncRNASNHG1在卵巢癌組織中高表達(dá)的情況下，在兩株lncRNASNHG1表達(dá)最高的卵巢癌細(xì)胞中下調(diào)了lncRNASNHG1的水平，Real-time PCR結(jié)果顯示干擾效率均在60%以上，可以進(jìn)行后續(xù)研究。本研究的CCK-8結(jié)果顯示下調(diào)lncRNASNHG1后細(xì)胞的增殖能力顯著受到抑制，表明lncRNASNHG1參與了卵巢癌細(xì)胞的增殖，并且lncRNASNHG1具有作為抗卵巢癌治療靶點的潛力。越來越多的證據(jù)表明，lncRNA參與了許多重要的生物學(xué)過程，例如細(xì)胞信號調(diào)節(jié)、基因印跡、染色質(zhì)修飾、轉(zhuǎn)錄激活、轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)以及蛋白功能調(diào)控等[18]。自2011年Salmena等[19]提出競爭性內(nèi)源RNA(competing endogenous RNA，ceRNA)的假說后，人們對lncRNA作用機制又有了新的認(rèn)識。ceRNA假說中指出lncRNA可以通過miRNA反應(yīng)元件(microRNA response elements，MRE)結(jié)合miRNA，發(fā)揮類似海綿的作用吸附miRNA進(jìn)而調(diào)控miRNA的表達(dá)。這種作用機制已經(jīng)在多種腫瘤細(xì)胞中被反復(fù)證明[20-22]。本研究通過生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)lncRNASNHG1上包含有miR-199a-3p的MRE，而雙熒光素酶檢測發(fā)現(xiàn)，野生型SNHG1和miR-199a-3p mimic共轉(zhuǎn)染工具細(xì)胞293T確實能夠顯著降低熒光素酶的活性，而突變型SNHG1載體與miR-199a-3p mimic共轉(zhuǎn)染則對熒光素酶的活性沒有影響，因此，lncRNASNHG1確實能夠通過MRE結(jié)合miR-199a-3p。Yasuto等[23]通過miRNA芯片分析發(fā)現(xiàn)miR-199a-3p在卵巢癌細(xì)胞中表達(dá)顯著降低。在卵巢癌細(xì)胞中過表達(dá)miR-199a-3p能夠抑制卵巢癌細(xì)胞的增殖、侵襲、黏附，抑制卵巢癌細(xì)胞異種移植瘤的體內(nèi)生長并且阻礙促腫瘤信號通路c-Met、ERK以及AKT的激活[23]。因此本研究推測下調(diào)lncRNASNHG1可能通過釋放miR-199a-3p而發(fā)揮了抑制卵巢癌細(xì)胞增殖的作用。

綜上，本研究結(jié)果表明lncRNASNHG1與卵巢癌的進(jìn)展密切相關(guān)，可作為卵巢癌預(yù)后的指示分子。此外，下調(diào)lncRNASNHG1能夠抑制卵巢癌細(xì)胞的增殖，因此，lncRNASNHG1有望成為治療和預(yù)防卵巢癌的潛在靶點。