張虎 杜欣娜 凌存寶 陳根林 孫海燕 劉爽 莊瑩

(1江蘇醫(yī)藥職業(yè)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)部，江蘇 鹽城 224005；2佳木斯大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院；3江蘇醫(yī)藥職業(yè)學(xué)院護理學(xué)院)

乳腺癌是全世界女性最常見的惡性腫瘤，近年來我國乳腺癌發(fā)病率呈明顯上升趨勢〔1〕。據(jù)統(tǒng)計，中國年乳腺癌發(fā)病數(shù)占世界總新發(fā)病數(shù)的12.2%，而每年因乳腺癌死亡的病例數(shù)占世界乳腺癌年死亡數(shù)的9.6%，且發(fā)病率和新發(fā)現(xiàn)病例數(shù)仍在增加〔2〕。乳腺癌發(fā)病機制仍未完全明確，篩選新的預(yù)后標志物意義重大。8號染色體開放閱讀窗(C8orf)33是一種蛋白質(zhì)編碼基因，位于人類8號染色體上，在肝臟、腎上腺、卵巢等人體組織均有表達〔3～5〕。C8orf33在乳腺癌發(fā)生與發(fā)展中的研究未見報道。本文利用多組學(xué)高通量數(shù)據(jù)分析C8orf33在乳腺癌中的表達及臨床意義。

1 材料和方法

1.1數(shù)據(jù)來源 通過癌癥基因組學(xué)分析網(wǎng)站cBioPortal〔6,7〕(http://www.cbioportal.org/)、癌癥芯片數(shù)據(jù)庫Oncomine〔8〕(https://www.oncomine.org/resource/main.html)、癌癥多組學(xué)分析數(shù)據(jù)平臺LinkedOmics〔9〕(http://www.linkedomics.org/admin.php)分析乳腺癌組織中C8orf33基因表達的變化及臨床相關(guān)性。

1.2數(shù)據(jù)分析方法 (1)登錄cBioPortal首頁，選擇實時更新的癌癥基因組圖譜(TCGA)浸潤性乳腺癌患者數(shù)據(jù)集，分析C8orf33基因突變、拷貝數(shù)變化、mRNA水平變化及C8orf33高表達與患者預(yù)后的關(guān)系。分析C8orf33 mRNA水平發(fā)生變化時，選擇RNA測序結(jié)果，分析結(jié)果并下載。(2)登錄Oncomine首頁，搜索框內(nèi)輸入“C8orf33”，差異表達中選擇“癌癥vs正常組織”，癌癥類型選擇“乳腺癌”，閾值設(shè)置為“0.05”，數(shù)據(jù)集選擇“Ductal Breast Carcinoma (47)”其他均為默認值。下載數(shù)據(jù)，GraphPad軟件作圖。(3)登錄LinkedOmics首頁，癌癥組選擇“TCGA_BRCA”，檢索數(shù)據(jù)集選擇“HiSeq RNA”，輸入目標基因“C8orf33”，目標數(shù)據(jù)集選擇“Clinical”，統(tǒng)計方法選擇“Non-parametric T test”，提交并在分析結(jié)果中選擇“P<0.05”的臨床相關(guān)指標并進行分析。

2 結(jié) 果

2.1乳腺癌中C8orf33基因的變化及與預(yù)后關(guān)系 38%乳腺癌患者中C8orf33基因發(fā)生改變，改變類型包括基因擴增(14.0%)、缺失(0.2%)、錯義突變(0.1%)、mRNA下調(diào)(1.3%)及mRNA上調(diào)(34%)；34%患者C8orf33 mRNA水平上調(diào)(閾值EXP≥2)，且C8orf33 高表達不利于乳腺癌預(yù)后(P<0.05)(圖1)；乳腺癌組織中C8orf33 mRNA水平較正常乳腺組織顯著上調(diào)(2.24±1.14 vs 0.95±0.41，P<0.01)。

1:未發(fā)生C8orf33 mRNA上調(diào)的病例；2：發(fā)生C8orf33mRNA上調(diào)的病例圖1 乳腺癌患者中C8orf33基因變化與預(yù)后的關(guān)系

2.2乳腺癌患者C8orf33基因表達變化與臨床指標相關(guān)性 乳腺癌患者C8orf33基因表達受到腫瘤純度影響(r=0.174,P<0.001)。見圖2。乳腺癌不同PAM50分子亞型、組織學(xué)分型、種族中C8orf33的表達差異顯著(P<0.01,P<0.001)。見表1。

圖2 乳腺癌患者C8orf33表達與腫瘤純度相關(guān)

表1 乳腺癌分子亞型、組織學(xué)分型和種族對C8orf33表達的影響

2.3C8orf33基因甲基化、mRNA拷貝數(shù)變化影響其表達 C8orf33拷貝數(shù)變化與其mRNA水平正相關(guān)(r=0.800，P<0.001)；C8orf33基因甲基化水平與其表達負相關(guān)(r=-0.109,P<0.01)。見圖3。

A：乳腺癌患者C8orf33基因拷貝數(shù)畸變與mRNA表達水平的關(guān)系；B：乳腺癌患者C8orf33基因甲基化與mRNA表達水平的關(guān)系圖3 乳腺癌患者C8orf33基因甲基化和拷貝數(shù)變化對mRNA表達水平的影響

3 討 論

乳腺癌作為中國女性患病率最高的惡性腫瘤之一，近年來被確診的患者數(shù)一直在增加〔10〕。伴隨乳腺癌診斷和治療水平不斷提高，患者的生存時間和生活質(zhì)量得到了改善〔11〕，但是其發(fā)病機制仍未完全得以揭示，預(yù)后標志物也難以滿足臨床需要〔12〕。本文首次發(fā)現(xiàn)C8orf33在乳腺癌組織中高表達，提示該分子參與乳腺癌發(fā)生與進展。

據(jù)報道，肝細胞肝癌中C8orf33基因表達異?！?3〕。Shao等〔14〕報道肝細胞肝癌患者中C8orf33表達下調(diào)，可以區(qū)分G3和G1期肝細胞肝癌，且C8orf33的表達與患者生存相關(guān)，可以作為區(qū)分肝細胞肝癌分化與否的候選分子標志物之一。蛋白亞細胞定位數(shù)據(jù)庫COMPARTMENTS預(yù)測顯示C8orf33編碼蛋白主要定位于細胞核，其次定位于細胞質(zhì)和細胞外，推測C8orf33可能參與核酸結(jié)合、轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后加工修飾等生物學(xué)過程。本文還發(fā)現(xiàn)C8orf33高表達不利于乳腺癌患者預(yù)后，可能在于高水平C8orf33蛋白通過調(diào)節(jié)癌基因和抑癌基因的表達，影響乳腺癌細胞周期或分化，從而參與乳腺癌的發(fā)生和進展。C8orf33高表達在乳腺癌中的功能和機制需要通過細胞學(xué)功能實驗和分子實驗深入研究。

分析C8orf33表達與臨床指標相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)不同PAM50分子分型和組織學(xué)類型的乳腺癌中C8orf33表達差異顯著，體現(xiàn)了乳腺癌的異質(zhì)性，提示C8orf33可能參與不同亞型乳腺癌的發(fā)生和進展。腫瘤純度對C8orf33表達的影響說明不同細胞中C8orf33的表達豐度不同。不同種族對C8orf33表達的影響說明其表達具有種族特異性。

基因拷貝數(shù)增加通常會通過增加基因劑量和活性引起基因表達上升〔15,16〕，本文發(fā)現(xiàn)C8orf33表達水平與其基因拷貝變化正相關(guān)，說明基因拷貝數(shù)增加是C8orf33高表達誘因之一；異常的啟動子DNA過度甲基化通常是導(dǎo)致基因沉默的調(diào)節(jié)因素之一，有研究報道DNA甲基化影響乳腺癌的基因表達譜，從而影響乳腺癌的分型，同時也被作為某些癌癥治療的靶點〔17〕。本研究中，C8orf33基因甲基化水平與其表達水平呈負相關(guān)，說明基因低甲基化促進了C8orf33表達。本文運用多組學(xué)高通量數(shù)據(jù)庫分析乳腺癌患者樣本，基于數(shù)據(jù)庫數(shù)據(jù)大，隨訪時間長，組學(xué)數(shù)據(jù)完備，C8orf33高表達不利于乳腺癌患者預(yù)后這一結(jié)果的可信度高，可作為乳腺癌預(yù)后的一個候選標志物。但也存在一些不足，如分析結(jié)果受到樣本來源的限制。后續(xù)研究中，課題組會在臨床乳腺癌患者樣本中驗證C8orf33的表達差異，并進一步研究C8orf33高表達的細胞學(xué)功能和分子機制。