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        兩種熒光定量PCR試劑檢測HBV-DNA的比較與評價

        2019-06-09 08:40:55胥國強康清秀趙琪林
        醫(yī)學(xué)信息 2019年6期
        關(guān)鍵詞:熒光定量PCR乙肝病毒

        胥國強 康清秀 趙琪林

        摘要:目的? 探討兩種乙型肝炎病毒DNA試劑檢測HBV-DNA的相關(guān)性,分析其檢測結(jié)果的差異性。方法? 使用凱杰試劑與之江試劑檢測75例患者血清中的HBV-DNA水平,凱杰試劑采用手工提取樣本中的DNA,之江試劑采用自動核酸提取儀提取DNA,然后進行核酸擴增。對HBV-DNA病毒載量進行對數(shù)轉(zhuǎn)換(lg10),并將兩組數(shù)據(jù)進行相關(guān)性分析;對不一致的結(jié)果采用羅氏試劑進行確證。結(jié)果? 以HBV-DNA含量>5.0×102 IU/ml臨界值,擬合兩組檢測數(shù)據(jù)結(jié)果,相關(guān)方程為Y=0.8889X+0.7956(R2=0.8954,P<0.05);凱杰試劑檢測標本中HBV-DNA含量為[(5.07±1.96)(對數(shù)值)],之江試劑檢測結(jié)果為[(5.30±1.84)(對數(shù)值)],差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。凱杰試劑檢測陽性率為57.33%(43/75),低于之江試劑的73.33%(55/75),差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。15例檢測結(jié)果不一致的樣本中,凱杰試劑與羅氏試劑結(jié)果符合率為37.50%,之江試劑與羅氏試劑檢測結(jié)果符合率為62.50%。結(jié)論? 凱杰試劑與之江試劑相關(guān)性良好,其檢測結(jié)果可以比較,且之江試劑檢測HBV-DNA的敏感性高于凱杰試劑。

        關(guān)鍵詞:熒光定量PCR;乙肝病毒;凱杰試劑;之江試劑;羅氏試劑

        中圖分類號:R512.62;R440? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻標識碼:A? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?DOI:10.3969/j.issn.1006-1959.2019.06.057

        文章編號:1006-1959(2019)06-0174-03

        Abstract:Objective? To investigate the correlation between two hepatitis B virus DNA reagents for detecting HBV-DNA and analyze the differences in their detection results. Methods? The levels of HBV-DNA in the serum of 75 patients were detected by using Kaijie reagent and Zhijiang reagent. The Kaijie reagent used manual extraction of DNA from the sample. The Zhijiang reagent used an automatic nucleic acid extractor to extract DNA and then perform nucleic acid amplification. The HBV-DNA viral load was log-transformed (lg10), and the two sets of data were correlated. The inconsistent results were confirmed by Roche reagent.Results? The HBV-DNA content>5.0×102 IU/ml threshold value was used to fit the results of the two groups. The correlation equation was Y=0.8889X+0.7956 (R2=0.8954, P<0.05).The HBV-DNA content in the Kaijie reagent test specimens was [(5.07±1.96) (logarithmic value)], and the Zhijiang reagent test result was [(5.30±1.84) (logarithmic value)], the difference was statistically significant (P<0.05). The positive rate of Kaijie reagent detection was 57.33%(43/75), which was lower than that of Zhijiang reagent 73.33%(55/75).The difference was statistically significant (P<0.05). Among the 15 samples with inconsistent test results, the coincidence rate of Kaijie reagent and Roche reagent was 37.50%, and the coincidence rate between Zhijiang reagent and Roche reagent was 62.50%.Conclusion? Compared with the two reagents, the correlation is good and the test results can be compared. The sensitivity of Zhijiang reagent to detect HBV-DNA is higher than that of Kaijie reagent.

        Key words:Fluorescence quantitative PCR;Hepatitis B virus;Kaijie reagent;Zhijiang reagent;Roche reagent

        乙型病毒性肝炎(viral hepatitis type B)是由乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)引起的傳染病,是一種嚴重危害人類健康的傳染病。全球約20億人感染乙肝,其中約2.4億人感染慢性乙肝,我國屬乙肝高流行國家,有9千萬乙肝病毒感染者[1]。肝癌起源于肝細胞,與慢性肝臟疾病引起的肝硬化高度相關(guān),乙肝是導(dǎo)致肝癌發(fā)生最重要的危險因素之一[2]。定量測定乙肝病毒核酸(HBV-DNA)是乙肝診斷、抗病毒治療療效觀察及用藥指導(dǎo)的重要指標[3]。實時熒光定量PCR技術(shù)檢測HBV-DNA是目前特異性較好,靈敏度較高的方法。本研究采用兩種HBV-DNA實時熒光定量PCR試劑檢測患者血液標本,旨在比較它們之間的差異性和相關(guān)性。

        1材料與方法

        1.1材料? 收集2017年2月在四川省遂寧市中心醫(yī)院檢驗科做HBV-DNA定量檢測血清標本75例,將標本按4000 r/min離心5 min,留取血清冷凍于-80℃冰箱保存。

        1.2儀器與試劑? 試劑A由凱杰生物工程(深圳)有限公司提供;試劑B及EX3600核酸自動提取儀由上海之江生物科技有限公司提供;試劑C由羅氏診斷產(chǎn)品有限公司提供。試劑A、B用羅氏Cobas z480擴增儀進行檢測,試劑C用羅氏Cobas AmpliPrep/Cobas Taqman 96系統(tǒng)檢測,實驗所用試劑在有效期內(nèi)。

        1.3方法? 將75例血清標本分別用試劑A、B進行平行檢測,試劑A采用人工提取核酸和實時熒光定量檢測技術(shù);試劑B采用儀器自動提取核酸和實時熒光定量檢測技術(shù);對不一致的樣本(以5×102 IU/ml為臨界值)采用試劑C檢測系統(tǒng)進行確證。

        1.4統(tǒng)計學(xué)處理? 對采用試劑A、B檢測HBV-DNA載量同時大于5×102 IU/ml的數(shù)據(jù)進行對數(shù)轉(zhuǎn)換(log10),用SPSS17.0軟件進行配對t檢驗、?字2檢驗和相關(guān)性分析,P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

        2結(jié)果

        2.1兩種試劑檢測結(jié)果相關(guān)性分析? 將試劑A、B的檢測結(jié)果取對數(shù)后做相關(guān)分析。通過分析曲線可以看出線性良好,相關(guān)方程為Y=0.8889X+0.7956 (R2=0.8954,P<0.05),見圖1。

        2.2兩種試劑對不同樣本的病毒載量分析? 試劑A檢測標本中HBV-DNA含量為[(5.07±1.96)(對數(shù)值)],試劑B檢測標本中HBV-DNA含量為[(5.30±1.84)(對數(shù)值)],差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=-2.29,P=0.028)。

        2.3兩種試劑檢測陽性率比較? 以5×102 IU/ml為臨界值,>5×102 IU/ml為陽性,<5×102 IU/ml為陰性。試劑A檢測陽性率為57.33%(43/75),試劑B檢測陽性率為73.3%(55/75),差異有統(tǒng)計學(xué)意義(?字2=15.539,P=0.000),見表1。

        2.4不一致樣本與羅氏檢測系統(tǒng)的符合率比較? 將試劑A、B檢測結(jié)果不一致的16例樣本(4例樣本標本不足未檢測),以試劑C羅氏檢測系統(tǒng)進行確證。試劑A與試劑C的符合率為37.50(6/16),試劑B與試劑C的符合率為62.50%(10/16),見表2。

        3討論

        實時熒光定量PCR是將熒光能量傳遞技術(shù)應(yīng)用于常規(guī)PCR儀中,在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團或熒光染料,利用熒光信號積累,實時檢測整個PCR過程,目前在臨床診斷試劑中,應(yīng)用最廣的是以Taqman熒光探針為基礎(chǔ)的實時熒光PCR技術(shù)。具有特異性好、靈敏度高、線性關(guān)系好、線性范圍寬、操作簡單安全、速度快效率高等優(yōu)點。HBV-DNA定量可準確地反映患者體內(nèi)的病毒復(fù)制情況,目前監(jiān)測HBV-DNA定量的試劑種類繁多,質(zhì)量殘差不齊,在應(yīng)用臨床之前需要對其性能做出評價,為臨床提供準確的檢測結(jié)果。

        本文探討了不同廠家試劑的檢測結(jié)果是否存在差異,對結(jié)果進行了比較分析。本次研究結(jié)果顯示,試劑A與試劑B線性相關(guān)性良好(R2=0.8954),檢測結(jié)果可以相關(guān)比較,都可較準確反映患者體內(nèi)HBV-DNA水平。試劑A(5.07±1.96)與試劑B(5.30±1.84)比較,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),試劑A檢測標本中的HBV-DNA含量低于試劑B檢測值。原因可能為試劑A為煮沸法,手工提取核酸,操作步驟繁瑣,容易造成核酸的丟失,導(dǎo)致HBV-DNA含量降低。試劑B采用儀器磁珠分離技術(shù),核酸提取由儀器自動完成,可以降低由于手工操作不當?shù)仍蛟斐傻募訇幮?。也可能與兩試劑的核酸提取液、反應(yīng)體系和擴增程序不同有關(guān)。以5×102 IU/ml為界值,試劑A陽性率為57.33%(43/75),低于試劑B的陽性率73.33%(55/75)??赡軐τ诘椭禈颖荆瑑x器自動提取核酸的方法明顯優(yōu)于手工提取的方法,靈敏度高于手工提取的方法。對于試劑A與試劑B檢測結(jié)果不一致的16例樣本,采用試劑C(羅氏檢測系統(tǒng))進行確證。國際公認羅氏試劑為檢測HBV-DNA定量的參比試劑[4]。試劑A與試劑C符合率為37.50%,低于試劑B與試劑C的符合率62.50%;試劑C檢出的8例陽性標本中,試劑B檢出了7例,而試劑A只檢出了1例,陽性檢出率遠低于B試劑。這可能是由于試劑B與試劑C同為儀器磁珠提取核酸的方法,它們之間的符合率較高,靈敏度也較一致,進一步提示儀器法的優(yōu)越性。但由于樣本量較小,需進一步探討。

        綜上所述,凱杰檢測試劑與之江檢測試劑相關(guān)性良好,可以相互替代,但手工操作與儀器磁珠自動提取核酸方法在檢測HBV-DNA含量之間存在有統(tǒng)計學(xué)差異。建議有條件的實驗室盡量使用儀器磁珠的方法,以避免漏檢。

        參考文獻:

        [1]孫波.乙型肝炎流行病學(xué)特點及防治策略的研究[J].中國衛(wèi)生產(chǎn)業(yè),2016,13(8):81-83.

        [2]沈藝南,朱峰鋒,盧軍華.乙肝相關(guān)肝細胞癌的分子機制研究新進展[J].現(xiàn)在腫瘤醫(yī)學(xué),2015,23(8):1156-1159.

        [3]王希濤.兩種乙肝病毒DNA 實時熒光定量檢測試劑的比較[J].國際檢驗醫(yī)學(xué)雜志,2014,35(6):754-758.

        [4]張玥,田文君,劉文慶,等.國產(chǎn)和進口熒光定量PCR試劑檢測HBV-DNA的比對分析[J].檢驗醫(yī)學(xué)與臨床,2015,12(2):147-150.

        收稿日期:2018-9-28;修回日期:2018-11-25

        編輯/錢洪飛

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