劉春靜 陳雋 李麗萍 陸相輝

(齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院附屬第三醫(yī)院，黑龍江 齊齊哈爾 161000)

宮頸癌是中老年女性常見(jiàn)惡性腫瘤之一，且中老年宮頸癌患者并發(fā)癥較多，預(yù)后差，針對(duì)中老年宮頸癌患者探尋新的治療方法有重要意義〔1〕。人受體酪氨酸激酶樣單受體(ROR)2已經(jīng)證實(shí)在多種腫瘤中過(guò)表達(dá)，并且與患者預(yù)后密切相關(guān)〔2，3〕。本研究旨在進(jìn)一步探索ROR2在中老年宮頸癌患者中的表達(dá)及其生物學(xué)功能和相關(guān)分子機(jī)制。

1 資料與方法

1.1一般資料 選擇齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院附屬第三醫(yī)院2012年4月至2016年9月收治的中老年宮頸癌患者80例，收集腫瘤切除后的癌組織和癌旁組織(癌周2 cm)。納入標(biāo)準(zhǔn)：年齡≥50歲；腫瘤原發(fā)于宮頸；均經(jīng)活組織檢查或手術(shù)，有明確病理學(xué)診斷，符合國(guó)際婦產(chǎn)科聯(lián)盟(FIGO)分期；所有患者術(shù)前無(wú)輸血史，未進(jìn)行過(guò)放化療。排除標(biāo)準(zhǔn)：合并其他惡性腫瘤，合并嚴(yán)重心肝腎等重要臟器功能障礙患者；合并其他較為嚴(yán)重的婦科疾病者；認(rèn)知障礙及精神病患者；無(wú)完整的臨床及隨訪資料患者?；颊咂骄挲g(70.3±5.71)歲；腫瘤病理類型：鱗癌(60例)，腺癌(20例)；腫瘤大?。?4 cm(29例)，≥4 cm(51例)；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移：無(wú)(36例)，有(44例)；絕經(jīng)后激素調(diào)節(jié)：無(wú)(34例)，有(46例)；FIGO分期：Ⅰ期(48例)，二期(32例)；病程：3～15個(gè)月。研究獲得病人及家屬的同意并遵循醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)的規(guī)定。

1.2主要試劑和儀器 ROR2(貨號(hào)：ab190145)，增殖細(xì)胞核抗原(PCNA，貨號(hào)：ab152112)，甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)抗體均購(gòu)于美國(guó)abcam公司，二抗購(gòu)于美國(guó)CST公司。轉(zhuǎn)染用lipo2000試劑購(gòu)自Invitrogen。CCK-8試劑盒購(gòu)于碧云天生物公司。其他試驗(yàn)材料由本實(shí)驗(yàn)室提供。Western印跡和凝膠成像系統(tǒng)購(gòu)買于北京六一生物公司，酶標(biāo)儀購(gòu)于芬蘭雷勃公司。ROR2的小干擾(si)RNA和對(duì)照RNA由上海吉瑪制藥公司合成，序列如下ROR2 siRNA1：5′-GUCAUCGCUUGCCUGUUC-3′；ROR2 siRNA2：5′-ACCAACCCUUGAGCAUGA-3；Control siRNA：5′-AATTCTCCGAACGTGTCACGT-3′。

1.3實(shí)時(shí)定量PCR 應(yīng)用高純總RNA 快速提取試劑盒提取癌組織和癌旁組織中的總RNA，將提取的RNA樣本進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄獲得對(duì)應(yīng)的cDNA。然后進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量分析，所用引物序列如下：ROR2正義鏈5′-CCACTGGGGTTCTATATGTGCG-3′，反義鏈5′-AAATAGTCCGGTTCCCAATGAAG-3′；GAPFH正義鏈5′-ACCCCAGCAAGGACACTGAGCAAG-3′；反義鏈5′-GGCCCCTCCTGTTATTATGGGGGT-3′。反應(yīng)體系總體積20 μl，包含1 μl cDNA模版，各0.5 μl 的上下游引物，10 μl SYBR GREEN master mix，其余用雙蒸水補(bǔ)齊。反應(yīng)條件：95℃ 10 s；40個(gè)循環(huán)：95℃ 10 s，60℃ 20 s，72℃ 30 s；4℃ 5 min。ROR2的相對(duì)表達(dá)計(jì)算通過(guò)2-△△CT方法。

1.4免疫組化 切片常規(guī)脫蠟(依次將載玻片放入二甲苯-二甲苯-100%酒精-100%酒精-95%酒精-90%酒精-80%酒精-70%酒精中)，脫蠟后加入3%過(guò)氧化氫(H2O2)浸泡10 min后磷酸鹽緩沖液(PBS)浸泡5 min/次，3次。加入檸檬酸緩沖液，放入微波爐中，中火蒸煮 5 min，冷卻至室溫，反復(fù)蒸煮3次。冷卻，倒掉檸檬酸溶液，PBS洗3次，每次5 min。擦干組織周圍的 PBS 液，加山羊血清工作液放置37℃孵箱溫育30 min后傾去。小心擦干載玻片上組織周圍的血清，滴加鼠抗人的ROR2一抗(1∶100)4℃孵育過(guò)夜。PBS沖洗3次，每次5 min，山羊抗鼠的二抗37℃孵育30 min。 PBS清洗后滴加辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記鏈霉卵白素工作液，室溫孵育15 min，PBS沖洗5 min，洗3次，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，脫水，透明，封片。

1.5結(jié)果判斷 染色強(qiáng)度判定：染色強(qiáng)度分為0，1，2，3分，依次為：無(wú)染色，弱染色，中等強(qiáng)度染色，強(qiáng)染色。陽(yáng)性細(xì)胞率判定：0為<5%；1為5%～24%；2為25%～49%；3為50%～74%；4為≥75%。計(jì)算染色強(qiáng)度和陽(yáng)性細(xì)胞率的總評(píng)分，0～2分判定ROR2表達(dá)為陰性，3～7分判定ROR2表達(dá)為陽(yáng)性。兩名高年資病理科醫(yī)生雙盲法讀片。

1.6細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染 人鱗狀子宮頸癌細(xì)胞(SiHa)購(gòu)自美國(guó)ATCC，在本實(shí)驗(yàn)室凍存和傳代。細(xì)胞系在含有10%血清的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)。培養(yǎng)基加入青霉素(100 U/ml)和鏈霉素(100 μg/ml)，細(xì)胞被放置在含5% CO2，37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。SiHa細(xì)胞復(fù)蘇培養(yǎng)傳代2次后，待細(xì)胞融合度達(dá)到 80%～90%時(shí)，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染。按照脂質(zhì)體(lipo 2000)轉(zhuǎn)染試劑操作說(shuō)明，轉(zhuǎn)染SiHa細(xì)胞。細(xì)胞分為4組：Mock組(不作任何處理)、siRNA 對(duì)照(siCtrl)組和 ROR2-siRNA1轉(zhuǎn)染(SiRNA1)組，ROR2-siRNA2轉(zhuǎn)染(siRNA2)組。

1.7細(xì)胞活力檢測(cè) 使用CCK-8試劑盒進(jìn)行細(xì)胞活力檢測(cè)。轉(zhuǎn)染后宮頸癌細(xì)胞消化計(jì)數(shù)以1 000個(gè)/100 μl每孔接種于96孔板內(nèi)，每組設(shè)置5個(gè)復(fù)孔。將細(xì)胞放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，分別在0 h，12 h，24 h，48 h，72 h取出待測(cè)96孔板加入CCK-8試劑，10 μl/孔，加入過(guò)程避免產(chǎn)生氣泡，37℃下孵育3 h，酶標(biāo)儀吸光度設(shè)置為450 nm，檢測(cè)各組細(xì)胞的OD值。

1.8Western印跡檢測(cè)分析 棄去細(xì)胞培養(yǎng)基，PBS清洗3遍，消化，終止離心收集細(xì)胞沉淀，放置冰上，加入適量裂解液裂解30 min，樣本在4℃，12 000 r/min條件下離心30 min。收集上清，用二喹啉甲酸(BCA)法進(jìn)行蛋白定量。等量的含結(jié)合緩沖液的蛋白樣品在金屬浴中100℃煮10 min。將冷卻的蛋白樣本在10%十二烷基硫酸鈉(SDS)-聚丙烯酰胺凝膠中電泳，轉(zhuǎn)膜，5%脫脂牛奶中封閉1 h，鼠抗人的ROR2(1∶1 000)、兔抗人的PCNA(1∶1 000)和GAPGH(1∶5 000)一抗孵育過(guò)夜，用PBS清洗聚偏氟乙烯(PVDF)膜3次，每次10 min，孵山羊抗鼠或兔的二抗(1∶5 000)室溫1 h，PBS洗膜，曝光，記錄結(jié)果并對(duì)蛋白進(jìn)行光密度分析。

1.9統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS18.0軟件進(jìn)行配對(duì)t檢驗(yàn)、χ2檢驗(yàn)、Pearson相關(guān)分析、方差分析。

2 結(jié) 果

2.1ROR2在宮頸癌組織中的表達(dá) 宮頸癌組織中ROR2表達(dá)顯著高于癌旁組織〔(0.955±0.019)vs (0.602±0.108),P<0.001〕。絕經(jīng)后激素調(diào)節(jié)、腫瘤大小為ROR2表達(dá)的顯著影響因素(P<0.01)；ROR2表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和FIGO分期無(wú)顯著相關(guān)性(P>0.05)，見(jiàn)表1。

表1 ROR2表達(dá)與臨床病理因子相關(guān)性(n)

2.2沉默ROR2對(duì)細(xì)胞增殖的影響 Mock組、Sictrl組、SiRNA1組、SiRNA2組ROR2蛋白表達(dá)分別為：35 117.3±120.55、24 736.9±111.58、6 495.6±33.99、9 743.0±52.39。在SiHa細(xì)胞中轉(zhuǎn)染兩對(duì)ROR2 siRNA后ROR2的表達(dá)明顯受到抑制(P<0.001)。見(jiàn)圖1。兩對(duì)ROR2 siRNA均明顯抑制了SiHa細(xì)胞的增殖能力(P<0.001)。見(jiàn)圖2。

圖1 Western印跡檢測(cè)各組ROR2蛋白表達(dá)

1)P<0.001圖2 SiHa細(xì)胞轉(zhuǎn)染ROR2 siRNA后對(duì)細(xì)胞增殖能力的影響

2.3沉默ROR2對(duì)增殖蛋白PCNA的影響 Mock組、Sictrl組、SiRNA1組、SiRNA2組PCNA蛋白表達(dá)分別為：0.987±0.116、1.089±0.185、0.279±0.117、0.107±0.095。兩對(duì)ROR2小干擾RNA均明顯的抑制了SiHa細(xì)胞中PCNA蛋白的表達(dá)(P<0.001)。見(jiàn)圖3。

圖3 Western印跡檢測(cè)各組PCNA蛋白表達(dá)

3 討 論

宮頸癌傳統(tǒng)的治療手段以手術(shù)治療和放化療為主，但其預(yù)后遠(yuǎn)未達(dá)到令人滿意的程度。隨著人類對(duì)生命科學(xué)的深入了解和科學(xué)技術(shù)的進(jìn)步，基因治療已經(jīng)成為宮頸癌治療的一種新模式，而篩選理想的靶基因是正在研究的熱點(diǎn)。

多種酪氨酸激酶已經(jīng)證實(shí)在細(xì)胞增殖、極化、遷移、代謝等生物過(guò)程發(fā)揮重要作用，而它們的異?；罨瘯?huì)導(dǎo)致細(xì)胞增殖調(diào)節(jié)發(fā)生紊亂，致使腫瘤發(fā)生。ROR2屬于受體酪氨酸激酶超家族，已經(jīng)證實(shí)在多種惡性腫瘤中表達(dá)明顯上調(diào)，并且ROR2的高表達(dá)與這些患者的預(yù)后差密切相關(guān)，例如結(jié)直腸癌〔4〕，非小細(xì)胞肺癌〔5〕，胰腺導(dǎo)管腺癌〔6〕，胃腸道基質(zhì)腫瘤〔7〕，骨肉瘤〔8〕，宮頸癌〔3〕。本研究結(jié)果表明ROR2在老年宮頸癌組織中高表達(dá)，與ROR2在宮頸癌中的表達(dá)結(jié)果報(bào)道一致〔3〕，且與分化程度和腫瘤大小明顯相關(guān)，提示ROR2在老年宮頸癌發(fā)生發(fā)展中可能扮演重要角色。

ROR2的生物學(xué)功能也在多種腫瘤中被廣泛研究〔2〕，例如：下調(diào)ROR2的表達(dá)后可以抑制卵巢癌細(xì)胞的侵襲和黏附〔9〕；相反，過(guò)表達(dá)ROR2可以促骨肉瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)〔10〕。然而，ROR2的表達(dá)是否會(huì)影響宮頸癌的生物進(jìn)程至今沒(méi)有報(bào)道。腫瘤的一大特點(diǎn)就是調(diào)控細(xì)胞生長(zhǎng)的基因異常表達(dá)，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞不可控制的生長(zhǎng)。為排除脫靶效應(yīng)，設(shè)計(jì)了兩對(duì)ROR2的siRNA，并通過(guò)Western印跡檢測(cè)兩對(duì)ROR2 siRNA的干擾效率，發(fā)現(xiàn)沉默ROR2后，宮頸癌細(xì)胞SiHa的增殖明顯受到了抑制，與ROR2在其他腫瘤細(xì)胞研究結(jié)果一致。PCNA是真核生物復(fù)制復(fù)合體的核心成分，已報(bào)道PCNA可以參與DNA損傷修復(fù)、細(xì)胞凋亡等許多重要的細(xì)胞事件，另外作為細(xì)胞增殖的指標(biāo)〔11〕。本研究發(fā)現(xiàn)ROR2被沉默后，PCNA的表達(dá)明顯被抑制，提示ROR2可能通過(guò)調(diào)控PCNA表達(dá)影響宮頸癌細(xì)胞增殖。