白雪 朱海波 鄧琦

摘要：目的? 探究程序性死亡分子1配體-1（PD-L1）在急性髓系白血?。ˋML）中的表達(dá)作用和臨床意義。方法? 選取2013年1月～2016年12月在我院進(jìn)行治療并確診為AML的初治患者49例為觀察組，選擇同期在我院接受治療的27例非惡性疾病如缺鐵性貧血、巨幼細(xì)胞性貧血者作為對(duì)照組。對(duì)比兩組患者血液中的PD-L1表達(dá)水平，分析患者性別、年齡、初診白細(xì)胞計(jì)數(shù)、亞型的對(duì)血液中PD-L1的影響，確定PD-L1表達(dá)與臨床療效的相關(guān)性。結(jié)果? 對(duì)照組患者治療前的PD-L1表達(dá)與觀察組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。治療后，觀察組的PD-L1表達(dá)高于對(duì)照組，統(tǒng)計(jì)學(xué)意義顯著（P<0.01）。單因素結(jié)果顯示，PD-L1在AML初診患者中的表達(dá)水平與患者的性別、年齡、初診WBC數(shù)、分型無(wú)相關(guān)性（P>0.05）;未緩解AML患者組PD-L1表達(dá)水平高于持續(xù)完全緩解組AML患者（P<0.01）。結(jié)論? PD-L1可能參與AML的免疫逃逸機(jī)制，并可能與病情進(jìn)展及治療效果相關(guān)。

關(guān)鍵詞：PD-L1;急性髓系白血病;免疫

中圖分類(lèi)號(hào)：R733.71? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? DOI：10.3969/j.issn.1006-1959.2019.06.025

文章編號(hào)：1006-1959（2019）06-0079-03

Abstract：Objective? To investigate the expression and clinical significance of programmed death molecule 1 ligand-1 （PD-L1） in acute myeloid leukemia （AML）. Methods? From January 2013 to December 2016， 49 patients with initial diagnosis of AML were enrolled in our hospital. The observation group was selected from 27 non-malignant diseases such as iron deficiency anemia and giants treated in our hospital. A young cell anemia was used as a control group. The levels of PD-L1 in the blood of the two groups were compared. The effects of gender， age， white blood cell count， and subtype on PD-L1 in the blood were analyzed to determine the correlation between PD-L1 expression and clinical efficacy. Results? There was no significant difference in the expression of PD-L1 between the control group and the observation group （P>0.05）. After treatment， the expression of PD-L1 in the observation group was higher than that in the control group，the statistical significance was significant （P<0.01）. Univariate results showed that the expression level of PD-L1 in newly diagnosed patients with AML was not correlated with gender， age， number of newly diagnosed WBC， and type （P>0.05）. The expression of PD-L1 was higher in patients without AML. Patients with AML were continuously relieved （P<0.01）. Conclusion? PD-L1 may be involved in the immune escape mechanism of AML and may be related to the progression of the disease and the therapeutic effect.

Key words：PD-L1;Acute myeloid leukemia;Immunity

程序性死亡分子1配體-1（programmed death 1 ligand 1，PD-L1），又名B7同源分子1（B7 homologue 1，B7-H1）或CD274，是B7/CD28共刺激分子家族的重要成員，這一免疫標(biāo)記近年來(lái)因與腫瘤發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)而成為研究熱點(diǎn)。PD-L1與程序性死亡分子1（programmed death-1，PD-1）作為負(fù)性共刺激分子，兩者結(jié)合后傳遞抑制性信號(hào)，降低淋巴細(xì)胞的免疫功能，削弱淋巴細(xì)胞的殺傷作用[1]。研究表明[2-6]，許多腫瘤細(xì)胞高表達(dá)PD-L1，如肺癌、腎癌、乳腺癌、肝癌、胃癌等，其可與腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞表面的PD-1結(jié)合，限制抗腫瘤免疫應(yīng)答，參與腫瘤免疫逃逸。但之前的研究大多關(guān)注于實(shí)體腫瘤，少量研究表明在急性髓系白血?。╝cute myeloid leukemia，AML）等惡性血液系統(tǒng)疾病中PD-L1也存在高表達(dá)[2]。本研究檢測(cè)急性髓系白血病患者的PD-L1的表達(dá)情況，探究其在急性髓系白血病中的臨床意義。

1資料與方法

1.1一般資料? 選取2013年1月～2016年12月天津市第一中心醫(yī)院就診，確診為AML的初治患者49例為研究對(duì)象，作為觀察組，排除急性早幼粒細(xì)胞白血病患者，所有患者均符合世界衛(wèi)生組織（WHO）診斷分型標(biāo)準(zhǔn)[8]，其中M2 8例，M4 16例，M5 25例;男26例，女23例，年齡15～82歲，中位年齡54歲。選擇同期在我院接受治療的27例非惡性疾病如缺鐵性貧血、巨幼細(xì)胞性貧血者作為對(duì)照組，男13例，女14例，年齡15～83歲，中位年齡56歲。兩組患者性別、年齡等一般資料比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），具有可比性。本研究通過(guò)本院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，患者均已簽署知情同意書(shū)并表示能夠完成病例收集。

1.2試劑與儀器? Ficoll淋巴細(xì)胞分離液（天津川頁(yè)生化制品有限公司）;Trizol試劑（Invitrogen，美國(guó)）;DEPC、氯仿、異丙醇、無(wú)水乙醇（天津化學(xué)試劑公司）;反轉(zhuǎn)錄試劑（Fermentas，美國(guó)）;Realtime試劑（Kapa，美國(guó)）;熒光定量PCR儀（Roche，瑞士）。

1.3方法? 選用熒光定量PCR對(duì)PD-L1進(jìn)行監(jiān)測(cè)，包括引物設(shè)計(jì)、RNA提取、反轉(zhuǎn)錄和定量測(cè)定四個(gè)步驟。

1.3.1引物設(shè)計(jì)? 使用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)引物，由上海生工生物工程有限公司合成，引物序列見(jiàn)表1。

1.3.1骨髓單個(gè)核細(xì)胞的分離及RNA的提取? 采集骨髓2～5 ml，EDTA抗凝，F(xiàn)icoll淋巴細(xì)胞分離液密度梯度離心法收集單個(gè)核細(xì)胞。Trizol提取細(xì)胞總RNA，經(jīng)紫外分光光度計(jì)測(cè)定濃度和純度。

1.3.2反轉(zhuǎn)錄? 反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系為Reverse Transcription預(yù)混液6 μl，Total RNA 14 μl，反應(yīng)總體積20 μl。反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件為：25℃ 15 min，55℃ 40 min，85℃ 5 min。

1.3.3實(shí)時(shí)熒光SYBR Green相對(duì)定量PCR? 將各模板cDNA在相同條件下進(jìn)行相對(duì)定量PCR，反應(yīng)體系為：2×KAPA SYBR FAST Mix 7.5 μl，Primer Mix（10 μmol/L）1 μl，cDNA（10 ng）1 μl，DEPC H2O 5.5 μl，反應(yīng)總體積15 μl。實(shí)時(shí)熒光相對(duì)定量PCR擴(kuò)增條件為：先95℃ 30 s，后95℃ 3 s，60℃ 30 s循環(huán)40次。數(shù)據(jù)由LightCycler96系統(tǒng)軟件依樣本熒光值自動(dòng)計(jì)算得出樣本中感興趣的目標(biāo)基因和內(nèi)參基因的相對(duì)表達(dá)水平，并將最終結(jié)果表示為這些基因的比例，比例=目標(biāo)（目的基因PD-L1）濃度/參考（內(nèi)參基因β-actin）濃度。

1.4觀察指標(biāo)? 對(duì)比兩組患者治療前后的PD-L1表達(dá)水平，對(duì)比分析不同性別、年齡、WBC、亞型的AML患者PD-L1表達(dá)水平，以及不同療效情況下的患者的PD-L1表達(dá)差異。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法? 采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，計(jì)量資料以（x±s）表示，采用t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料以（%）表示，采用方差分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P<0.01為統(tǒng)計(jì)學(xué)意義顯著。

2結(jié)果

2.1觀察組臨床療效? 觀察組患者中，9例未接受化療，20例經(jīng)1～2次誘導(dǎo)化療獲得完全緩解，并持續(xù)1.5年以上，15例經(jīng)2次或以上誘導(dǎo)化療未達(dá)到完全緩解，5例為誘導(dǎo)化療緩解后再?gòu)?fù)發(fā)患者，臨床有效率為40.82%（20/49）。

2.2兩組治療前后PD-L1 mRNA表達(dá)比較? 兩組患者治療前的PD-L1表達(dá)比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。治療后，觀察組的PD-L1表達(dá)高于對(duì)照組，統(tǒng)計(jì)學(xué)意義顯著（P<0.01），見(jiàn)表2。

2.3觀察組PD-L1 mRNA表達(dá)的影響因素? 觀察組患者在初診治療前，男性與女性PD-L1表達(dá)水平比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）;以年齡60歲為界，觀察組患者初診治療前≥60歲和<60歲的PD-L1表達(dá)比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）;以白細(xì)胞計(jì)數(shù)30×109/L為界，觀察組患者初診治療前≥30×109/L和<30×109/L的PD-L1表達(dá)比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）;在初診治療前各亞型患者PD-L1表達(dá)水平比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。初診治療前，持續(xù)完全緩解、未緩解、復(fù)發(fā)患者的PD-L1表達(dá)水平比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;其中，未緩解患者PD-L1表達(dá)水平高于持續(xù)完全緩解患者，統(tǒng)計(jì)學(xué)意義顯著（P<0.01），見(jiàn)表3。

3討論

隨著診斷水平的提高，化療方案的不斷改進(jìn)、靶向藥物以及造血干細(xì)胞移植等治療手段的廣泛應(yīng)用，血液系統(tǒng)惡性腫瘤的診治水平得到了很大的提高，使患者的預(yù)后有了較大改善，但仍有部分患者因原發(fā)耐藥或緩解后復(fù)發(fā)導(dǎo)致死亡。近幾年發(fā)現(xiàn)，多種腫瘤細(xì)胞表面高表達(dá)PD-L1，對(duì)PD-L1參與腫瘤免疫逃逸及利用PD-L1進(jìn)行免疫治療的相關(guān)研究己成為目前國(guó)內(nèi)外腫瘤學(xué)研究的熱點(diǎn)，但之前的研究多關(guān)注于PD-L1在實(shí)體腫瘤中的表達(dá)及作用，PD-L1/PD-1信號(hào)通路在實(shí)體腫瘤中的免疫負(fù)調(diào)控作用已得到廣泛的證實(shí)，而關(guān)于其在急性髓系白血病等血液系統(tǒng)惡性腫瘤中的表達(dá)及臨床意義則報(bào)道較少。

AML原始細(xì)胞抑制T細(xì)胞功能，但這一途徑的確切性質(zhì)目前并不清楚，B7家族分子可能是這種免疫抑制效應(yīng)的原因之一。有文獻(xiàn)報(bào)道小鼠AML模型中，腫瘤的進(jìn)展導(dǎo)致調(diào)節(jié)T細(xì)胞的增強(qiáng)和CD8細(xì)胞毒性T細(xì)胞上PD-1表達(dá)的增強(qiáng)，PD-1/PD-L1相互作用促進(jìn)調(diào)節(jié)T介導(dǎo)的對(duì)T效應(yīng)細(xì)胞的抑制，從而抑制抗腫瘤免疫應(yīng)答[7，8]。miRNA（miR）34a可在腫瘤發(fā)生中調(diào)節(jié)關(guān)鍵基因的轉(zhuǎn)錄，Kasumi-1細(xì)胞miR-34a過(guò)表達(dá)可抑制PD-L1的表達(dá)[9]，以上動(dòng)物模型及細(xì)胞實(shí)驗(yàn)提示PD-L1可能在AML的免疫逃逸機(jī)制中也發(fā)揮作用，從而有可能與AML的治療效果和預(yù)后相關(guān)。本次研究結(jié)果顯示，觀察組患者PD-L1表達(dá)水平高于對(duì)照組，未緩解患者初治時(shí)PD-L1表達(dá)水平最高，其次為復(fù)發(fā)患者，而持續(xù)完全緩解的患者表達(dá)水平最低，這與馬紅等[10]研究結(jié)果一致，提示PD-L1表達(dá)水平可能與AML療效相關(guān)，PD-L1表達(dá)水平高者治療更為困難，可能與化療失敗相關(guān)。另外，PD-L1在初診治療前AML患者中的表達(dá)水平與患者性別、年齡、初診WBC數(shù)、分型并無(wú)相關(guān)性，提示PD-L1可能是影響AML療效的獨(dú)立因素。

大量研究已表明，PD-L1/PD-1信號(hào)通路在削弱抗腫瘤免疫應(yīng)答方面發(fā)揮重要作用[11-14]，靶向這一途徑的檢查點(diǎn)治療，如在多種實(shí)體瘤的挽救治療中取得良好療效的PD-1抗體Nivolumab、Pembrolizumab及PD-L1抗體BMS-936559、MEDI4736已取得突破性進(jìn)展，其在惡性血液病中也逐漸嶄露頭角，有望聯(lián)手化療、造血干細(xì)胞移植等，成為未來(lái)急性髓系白血病等血液系統(tǒng)惡性腫瘤免疫治療的新靶點(diǎn)。

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收稿日期：2018-12-15;修回日期：2018-12-25

編輯/王海靜