蔡 闖，白從廣，羅 霞，畢研芳

（江蘇洋河酒廠股份有限公司，江蘇宿遷223800）

微生物的發(fā)酵過程往往會受到各種條件因素的影響，其中包括發(fā)酵產(chǎn)物的反饋抑制作用，發(fā)酵環(huán)境改變的抑制作用。這些因素也使得整個體系中的發(fā)酵底物利用率降低，更多的物質(zhì)被用于發(fā)酵菌群的代謝與生長，導(dǎo)致前體產(chǎn)物以及目的產(chǎn)物的合成量降低。為解決這一難題，業(yè)內(nèi)普遍通過誘變篩選耐抗性強(qiáng)的菌株用于發(fā)酵生產(chǎn)，但由于篩菌過程繁瑣、難以確定誘變方向及菌種自身易退化等缺點的存在，尋找一種全新高效的方法十分迫切。原位分離技術(shù)的提出正出于這一目的，從發(fā)酵產(chǎn)物與體系入手，在發(fā)酵過程中分離出對細(xì)胞生長具有毒副性以及產(chǎn)物積累具有抑制作用的產(chǎn)物，該技術(shù)有以下優(yōu)點：促進(jìn)發(fā)酵產(chǎn)物的合成，提高發(fā)酵底物利用率，簡化發(fā)酵后續(xù)產(chǎn)物分離純化的工作[1]。

原位分離技術(shù)對于反饋抑制作用強(qiáng)的發(fā)酵體系，如疫苗、抗生素等具有顯著的效果，目前已有廣泛應(yīng)用。經(jīng)過多年研究，已有成熟的研究成果及實踐經(jīng)驗，通過使用萃取、蒸餾、結(jié)晶、吸附等分離純化手段，根據(jù)產(chǎn)物的獨特理化性質(zhì)如基團(tuán)、相對分子量、極性的不同，可實現(xiàn)準(zhǔn)確地從發(fā)酵體系中分離一種或幾種產(chǎn)物的目的，從而達(dá)到改善發(fā)酵體系內(nèi)環(huán)境與削弱反饋抑制作用。

當(dāng)發(fā)酵體系內(nèi)有以下幾種情況時，可以選擇原位分離技術(shù)：a.部分發(fā)酵產(chǎn)物（代謝產(chǎn)物、次級代謝產(chǎn)物、副產(chǎn)物）對發(fā)酵菌群具有毒副作用與反饋抑制作用；b.發(fā)酵產(chǎn)物本身對發(fā)酵菌群具有毒副作用與反饋抑制作用；c.隨著發(fā)酵的進(jìn)行，發(fā)酵體系內(nèi)環(huán)境改變對發(fā)酵菌群的毒副作用與反饋抑制作用[2]。以乙醇作為發(fā)酵產(chǎn)物的發(fā)酵體系為例，前期發(fā)酵菌群次級代謝反應(yīng)旺盛，其代謝產(chǎn)物可能會影響乙醇的進(jìn)一步合成，并且會改變發(fā)酵體系環(huán)境如pH值、碳氮源的含量等，加之乙醇本身的抑菌作用，這些因素都會對發(fā)酵體系內(nèi)的發(fā)酵菌群產(chǎn)生影響，所以能夠由發(fā)酵體系中分離出乙醇及其代謝產(chǎn)物，則對于發(fā)酵體系內(nèi)發(fā)酵水平的提升具有積極的幫助和意義。

與其他發(fā)酵行業(yè)相比，白酒的釀造具有繁多的發(fā)酵菌體系、復(fù)合的發(fā)酵底物、復(fù)雜的發(fā)酵產(chǎn)物等特點，所以原位分離技術(shù)在傳統(tǒng)白酒釀造中的研究應(yīng)用尚屬空白。而原位分離技術(shù)在白酒釀造中的應(yīng)用具有極強(qiáng)研究價值，不僅可以揭示部分白酒發(fā)酵過程的變化，也對實際生產(chǎn)具有積極的意義。

其實在傳統(tǒng)工藝中，原位分離的實驗思路早有應(yīng)用，“抽黃水”和“打量水”的操作體現(xiàn)得尤為明顯。黃水是釀酒發(fā)酵過程中的一類發(fā)酵產(chǎn)物。隨著發(fā)酵的進(jìn)行，酒醅中未被微生物所利用的水分與微生物代謝生產(chǎn)的水逐漸向下滲透，并伴隨著可溶性淀粉、單寧、酒醅中的有機(jī)酸、酵母浸出物、香味前體物質(zhì)及還原糖等可溶于水的物質(zhì)沉降于窖底，進(jìn)而形成了黃水。黃水的成分十分復(fù)雜，不僅包含了大量的上述可溶性物質(zhì)，還在其中發(fā)現(xiàn)了豐富的微生物菌群以及醇、醛、酸、酯等香味物質(zhì)。抽取黃水在釀酒生產(chǎn)中具有減水，降酸的意義[3]。

糧糟蒸餾后，需要立即加入約85℃的熱水，這一操作被稱為“打量水”。打量水的加入一方面增加糧糟水分，促進(jìn)淀粉的糊化；另一方面降溫過程中蒸汽帶走了糧糟中大量的揮發(fā)酸，然后才進(jìn)行撒曲操作。攤晾也稱揚冷，使出甑的糧糟迅速降低溫度，這一工藝揮發(fā)了部分酸與水分，使得糧糟適宜入窖發(fā)酵。

1 材料與方法

1.1 材料及儀器

菌種：從曲塊中直接挑取的發(fā)酵菌群。

儀器設(shè)備：PHS-3C pH計(上海精科)；FA2004B分析天平(上海精科)；D420生物培養(yǎng)搖床(Thermo Electron)；高效液相色譜儀（Agilent 1200 Series）；自動發(fā)酵罐(BioPAT)；D-37520冷凍離心機(jī)(Thermo Electron)；雙蒸水取水儀 (Thermo Electron)。

發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖100 g/L、酵母浸膏8 g/L、（NH4）2SO45 g/L、KH2PO41.5 g/L、MgSO45 g/L·7H2O 0.55 g/L、CaCl20.15 g/L。

1.2 實驗方法

1.2.1 乙醇發(fā)酵

配制發(fā)酵培養(yǎng)基4 L，BioPAT發(fā)酵罐中滅菌后按1%接種量接種發(fā)酵菌種，220 r/min發(fā)酵72 h，采集實驗過程數(shù)據(jù)，發(fā)酵結(jié)束后離心發(fā)酵液，上清液待測乙醇濃度。

1.2.2 HPLC法測乙醇濃度

取20 μL經(jīng)0.45 μm孔徑的濾膜過濾后進(jìn)行液相檢測，檢測條件：流動相為5 mmol/L H2SO4，流速0.6 mL/min，柱溫25℃。根據(jù)相應(yīng)峰面積在標(biāo)曲中計算乙醇濃度。

1.2.3 乙醇吸附實驗

樹脂、沸石等吸附材料預(yù)處理后，分別稱取等量吸附劑放入三角瓶中，加入相同體積與濃度的溶液，置于一定轉(zhuǎn)速和溫度的搖床中，達(dá)吸附平衡后，測定溶質(zhì)濃度，比較吸附能力。

2 結(jié)果與分析

2.1 乙醇的原位分離實驗

乙醇是一種酶抑制劑，一定濃度的乙醇會阻遏發(fā)酵體系中微生物酶的正常代謝合成；一定量濃度的乙醇對發(fā)酵體系中微生物群有毒副作用。所以我們選擇乙醇作為分離產(chǎn)物進(jìn)行原位分離發(fā)酵研究。

2.1.1 乙醇吸附劑的選擇（表1）

由表1可知，幾種材料中活性炭對乙醇具有最大的吸附容量，缺點是其無差別吸附的選擇性，并且乙醇等被吸附物質(zhì)脫附時阻力較大。而硅質(zhì)巖由于其疏水性較強(qiáng)，如Milestone等人所證實，更適用于對于非極性更強(qiáng)的長鏈醇的吸附，如丁醇、異丁醇、異戊醇等的吸附分離效果較乙醇更佳。并且沸石作為吸附劑對乙醇進(jìn)行原位分離時，因為具有離子交換性，發(fā)酵液中的某些離子會與其進(jìn)行離子交換，從而出現(xiàn)生物不相容性的問題，破壞連續(xù)發(fā)酵體系。常使用吸附樹脂不采用離子交換樹脂進(jìn)行吸附分離的原因是乙醇在發(fā)酵體系中大部分時間表現(xiàn)出非離子狀態(tài)。加之吸附樹脂的優(yōu)良可塑性，即可以通過選擇適當(dāng)?shù)膯误w、交聯(lián)劑和致孔劑對吸附樹脂孔的結(jié)構(gòu)進(jìn)行調(diào)制，再通過化學(xué)手段改變樹脂表面的理化性能，從而有選擇性的合成出乙醇吸附性能優(yōu)良的新型樹脂。這在乙醇吸附分離實際應(yīng)用中極具研究價值，發(fā)展前景十分廣闊[4]。

2.1.2 吸附樹脂的吸附原理（圖1）

醇類的烷基鏈與吸附樹脂上的疏水基團(tuán)具有強(qiáng)烈的相互作用力是吸附樹脂對醇類進(jìn)行吸附的主要作用力。對于醇類而言，疏水性與碳鏈長短相關(guān)，碳鏈越長，也就越容易被吸附[5]，由于乙醇的碳鏈較短，疏水性弱，再加之乙醇分子的極性小于水的極性，吸附樹脂的特性以疏水性中等極性吸附能力為選擇方向。

乙醇的羥基可與樹脂表面酯基形成氫鍵，而乙醇分子的疏水碳鏈與樹脂疏水性表面又以范德華力相互作用，從而將乙醇從醇-水溶液中吸附出來。首先吸附質(zhì)分子通過對流或擴(kuò)散（1）到達(dá)樹脂顆粒的邊界液膜層，然后在液膜層內(nèi)通過薄膜擴(kuò)散（2）到達(dá)樹脂孔隙結(jié)構(gòu)，通過孔隙擴(kuò)散（3a）以及表面擴(kuò)散（3b）到達(dá)樹脂吸附位點，根據(jù)動力學(xué)原理（4）進(jìn)行吸附[6]。

2.1.3 MR 11樹脂的基本理化性質(zhì)

MR 11是一種典型的等極性樹脂，我們選擇其作為乙醇的吸附劑進(jìn)行試驗操作，結(jié)果見表2。

2.1.4 MR 11樹脂的動力學(xué)特性

準(zhǔn)確稱取相同質(zhì)量經(jīng)過預(yù)處理后的吸附樹脂3份放置于三角瓶中，再加入同體積、不同濃度的乙醇溶液，保持相同溫度和轉(zhuǎn)速，直至吸附樹脂吸附平衡。測得吸附前后乙醇的初始濃度Co和平衡濃度Ce，計算吸附容量Q，再以Qe-Ce繪制該樹脂的吸附等溫線。做平行實驗3次，確保實驗準(zhǔn)確性。

表1 各類吸附材料吸附-脫附性能比較

圖1 吸附作用示意圖

表2 MR11樹脂結(jié)構(gòu)及基本參數(shù)

吸附溫度分別取20℃、40℃和60℃ 3個溫度，獲得乙醇溶液于MR 11樹脂上的吸附等溫線。MR 11樹脂對乙醇的吸附平衡數(shù)據(jù)見表3。由圖2可知，吸附量與溶液溫度呈反比，表明樹脂吸附過程是放熱過程。對實驗數(shù)據(jù)分別采用線性等溫線方程、Langmuir-Freundlich等溫線方程進(jìn)行擬合的結(jié)果如下所示。

線性等溫方程式：Qe=HCe

式中：H—亨利常數(shù)，L/g。

Langmuir—Freundlich等溫線方程式：

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式中：a，b——Langmuir-Freundlich等溫線方程常數(shù)，L/g；

n——Langmuir-Freundlich等溫線方程指數(shù)參數(shù)。

由公式可以看出，Langmuir-Freundlich公式是Langmuir公式和Freundlich公式的整合形式。當(dāng)指數(shù)n為1時，公式轉(zhuǎn)變?yōu)長angmuir公式；當(dāng)常數(shù)b的值很小或濃度很低時，變形為Freundlich公式。

可以看出，在20℃、40℃和60℃ 3個溫度條件下，吸附平衡數(shù)據(jù)可以很好的擬合與線性等溫線方程和Langmuir-Freundlich等溫線方程，其中Langmuir-Freundlich等溫線方程的擬合度更高，相關(guān)性系數(shù)可達(dá)到0.9978以上。所以，實驗溫度范圍內(nèi)的乙醇溶液在樹脂MR ll上的吸附平衡數(shù)據(jù)滿足Langmuir-Freundlich等溫線方程。

2.1.5 MR ll樹脂的吸附動力學(xué)研究

準(zhǔn)一階、二階動力學(xué)模型是常用來描述吸附質(zhì)吸附速率快慢的兩組模型。與化學(xué)反應(yīng)的研究內(nèi)容相似，吸附速率可以理解為化學(xué)反應(yīng)的速率。模型使用有效傳質(zhì)系數(shù)來概括溶液吸附過程中的所有傳質(zhì)阻力，該系數(shù)受多種機(jī)理影響。實驗原理為將固定濃度、體積的目標(biāo)物質(zhì)溶液倒入三口燒瓶中，經(jīng)水浴預(yù)熱至實驗要求的溫度后，加入相同質(zhì)量經(jīng)預(yù)處理的吸附樹脂進(jìn)行吸附，立即攪拌計時，間隔一定時間測定溶液濃度Ct。以Ct-t繪制吸附動力學(xué)曲線。

表3 MR 11對乙醇吸附等溫線方程參數(shù)及相關(guān)系數(shù)

圖2 不同溫度下乙醇在MR 11樹脂上吸附的Langmuir-Freundlich模型擬合

分別在20℃和60℃溫度下測定MR ll樹脂在乙醇溶液中的吸附動力學(xué)參數(shù)。MR ll樹脂對乙醇的吸附動力學(xué)擬合結(jié)果見圖3、表4。

圖3 不同溫度下MR 11在乙醇溶液中吸附準(zhǔn)一階、準(zhǔn)二階動力學(xué)模型擬合

準(zhǔn)二階吸附動力學(xué)方程：

式中：K1：準(zhǔn)一階動力學(xué)方程速率常數(shù)，S-1；

表4 不同溫度下MR11在乙醇溶液中吸附的動力學(xué)參數(shù)和相關(guān)系數(shù)

由圖3可見，MRll樹脂對乙醇約5 min即可到達(dá)吸附平衡，表明溶液在較高的流速下也可進(jìn)行吸附操作。此外，準(zhǔn)二階動力學(xué)方程比準(zhǔn)一階方程對吸附數(shù)據(jù)的擬合度高，相關(guān)性系數(shù)也更好，證明實驗溫度范圍內(nèi)，MRll在乙醇溶液中的吸附動力學(xué)更符合準(zhǔn)二階動力學(xué)模型。在20℃和60℃下，吸附過程具有接近的速率常數(shù)，說明吸附速率受溫度影響較小。

2.2 乙醇的發(fā)酵反饋抑制作用

2.2.1 乙醇的搖瓶發(fā)酵模擬

自由發(fā)酵乙醇條件下我們對體系pH值進(jìn)行測定，結(jié)果見圖4。

圖4 自由發(fā)酵過程pH值變化

由圖4可知，酵母菌的發(fā)酵過程體系pH值首先呈下降趨勢，原因是這一階段屬于酵母菌指數(shù)增長期，酵母菌大量代謝產(chǎn)酸以及其他酸性產(chǎn)物，到達(dá)穩(wěn)定期后，酵母菌更多進(jìn)行目的產(chǎn)物的合成即我們所說的酒精以及其他風(fēng)味物質(zhì)發(fā)酵，而此時隨著pH值降低，體系產(chǎn)物過剩以及發(fā)酵底物的大量消耗，酵母菌進(jìn)入衰亡期，同時進(jìn)行大量的菌體自溶，釋放胞液；其次，隨著體系內(nèi)還原糖的消耗，酵母菌開始利用有機(jī)酸作為碳源持續(xù)釋放鈉離子，與此同時，利用菌體自溶釋放的氨基酸作為碳源合成銨離子，所以發(fā)酵后期的pH值持續(xù)升高。

圖5 不同初始乙醇濃度下酵母菌的生長曲線

由圖5可知，適宜的乙醇濃度對于酵母菌的生長具有促進(jìn)作用，從生長曲線來看，能夠較快度過指數(shù)期，進(jìn)入穩(wěn)定期，此時菌群數(shù)量達(dá)到最大，進(jìn)入發(fā)酵期獲得最大的發(fā)酵速率，同時減少了指數(shù)增長期的次級代謝產(chǎn)物以及消耗的底物碳氮源等成分。

由圖6可看出，過低的pH值會影響發(fā)酵菌群菌體的生長，在不改變pH值與發(fā)酵產(chǎn)物濃度情況下，會大量導(dǎo)致菌體死亡，pH5時，還原糖的消耗主要用于菌體生長，所以過高的pH值會讓還原糖更多的用于菌體自身代謝發(fā)育。

由圖7可看出，在發(fā)酵初期，pH值均會經(jīng)歷一個下降的過程，此發(fā)酵過程的生物量處于一個較低的水平，還原糖的消耗加快，A中較低的乙醇含量使生物量獲得了較快的增長速度，但后期發(fā)酵體系過低的pH值又使發(fā)酵體系內(nèi)生物量迅速下降，而菌體死亡時胞內(nèi)釋放的胺類物質(zhì)使整個體系pH值回升；BC中，發(fā)酵過程接近，發(fā)酵液經(jīng)測定也獲得了最大的乙醇產(chǎn)率；D中盡管發(fā)酵菌群發(fā)育最快，但后期發(fā)酵體系pH值偏高，這讓其生物量無法始終維持在一個較高的水平，并且乙醇含量過高導(dǎo)致發(fā)酵菌體提前進(jìn)入衰亡期，可能是乙醇的反饋抑制作用影響了菌群的發(fā)育過程，而菌體的死亡又使后期發(fā)酵體系的pH值保持在較高的水平（4.5左右）。

2.2.2 發(fā)酵體系的發(fā)酵效率與比發(fā)酵量（圖8、圖9、圖10）

圖6 pH值對于整個發(fā)酵體系影響

圖7 乙醇初始濃度對于整個發(fā)酵體系影響

圖8 初始乙醇含量對發(fā)酵影響（72 h計）

引入比發(fā)酵量和發(fā)酵效率兩個新概念，比較不同發(fā)酵體系乙醇濃度與體系內(nèi)生物量、還原糖消耗的關(guān)系，轉(zhuǎn)變以往直觀檢測乙醇濃度評價發(fā)酵體系的舊思路，注重分析發(fā)酵過程中發(fā)酵菌的發(fā)酵能力以及體系內(nèi)碳源轉(zhuǎn)化為乙醇的效率，目的在于開發(fā)舊有發(fā)酵模式的內(nèi)在潛力以及調(diào)控空間。

圖9 不同乙醇初始濃度下發(fā)酵體系的菌體比發(fā)酵量與發(fā)酵效率

圖10 乙醇的反饋抑制作用及MR 11原位分離發(fā)酵

結(jié)果表明，乙醇產(chǎn)量與初始乙醇濃度呈正比，與還原糖的利用率不相關(guān)，當(dāng)乙醇濃度為5%時，發(fā)酵體系獲得最大的發(fā)酵底物利用率和生物量，當(dāng)乙醇濃度到達(dá)6%時，還原糖利用率開始降低，乙醇的產(chǎn)量提高不明顯，這是因為高濃度乙醇會抑制酵母菌的合成代謝，隨著乙醇濃度的不斷增加，比發(fā)酵量呈上升趨勢，這表明，隨著乙醇濃度增加，一方面菌體生長受到抑制，另一方面更多的碳源參與菌體本身代謝活動以及其他代謝途徑。

由圖10可知，乙醇的反饋抑制作用并不十分明顯，添加乙醇后，發(fā)酵總乙醇濃度為3.31 g/L，不添加乙醇的發(fā)酵產(chǎn)量約為1.41 g/L。而添加了MR ll樹脂的發(fā)酵產(chǎn)量達(dá)到了1.76 g/L，產(chǎn)量提高了24.8%，原位分離發(fā)酵實驗的比發(fā)酵量為0.92，較空白對照0.86提高了18.8%，發(fā)酵效率則提高了13.38%。

3 總結(jié)

由于乙醇對于發(fā)酵體系具有反饋抑制作用，所以引入原位分離技術(shù)對發(fā)酵體系具有積極的調(diào)節(jié)作用，實驗通過對技術(shù)原理的分析，選取適宜的吸附分離材料，并通過實驗室搖瓶實驗驗證了其可行性，并預(yù)期實現(xiàn)以下兩點效果：

（1）縮短發(fā)酵時間：采用適當(dāng)措施對發(fā)酵過程進(jìn)行干涉，即發(fā)酵過程中適當(dāng)分離出部分乙醇及其他發(fā)酵產(chǎn)物，一方面促進(jìn)酵母菌生長（去反饋抑制效應(yīng)，控制體系pH值），另一方面由于產(chǎn)物的分離從而加速了發(fā)酵體系正向反應(yīng)速率。

（2）對發(fā)酵底物更加充分利用，實驗表明，采用原位分離技術(shù)，發(fā)酵體系內(nèi)菌群總量增加17.4%，還原糖的利用率得到有效的提高，比發(fā)酵量提高18.8%，發(fā)酵效率則提高了13.38%。

但是也應(yīng)該認(rèn)識到釀酒相對于其他發(fā)酵工藝有很多獨特的地方，比如繁多的發(fā)酵菌體系，復(fù)合的發(fā)酵底物，復(fù)雜的發(fā)酵產(chǎn)物，所以很多實驗室研究方法無法模擬現(xiàn)實生產(chǎn)的復(fù)雜情況，而這也是賦予白酒豐富風(fēng)味的重要因素，實驗室研究無法兼顧到其他風(fēng)味物質(zhì)的影響。而且原位分離裝置的引入生產(chǎn)也是一個十分重要的過程，不然研究只能流于表面，難以獲得實質(zhì)的進(jìn)展。

白酒的釀酒工藝經(jīng)過幾千年的發(fā)展與前人不懈的鉆研研究，已經(jīng)具有了一個完整的科學(xué)系統(tǒng)理論體系，應(yīng)該說白酒行業(yè)是一個摻雜著傳統(tǒng)工藝與現(xiàn)代科學(xué)的綜合產(chǎn)業(yè)，縱觀白酒工藝的發(fā)展，在傳統(tǒng)工藝的基礎(chǔ)上，從事白酒行業(yè)的科研人員一直不斷地對其理論與操作進(jìn)行研究，借鑒同行業(yè)的經(jīng)驗包括相關(guān)行業(yè)的優(yōu)秀成果，對于企業(yè)的文化與科研建設(shè)具有重要的意義。