陳娜蜜 蔣婧妍 任秋生 盧波

對(duì)于慢性病理性疼痛患者，疼痛的持續(xù)存在常使其產(chǎn)生嚴(yán)重的負(fù)性情緒反應(yīng)[1]。研究表明，前扣帶皮層（anterior cingulate cortex，ACC）與痛情緒的形成與維持密切相關(guān)[2-3]，然而目前對(duì)ACC調(diào)控痛情緒發(fā)生過程的分子機(jī)制尚不清楚。大量證據(jù)表明哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）參與多種形式的神經(jīng)元突觸可塑性變化，包括長期記憶的形成、痛覺中樞敏化及海馬、脊髓背角神經(jīng)元的長時(shí)程增強(qiáng)[4-7]。本研究擬觀察特異性抑制ACC腦區(qū)mTOR活性對(duì)福爾馬林炎性痛大鼠痛情緒反應(yīng)的影響。

1 材料和方法

1.1 材料 雄性清潔級(jí)SD大鼠24只，由浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，體重230～300g。本研究在實(shí)施前已獲得寧波大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物均飼養(yǎng)于寧波大學(xué)SPF級(jí)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。福爾馬林溶液（美國Sigma公司）；雷帕霉素（美國CST公司）；腦立體定位儀（深圳瑞沃德公司）；CPA訓(xùn)練箱（安徽正華公司）；大鼠微量注射套管系統(tǒng)（深圳瑞沃德公司）。

1.2 慢性疼痛模型 將大鼠于異氟醚吸入麻醉下，在左側(cè)足底皮下注射5%福爾馬林溶液50μl，建立福爾馬林炎性痛模型。

1.3 實(shí)驗(yàn)分組 將24只大鼠隨機(jī)分為3組，福爾馬林模型組（F組）、雷帕霉素組（R組）和DMSO組（D組），每組8只。所有大鼠均建立福爾馬林炎性痛模型，R組和D組于建模前20min經(jīng)ACC套管注射相應(yīng)藥物或溶劑，以觀察抑制ACC腦區(qū)mTOR活性對(duì)痛情緒和疼痛評(píng)分的影響。

1.4 立體定位ACC腦區(qū)置管給藥 大鼠麻醉后頭部固定于腦立體定位儀上，門齒桿-3.3mm。檢測(cè)是否固定成功的標(biāo)準(zhǔn)如下：鼻對(duì)正中，頭部不動(dòng)，提尾不掉。按照Paxinos&Watson圖譜[8]，ACC坐標(biāo)為：AP:+2.6mm，L：±0.6mm，H：-2.5mm。用牙科鉆于進(jìn)針點(diǎn)處鉆一小孔，深度至硬腦膜。將外套管緩慢植入，并以牙托粉固定于顱骨表面。待牙托粉凝固后，外套管塞入長度較套管長0.2mm的不銹鋼內(nèi)芯并蓋上導(dǎo)管蓋。術(shù)后隔天插拔內(nèi)芯一次，防止套管堵塞。

需給藥時(shí)，以異氟烷麻醉，將套管內(nèi)芯拔出，插入注射內(nèi)管，注射內(nèi)管尖端長于套管0.2mm，末端通過PE-10軟管連接微量進(jìn)樣器。雙側(cè)ACC給藥，每側(cè)注射0.5μl藥物或溶劑，其中雷帕霉素給藥量為每側(cè)7ng，溶劑為1%DMSO。在3min內(nèi)注射完畢，隨后留針5min，防止液體溢出，使藥液充分?jǐn)U散。

1.5 福爾馬林條件位置回避訓(xùn)練（formalin-induced conditioned place avoidance，F(xiàn)-CPA） CPA訓(xùn)練箱由3個(gè)小室組成，其中 A、B 室等大（30cm×30cm×30cm）并排放置，C 室為中間室（10cm×10cm×30cm），位于 A、B 室前方。3室之間的小門開放狀態(tài)下，大鼠可在3室任意穿梭。A室和B室在視覺和嗅覺信息上有著明顯差異：A室壁為黑白相間的垂直條帶，以1%醋酸溶液作為氣味劑；B室壁為黑白相間的水平條帶，以1%桂皮水作為氣味劑；C室內(nèi)壁灰色，無特殊標(biāo)記，亦無特殊氣味。

CPA訓(xùn)練過程一共4d：第1天，將大鼠放入C室，待其進(jìn)入A或B室后，關(guān)閉C室與A、B室間的小門，記錄15min內(nèi)動(dòng)物在A、B室的停留時(shí)間。第2天和第3天訓(xùn)練過程相同，上午關(guān)閉3室所有小門，大鼠不經(jīng)任何處理直接放入福爾馬林非條件匹配室，任其在內(nèi)自由活動(dòng)45min。下午，大鼠左側(cè)足底注射福爾馬林或生理鹽水后放入福爾馬林條件匹配室（A或B室，信封法隨機(jī)選擇），同樣使其在內(nèi)45min后取出。第4天，操作過程同第1天，記錄大鼠15min內(nèi)在A和B室所停留的時(shí)間。計(jì)算回避分?jǐn)?shù)（訓(xùn)練前后在福爾馬林條件室停留的時(shí)間差值）以評(píng)價(jià)大鼠是否形成條件性位置回避，回避分?jǐn)?shù)越高提示痛情緒越顯著。

1.6 福爾馬林疼痛評(píng)分法 疼痛評(píng)分等級(jí)：0分：注射側(cè)足與非注射側(cè)足負(fù)重姿勢(shì)、位置無明顯差異；1分：注射側(cè)足不負(fù)重或輕微負(fù)重；2分：注射側(cè)足抬起，且完全離開測(cè)試箱底部平面；3分：出現(xiàn)甩足、舔爪、撕咬行為。每隔3min記錄1次大鼠在各個(gè)評(píng)分等級(jí)上的累積時(shí)間，每次記錄60s，持續(xù)觀察45min。累積疼痛評(píng)分按照下方公式計(jì)算，得到0～3分的疼痛評(píng)分：

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以表示。組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用Bonferroni法；同一組大鼠訓(xùn)練前后比較采用配對(duì)t檢驗(yàn)。對(duì)福爾馬林疼痛行為學(xué)表現(xiàn)，組間比較采用雙因素方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 3組大鼠痛情緒的比較 F組和D組大鼠訓(xùn)練后在福爾馬林炎性痛匹配的條件室內(nèi)停留時(shí)間明顯短于訓(xùn)練之前（t=5.714、7.916，均P＜0.01）。而R組大鼠訓(xùn)練前后在條件室內(nèi)停留時(shí)間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（t=1.287，P＞0.05 ）。3組大鼠回避分?jǐn)?shù)比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=5.458，P＜0.05）。其中，R組回避分?jǐn)?shù)顯著低于F組和D 組（t=3.235、2.200，均P＜0.05）。見表 1。

表1 3組大鼠痛情緒的比較

2.2 3組大鼠痛感覺的比較 3組大鼠間福爾馬林疼痛評(píng)分比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=1.041，P＞0.05），見圖1。

圖1 各組大鼠福爾馬林疼痛評(píng)分的比較

3 討論

研究證實(shí)，疼痛的感覺分辨組分和情緒體驗(yàn)組分由不同的神經(jīng)傳導(dǎo)通路傳導(dǎo)，并且最終對(duì)其進(jìn)行整合、調(diào)控和處理的大腦腦區(qū)也并不完全相同[9]。神經(jīng)元突觸可塑性是慢性疼痛產(chǎn)生的重要細(xì)胞機(jī)制，mTOR通過調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的翻譯表達(dá)在其中起到關(guān)鍵作用[10-11]。近年來研究亦證實(shí)mTOR在脊髓水平參與突觸可塑性及慢性疼痛的形成過程[12-13]，但是對(duì)于mTOR是否在脊髓上中樞水平參與痛情緒的形成尚不清楚。ACC是邊緣系統(tǒng)中最大的一個(gè)腦區(qū)，臨床觀察、電生理實(shí)驗(yàn)、人類腦功能成像以及動(dòng)物ACC切除實(shí)驗(yàn)均證實(shí)其與痛相關(guān)情緒的形成密切相關(guān)[2-3]。通過福爾馬林炎性痛與CPA行為學(xué)相結(jié)合的方法，本研究發(fā)現(xiàn)特異性抑制ACC腦區(qū)mTOR活性顯著削弱福爾馬林炎性痛大鼠的痛情緒反應(yīng)，即mTOR信號(hào)通路是ACC調(diào)控痛情緒的重要分子機(jī)制。

F-CPA是將疼痛刺激誘導(dǎo)的負(fù)性情緒與背景環(huán)境相聯(lián)系從而建立的條件性記憶，因此雷帕霉素削弱痛情緒反應(yīng)可能是由于痛情緒相關(guān)的“記憶”被破壞所致，類似于各種形式長期記憶的擦除。此外，大量證據(jù)表明ACC與諸多邊緣系統(tǒng)腦區(qū)（如杏仁核、腹側(cè)紋狀體、海馬和下丘腦等）存在直接或間接的連接，這些腦區(qū)與負(fù)性情緒的調(diào)控以及學(xué)習(xí)記憶密切相關(guān)[14-16]。因此，ACC中的mTOR也可能通過影響這些腦區(qū)域的相關(guān)信號(hào)通路進(jìn)而調(diào)控痛情緒的形成和發(fā)展。進(jìn)一步的研究可通過下調(diào)ACC中mTOR活性，同時(shí)檢測(cè)上述核團(tuán)的神經(jīng)元電生理改變來證實(shí)這一假設(shè)。

本研究結(jié)果還發(fā)現(xiàn)，在ACC內(nèi)注射雷帕霉素并不影響福爾馬林炎性痛大鼠的傷害性感受行為（福爾馬林疼痛評(píng)分），提示疼痛的感覺組分不依賴于ACC內(nèi)mTOR信號(hào)通路的活化，這與先前的研究結(jié)果相一致[17]。同時(shí)，這也提示了雷帕霉素對(duì)痛情緒的削弱作用不是通過阻斷了大鼠對(duì)福爾馬林痛感覺的分辨從而阻斷條件性回避行為的形成，而是作用于痛情緒本身。

綜上所述，抑制ACC腦區(qū)mTOR活性削弱福爾馬林炎性痛誘導(dǎo)的痛相關(guān)負(fù)性情緒。