李燕榮，楊 勇，張龍?jiān)疲T洪弟，姜 雷，郭風(fēng)雪，宋 寶

（江蘇洋河股份有限公司，江蘇宿遷223800）

古語(yǔ)有云：“曲乃酒之骨也”，洋河綿柔型風(fēng)格白酒的釀造自然離不開綿柔型中高溫大曲。大曲在白酒釀造中既是糖化劑、發(fā)酵劑又是生香劑，不但含有豐富的微生物區(qū)系和酶系，還蘊(yùn)含白酒風(fēng)格形成的各種呈香呈味前體物質(zhì)，同時(shí)還作為釀酒的原料，因此大曲在釀酒生產(chǎn)中的作用不言而喻，其品質(zhì)好壞決定著酒的風(fēng)格及檔次。

本文對(duì)中高溫大曲制作發(fā)酵期全流程進(jìn)行跟蹤取樣，并首次將曲樣細(xì)分為曲皮樣和曲心樣，分別針對(duì)曲皮和曲心中的微生物消長(zhǎng)變化規(guī)律進(jìn)行研究分析，著力探析發(fā)酵期綿柔型中高溫大曲由外及里微生物的動(dòng)態(tài)消長(zhǎng)變化規(guī)律，旨在全面剖析發(fā)酵期大曲微生物更迭全過(guò)程，為制曲工藝優(yōu)化和現(xiàn)代化制曲提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料及儀器

曲樣：采樣方法見1.3.1。

儀器設(shè)備：酒精溫度計(jì)，粉碎機(jī)，高壓蒸汽滅菌鍋，超凈操作工作臺(tái)，1 mL移液槍，200 μL移液槍，玻璃涂布棒，恒溫培養(yǎng)箱。

1.2 培養(yǎng)基

營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基：牛肉膏1.0 g，酵母膏2.0 g，蛋白胨5.0 g，氯化鈉5 g，瓊脂18 g，蒸餾水1000 mL，pH 7.4。

孟加拉紅培養(yǎng)基：蛋白胨5.0 g，葡萄糖10 g，磷酸二氫鉀1.0 g，硫酸鎂0.5 g，孟加拉紅0.03 g，瓊脂20 g，氯霉素0.1 g，水1000 mL，pH 7.2±0.2。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 取樣

對(duì)發(fā)酵期全流程進(jìn)行跟蹤并取樣，將曲樣分為曲皮樣和曲心樣，取樣詳情見表1。

將曲皮樣和曲心樣依據(jù)軟硬情況，用粉碎機(jī)進(jìn)行粉碎，過(guò)40目篩備用。

1.3.2 曲樣微生物數(shù)的檢測(cè)

梯度稀釋涂布法：取5.0 g大曲粉，加入裝有玻璃珠和50 mL無(wú)菌水的三角瓶中搖勻，經(jīng)30 min充分浸提和靜置后，用1 mL移液槍吸取1.0 mL上清液于裝有9.0 mL無(wú)菌水的試管中，制成10-2梯度的稀釋液，吸取該梯度的稀釋液1 mL于裝有9.0 mL無(wú)菌水的試管中，依照此操作次序制成10-3、10-4、10-5梯度的曲樣浸出液。隨后用200 μL移液槍分別取 10-1、10-2、10-3、10-4和 10-5梯度的稀釋浸出液200 μL于營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基和孟加拉紅培養(yǎng)基中，用無(wú)菌的涂布棒均勻涂布后分別置于37℃培養(yǎng)箱和30℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。營(yíng)養(yǎng)瓊脂板倒置培養(yǎng)24 h后取出檢測(cè)細(xì)菌數(shù)量，孟加拉紅板倒置培養(yǎng)36 h后取出檢測(cè)酵母菌菌落數(shù)，48 h后取出檢測(cè)霉菌數(shù)量。

表1 發(fā)酵各階段取樣匯總表

說(shuō)明：正值伏天取樣，以上培養(yǎng)基需放置在室內(nèi)溫度為25～27℃的環(huán)境中，方能正常使用，并實(shí)現(xiàn)上述各項(xiàng)操作。

1.3.3 曲樣溫度測(cè)定

對(duì)曲房四周和中心曲塊的溫度進(jìn)行跟蹤測(cè)定。具體操作方法是將酒精溫度計(jì)插入曲樣正中心位置，每日下午3時(shí)～5時(shí)定點(diǎn)查看曲塊溫度并記錄。

1.3.4 曲樣水分檢測(cè)

將干燥箱溫度調(diào)至130℃，待溫度恒定后放入試樣，烘烤60 min后取出，繼而進(jìn)行水分測(cè)算。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵期大曲溫度

中高溫大曲發(fā)酵周期為31 d，大曲發(fā)酵期溫度變化及趨勢(shì)（該實(shí)驗(yàn)跟蹤的是7月份制大曲，發(fā)酵期大曲溫度變化趨勢(shì)會(huì)隨季節(jié)有一些波動(dòng)）見表2。由表2可知，在第1天和第2天主發(fā)酵階段，曲溫緩慢上升，該階段大曲主要完成“穿衣”，曲皮被一層霉菌菌絲覆蓋。此時(shí)霉菌菌絲進(jìn)入曲皮，可引出曲塊中的水分，而不至于使大曲中的水因無(wú)出口而膨脹裂口，素有“菌絲內(nèi)插，水分揮發(fā)”的培養(yǎng)原理，自此每個(gè)曲塊形成了一個(gè)“微氧”“獨(dú)立”的小生態(tài)環(huán)境[1]。并房操作時(shí)，曲溫略有下降。發(fā)酵第4天曲塊溫度和濕度急劇升高并進(jìn)入潮火期，此時(shí)曲塊溫度在51～53℃之間；再經(jīng)過(guò)2 d持續(xù)升溫后，大曲發(fā)酵進(jìn)入大火期，此時(shí)曲塊溫度可達(dá)60～61℃，這個(gè)溫度可以持續(xù)5～6 d（占火期），占火期后曲塊溫度開始回落，回落速度平穩(wěn)，進(jìn)入后火期，該階段的曲塊溫度也是緩慢下降。整個(gè)發(fā)酵期大曲溫度變化符合“前火不可過(guò)大，后火不可過(guò)小，多熱少?zèng)霾婚W火”的規(guī)律[2]。之后，曲塊進(jìn)入養(yǎng)曲期，此時(shí)溫度緩慢下降直至室溫。

表2 發(fā)酵各階段曲塊溫度表

2.2 發(fā)酵期大曲水分

大曲制作期水分變化及趨勢(shì)見表3。由表3可知，曲塊發(fā)酵的前12 d，曲皮水分散失較快，水分從37.96%下降到11.45%，曲塊水分平均每天散失近2.2%，12 d后曲皮水分變化緩慢，處于較穩(wěn)定狀態(tài)，而與曲皮水分變化截然不同的是，曲心水分在10 d前變化幅度不大，每天下降約0.21%，但從12 d開始，隨著曲溫不斷升高，曲心水分揮發(fā)幅度加劇，從表3曲心水分變化數(shù)據(jù)可知，這段時(shí)間水分呈直線下降趨勢(shì)，在大曲發(fā)酵后期短短16 d中，曲心水分從35.90%直線下降到13.16%，平均每天下降約1.42%，與前期10 d每天下降0.21%相比可知，曲心水分在大曲發(fā)酵后期隨著曲心溫度的不斷升高及微生物的大量繁殖而加劇消耗揮發(fā)。

表3 發(fā)酵期大曲水分

2.3 細(xì)菌動(dòng)態(tài)變化規(guī)律

細(xì)菌是大曲的“生香動(dòng)力”，是多種香味物質(zhì)產(chǎn)生的源泉[3]。大曲發(fā)酵期細(xì)菌數(shù)量變化幅度小，且在微生物總數(shù)上占據(jù)絕對(duì)優(yōu)勢(shì)。由表4可知，主發(fā)酵階段曲皮細(xì)菌數(shù)量即達(dá)到峰值，整個(gè)大曲發(fā)酵期間，曲皮細(xì)菌數(shù)量始終多于曲心，除了第7天、第8天和第9天，這3 d的曲心細(xì)菌數(shù)量多于曲皮，并且曲心處細(xì)菌在發(fā)酵第9天達(dá)到峰值，結(jié)合曲塊水分和溫度共同分析，這期間曲塊溫度迅速升高至大火期，曲皮水分散失嚴(yán)重，不能滿足微生物的繁殖所需，而此時(shí)曲心水分充足，曲心處“高濕”“微氧”的環(huán)境極利于微生物的生長(zhǎng)，尤其是耐高溫芽孢桿菌的生長(zhǎng)繁殖[4]。大曲發(fā)酵后火階段，隨著曲塊溫度的回落，曲心處細(xì)菌數(shù)量大幅減少，直至此后的其他階段，曲心細(xì)菌數(shù)量變化不大，而與此同時(shí)曲皮處細(xì)菌數(shù)量由于曲溫的下降，加上“微氧”“微濕”的微環(huán)境所致，其細(xì)菌數(shù)量反而呈現(xiàn)回升勢(shì)頭。從表4也能看出，在發(fā)酵后期第10天起，曲皮細(xì)菌數(shù)量增值幅度顯著高于曲心，而此時(shí)曲心處細(xì)菌數(shù)量變化曲線表現(xiàn)平穩(wěn)，變化幅度小，幾乎無(wú)變化。

表4 發(fā)酵期大曲曲皮和曲心細(xì)菌數(shù)量

2.4 霉菌動(dòng)態(tài)變化規(guī)律

霉菌具有較強(qiáng)的糖化酶兼具蛋白水解酶合成功能，與大曲的糖化力和液化力顯著相關(guān)[5]。從表5可知，整個(gè)發(fā)酵期曲皮處霉菌數(shù)量變化幅度較大，曲皮和曲心的霉菌在主發(fā)酵階段和并房潮火階段均達(dá)到峰值，此時(shí)曲皮霉菌數(shù)量可達(dá)107cfu/g，曲心霉菌數(shù)量則在104cfu/g，曲皮霉菌數(shù)量是曲心的數(shù)千倍。隨著曲溫的不斷升高，大火期曲皮和曲心處的霉菌顯著減少。此時(shí)曲皮霉菌數(shù)量維持在105cfu/g，是曲心的數(shù)百倍，兩者最大差距可達(dá)數(shù)千倍。后火階段和養(yǎng)曲階段，曲皮霉菌數(shù)量是“一跌再跌”。大曲發(fā)酵期末，曲皮霉菌數(shù)維持在103～104cfu/g。曲心霉菌數(shù)自大火期始，數(shù)量變化不大，數(shù)量穩(wěn)定維持在幾百個(gè)。從這期間霉菌數(shù)的變化可知，霉菌的繁殖對(duì)于氧氣和濕度要求較細(xì)菌菌落嚴(yán)格，而且對(duì)于溫度敏感，高溫是霉菌的“天敵”，這也就解釋了曲皮霉菌數(shù)始終遠(yuǎn)高于曲心的霉菌數(shù)量的現(xiàn)象。在發(fā)酵前期，曲塊濕度較大，曲皮處氧氣含量充足，此時(shí)霉菌得以大量繁殖，而此時(shí)曲心處尚存有少量氧氣，且濕度較大，故曲心處霉菌也得以繁殖，而隨著曲溫的升高以及曲心氧氣的不斷消耗，曲心處霉菌繁殖缺乏了適宜的溫度，同時(shí)又缺氧，自此其數(shù)量是“一落千丈”。

表5 發(fā)酵期大曲曲皮和曲心霉菌數(shù)量

2.5 酵母菌動(dòng)態(tài)變化規(guī)律

酵母菌是發(fā)酵之母，是酒精發(fā)酵的主要?jiǎng)恿?。從?可知，曲皮和曲心酵母菌在發(fā)酵第1天即達(dá)到頂峰，第2天開始回落，這與酵母菌極其不耐熱的特性是緊密相關(guān)的。由表2可知，大曲發(fā)酵第1天曲塊溫度為44℃，第2天曲塊溫度已達(dá)到47℃，不同的酵母菌耐熱程度是不一樣的，一般的酵母菌能夠在37℃以下生長(zhǎng)，如果是固體發(fā)酵的話，溫度達(dá)到45℃影響也不是特別大，溫度再往上升，死亡率就特別高了[6]。主發(fā)酵期間，曲皮酵母菌和曲心酵母菌數(shù)量相當(dāng)，均達(dá)到峰值（107cfu/g），此時(shí)曲皮和曲心都處在一個(gè)溫度不是特別高，濕度適宜的狀態(tài)；并房后至潮火期，曲塊溫度由表及里逐漸升高，曲皮溫度小于曲心溫度，曲皮酵母菌（104～105cfu/g）比曲心酵母菌（103～104cfu/g）多一個(gè)數(shù)量級(jí)；進(jìn)入大火期后，曲皮和曲心溫度均超過(guò)50℃，曲心溫度更是高達(dá)60℃，在這個(gè)溫度下是沒有酵母菌能夠存活，因此自大火期后不管是曲心還是曲皮，受制于溫度的影響，酵母菌菌落在10-1曲樣梯度稀釋液中未有檢出，但不排除大曲樣中有酵母菌，可通過(guò)液態(tài)培養(yǎng)基進(jìn)行酵母菌的富集試驗(yàn)進(jìn)行進(jìn)一步的佐證。

表6 發(fā)酵期大曲曲皮和曲心酵母菌數(shù)量

3 結(jié)論

微生物的生長(zhǎng)繁殖與其存在環(huán)境中的水分和溫度是分不開的，這兩個(gè)指標(biāo)對(duì)于微生物的生長(zhǎng)具有決定性的作用，因此本研究結(jié)合了發(fā)酵期各階段的溫度和水分指標(biāo)，對(duì)發(fā)酵期綿柔中高溫大曲的細(xì)菌、酵母菌和霉菌3種主要微生物動(dòng)態(tài)變化進(jìn)行了總結(jié)分析，初步明晰了各自的消長(zhǎng)規(guī)律。

正如文中所說(shuō)細(xì)菌是“生香動(dòng)力”，霉菌是“糖化動(dòng)力”，酵母菌是“發(fā)酵動(dòng)力”，但是這些指標(biāo)都是相互作用的，不能孤立著看，要完整剖析大曲發(fā)酵期的動(dòng)態(tài)變化，達(dá)到充分認(rèn)識(shí)這個(gè)動(dòng)態(tài)變化過(guò)程，并將之指導(dǎo)與應(yīng)用于大曲生產(chǎn)實(shí)踐中去，需要盡可能多地對(duì)發(fā)酵過(guò)程中的各因子去做分析，并做好相關(guān)性分析，因此下一步將對(duì)發(fā)酵期的主體微生物及其相關(guān)酶活等理化指標(biāo)進(jìn)行研究分析，同時(shí)結(jié)合本文的微生物動(dòng)態(tài)消長(zhǎng)規(guī)律，最大程度地揭示大曲發(fā)酵培養(yǎng)全過(guò)程的內(nèi)在機(jī)理，以期為機(jī)械化制曲及制曲工藝優(yōu)化提供扎實(shí)的理論指導(dǎo)。