劉國(guó)良 林玲

(河南醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校，河南 鄭州 450003)

由于慢性飲酒而導(dǎo)致酒精成癮，對(duì)身體各項(xiàng)功能造成嚴(yán)重危害，對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)的損害尤為嚴(yán)重，表現(xiàn)為各種認(rèn)知功能障礙。研究表明〔1,2〕，酒精對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)損傷的機(jī)制之一是乙醇的代謝產(chǎn)物乙醛等具有脂溶性和水溶性雙向特征，可以通過(guò)血腦屏障，并對(duì)中樞神經(jīng)遞質(zhì)系統(tǒng)產(chǎn)生嚴(yán)重影響，最終導(dǎo)致機(jī)體出現(xiàn)多種神經(jīng)行為改變。文獻(xiàn)報(bào)道，急性、慢性酒精成癮都可造成大鼠學(xué)習(xí)記憶能力下降〔3,4〕，目前關(guān)于酒精成癮機(jī)制的研究很多，包括神經(jīng)遞質(zhì)、受體及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路等，但從突觸可塑性的角度進(jìn)行探討相對(duì)較少。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)建立慢性酒精依賴?yán)夏甏笫蠹敖鋽嗄Ｐ?，并觀察酒精依賴及戒斷后老年大鼠學(xué)習(xí)記憶能力的改變及海馬突觸可塑性、突觸可塑性蛋白(PSD-95)表達(dá)的變化，探討慢性酒精依賴影響老年大鼠學(xué)習(xí)記憶損傷的可能機(jī)制。

1 材料和方法

1.1藥品和試劑 無(wú)水乙醇(鄭州中博化工有限公司)；兔抗PSD-95多克?、窨?Abcam公司，USA)，細(xì)胞裂解液、異硫氰基熒光素(FITC)標(biāo)記的羊抗兔熒光Ⅱ抗、TritonX-100、牛血清白蛋白(BSA)等均購(gòu)于碧云天生物科技有限公司，其他試劑均采用國(guó)產(chǎn)分析純。Morris水迷宮(北京醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所研制)；BL-420s生物信號(hào)分析系統(tǒng)(成都泰盟科技有限公司)；熒光顯微鏡(OLYMPUS)，冰凍切片機(jī)(OLYMPUS)，大鼠腦立體定位儀(安徽正華生物儀器設(shè)備有限公司)。

1.2方法

1.2.1動(dòng)物及分組 36只老年雄性SD大鼠(18月齡)，SPF級(jí)，體重180～220 g，購(gòu)于湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，合格證號(hào)：SCXK(湘)2011-0003。動(dòng)物飼養(yǎng)環(huán)境：通風(fēng)，自然光照，常規(guī)攝食飲水，室溫(22±1)℃，適應(yīng)性飼養(yǎng)1 w后開(kāi)始實(shí)驗(yàn)。分為對(duì)照組、乙醇組和戒斷7 d組，每組12只。對(duì)照組大鼠正常飲水飼養(yǎng)，乙醇組大鼠參照Turchan等〔5〕的方法建立慢性酒精依賴大鼠模型：以6%(V/V)的酒精作為大鼠唯一飲水來(lái)源，持續(xù)30 d。戒斷7 d組大鼠同乙醇組飼養(yǎng)30 d后，恢復(fù)正常飲水7 d。每日觀察并記錄大鼠的飲水及進(jìn)食量，在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，大鼠飲水采用帶刻度的飲水瓶，日飲水量不足20 ml的大鼠予以剔除。為確保酒精濃度，每日8∶00更換由無(wú)水乙醇和雙蒸水配制的新鮮酒精溶液。 參照文獻(xiàn)〔6〕的方法，造模完成24 h后對(duì)乙醇組和戒斷7 d組大鼠進(jìn)行柳田知司評(píng)分，在造模過(guò)程所有大鼠無(wú)死亡。

1.2.2Morris水迷宮檢測(cè)各組大鼠學(xué)習(xí)記憶能力 為盡量減少酒精戒斷癥狀對(duì)大鼠學(xué)習(xí)記憶的干擾，乙醇組大鼠在造模最后4 d(造模第27～30天)、戒斷組大鼠在酒精戒斷7 d之后進(jìn)行Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)，訓(xùn)練共進(jìn)行4 d，每天2次，每次訓(xùn)練時(shí)間間隔15 min。

1.2.3電生理實(shí)驗(yàn) 水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)束后各組一半大鼠(6只)進(jìn)行電生理實(shí)驗(yàn)。

1.2.3.1動(dòng)物手術(shù) 10%(V/V)水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠(0.3～0.4 ml/100 g)，固定于立體定位儀上，暴露顱骨，參照大鼠腦解剖圖譜定位海馬CA1區(qū)(前囟向后7.5 mm，左旁4.2 mm，顱骨表面向下3.0 mm)，將記錄電極置入CA1區(qū)，參考電極E1(前囟向前2.0 mm，右旁2.0 mm，顱骨表面向下3.0 mm)植入額葉，兩者都以E2(前囟向前2.0 mm，左旁2.0 mm)為參考，牙托粉固定。術(shù)后肌注青霉素抗感染，充足食物和水分供應(yīng)。

1.2.3.2誘發(fā)電位的記錄 首先記錄單個(gè)刺激〔波寬0.1 ms，強(qiáng)度為引起最大群體電位(PS)的50%〕誘發(fā)的PS幅值。然后用100 Hz 5 s(波寬0.1 ms)的高頻刺激(HFS)誘導(dǎo)海馬長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)(LTP)。以6個(gè)時(shí)間點(diǎn)的PS幅值的平均值作為自身基礎(chǔ)幅值，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)的突觸傳遞水平以相對(duì)值(%)表示，相對(duì)值=(實(shí)測(cè)值-相對(duì)值)/相對(duì)值×100%。

1.2.4免疫熒光實(shí)驗(yàn)檢測(cè)海馬CA1區(qū)和前額葉皮層PSD-95蛋白表達(dá) 將各組剩下的6只大鼠灌注后取腦，置于4% 多聚甲醛溶液中過(guò)夜，經(jīng)30%蔗糖溶液脫水后，用恒溫(-20℃)冰凍切片機(jī)作冠狀切片，厚度30 μm，隔 4片取 1片腦片，切片經(jīng)0.3%TritonX-100通透2 h，0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液(PBS)漂洗5 min/次×3 次，10%BSA封閉1 h，0.01 mol/L PBS漂洗5 min/次×3次。滴加兔PSD-95多克隆抗體(1∶500)4℃ 條件下孵育過(guò)夜； 復(fù)溫后0.01 mol/L PBS漂洗5 min/次×3次。暗室加入FITC標(biāo)記的羊抗兔二抗(1∶1 000)室溫孵育2 h，0.01 mol/L PBS漂洗5 min/次×3 次，防淬滅的封片劑封片，熒光顯微鏡下觀察拍片，每張切片檢測(cè)海馬CA1區(qū)和前額葉皮層平均陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)(IPP6.0軟件分析)。

1.2.5數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析 應(yīng)用SPSS18.0軟件進(jìn)行單因素方差分析、q檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1柳田知司評(píng)分結(jié)果 乙醇組的戒斷癥狀評(píng)分〔(15.42±2.32)分〕顯著高于對(duì)照組〔(4.54±1.21)分，P<0.01〕；與乙醇組比較，戒斷7 d組戒斷癥狀評(píng)分顯著降低〔(6.06±1.31)分，P<0.01〕。

2.2各組逃避平臺(tái)潛伏期比較 第2～4天，乙醇組逃避潛伏期時(shí)間較對(duì)照組明顯延長(zhǎng)(均P<0.05)；戒斷7 d組逃避潛伏期時(shí)間較乙醇組明顯縮短(均P<0.05)，但顯著長(zhǎng)于對(duì)照組(均P<0.05)。見(jiàn)表1。

2.3各組LTP幅值增加相對(duì)值比較 與對(duì)照組相比，乙醇組LTP幅值增加相對(duì)值明顯降低(P<0.05)，戒斷7 d組LTP幅值增加相對(duì)值較乙醇組明顯升高(P<0.05)。見(jiàn)圖1。

表1 各組逃避平臺(tái)潛伏期時(shí)間比較

與對(duì)照組比較：1)P<0.05；與乙醇組比較：2)P<0.05；表2同

與對(duì)照組比較：1)P<0.05；與乙醇組比較：2)P<0.05圖1 各組HFS前后海馬CA1區(qū)誘發(fā)電位主波幅值的變化

2.4各組PSD-95蛋白表達(dá)比較 海馬CA1區(qū)和前額葉皮層神經(jīng)元胞質(zhì)內(nèi)可見(jiàn)FITC標(biāo)記的綠色熒光免疫反應(yīng)陽(yáng)性產(chǎn)物為PSD-95蛋白，對(duì)照組PSD-95陽(yáng)性細(xì)胞熒光染色強(qiáng)，而乙醇組PSD-95陽(yáng)性細(xì)胞熒光染色淺；與乙醇組比較，戒斷7 d組PSD-95陽(yáng)性細(xì)胞熒光染色強(qiáng)(圖2，圖3)。與對(duì)照組比較，乙醇組陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)明顯減少(P<0.05)，積分光密度顯著減弱(P<0.05)，與乙醇組比較，戒斷7 d組陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)明顯增加(P<0.05)，積分光密度明顯增強(qiáng)(P<0.05)。見(jiàn)表2。

圖2 各組海馬CA1區(qū)PSD-95蛋白表達(dá)(×400)

圖3 各組前額葉皮層PSD-95蛋白表達(dá)(×400)

表2 各組前額葉皮層和海馬CAI區(qū)PSD-95免疫反應(yīng)陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)、平均積分光密度比較

3 討 論

海馬和前額葉皮層都是神經(jīng)元突觸可塑性的重要區(qū)域，與學(xué)習(xí)記憶的形成密切相關(guān)。長(zhǎng)期飲酒可導(dǎo)致海馬神經(jīng)元的丟失，進(jìn)而導(dǎo)致學(xué)習(xí)記憶能力減退〔7～10〕。本實(shí)驗(yàn)用6%的酒精作為老年大鼠唯一的飲水來(lái)源連續(xù)飲用30 d來(lái)模擬慢性酒精依賴的大鼠模型，結(jié)果顯示，乙醇組大鼠在酒精戒斷24 h后出現(xiàn)明顯的戒斷癥狀：異常姿勢(shì)、高激惹性和體重減輕等，說(shuō)明實(shí)驗(yàn)造模成功。本實(shí)驗(yàn)Morris水迷宮結(jié)果說(shuō)明酒精依賴大鼠空間記憶能力明顯減退，實(shí)施酒精戒斷以后，老年大鼠的空間記憶能力得到一定的改善。

LTP是學(xué)習(xí)記憶的神經(jīng)基礎(chǔ)，也是突觸可塑性的重要表現(xiàn)〔11，12〕。在本實(shí)驗(yàn)中，強(qiáng)直性高頻刺激在3組動(dòng)物海馬CA1區(qū)均可誘導(dǎo)出穩(wěn)定的LTP樣電位變化，說(shuō)明3組動(dòng)物海馬神經(jīng)元均具有突觸可塑性，LTP幅值升高程度說(shuō)明酒精依賴對(duì)海馬神經(jīng)元的損傷，使其可塑性下降。

突觸后致密物PSD是位于突觸活性區(qū)突觸后膜與胞質(zhì)相連的一層致密物，是突觸可塑性的關(guān)鍵分子。研究表明，PSD-95能夠促進(jìn)突觸前膜突觸素的表達(dá)增加，增強(qiáng)AD大鼠的空間記憶能力〔13〕。尹美芳〔14〕研究表明，PSD-95參與了長(zhǎng)期飲酒導(dǎo)致海馬突觸可塑性及空間記憶能力的損傷。前額葉皮層在動(dòng)物空間記憶的行程中也具有非常重要的作用〔15〕。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明慢性酒精依賴可使學(xué)習(xí)記憶相關(guān)遞質(zhì)PSD-95的釋放減少，最終使老年大鼠的空間記憶能力減退。

本實(shí)驗(yàn)從行為學(xué)、在體電生理、免疫熒光等方法證實(shí)了老年慢性飲酒導(dǎo)致大鼠的空間記憶能力減退，其原因可能與慢性飲酒導(dǎo)致老年動(dòng)物海馬和前額葉皮層神經(jīng)元損傷、學(xué)習(xí)記憶相關(guān)遞質(zhì)的釋放減少、突觸可塑性下降有關(guān)，但其更深的作用機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。