童 行，何衛(wèi)陽

(重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院泌尿外科，重慶 400016)

在真核生物的生長發(fā)育中，自噬是一重要環(huán)節(jié)，其對于維持細胞穩(wěn)定有著重要意義。根據(jù)底物的降解途徑不同，自噬可分為大自噬、小自噬、分子伴侶介導(dǎo)自噬。通常細胞會有一定水平但活性較低的基礎(chǔ)自噬，在一些應(yīng)激因素(饑餓、缺氧、炎癥、藥物)刺激下，細胞的自噬活性可明顯增加。自噬過程發(fā)生異常，細胞在很多方面，如能量代謝、侵襲轉(zhuǎn)移等方面也會發(fā)生異常。研究表明EMT是腫瘤細胞侵襲轉(zhuǎn)移的重要機制之一，但目前自噬對上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)的影響以及具體機制還不清晰，有待進一步總結(jié)探討。故本文就自噬在腫瘤細胞EMT以及侵襲轉(zhuǎn)移機制中的作用進行綜述。

1 自噬分類

根據(jù)底物的降解途徑不同，自噬可分為大自噬、小自噬、分子伴侶介導(dǎo)自噬。

1.1 大自噬相對于其他兩種自噬途徑，大自噬的研究較為深入。自噬體的形成是大自噬的鑒別特征。在應(yīng)激因素(饑餓、缺氧、炎癥、藥物等)刺激下，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)來源的雙層膜形成，其向外周伸展，該過程即為自噬前體的形成。自噬前體進一步伸展包裹降解底物(可溶蛋白、細胞器等)，該過程即為自噬體的形成。最后，自噬體與溶酶體結(jié)合形成自噬溶酶體，進而降解底物為細胞生存提供所需物質(zhì)[1]。

1.2 小自噬在哺乳動物中，小自噬研究較少。膜的直接形變包裹底物是其鑒別特征。小自噬可分為非選擇性小自噬、選擇性小自噬和內(nèi)體小自噬。非選擇性小自噬表現(xiàn)為非特異性底物直接刺激膜發(fā)生內(nèi)凹，底物進一步從內(nèi)凹處吸收降解。特定的底物(線粒體、細胞核等)降解是選擇性小自噬的主要特點，特定底物先與膜伸出的凸起結(jié)合形成內(nèi)陷小泡，進一步被吸收降解。細胞內(nèi)多泡體的形成是內(nèi)體小自噬的主要特征，其和降解底物的循環(huán)相關(guān)。降解底物通過多泡體、溶酶體被降解[2]。

1.3 分子伴侶介導(dǎo)自噬分子伴侶介導(dǎo)自噬是底物蛋白被分子伴侶識別后運送至溶酶體內(nèi)降解的過程，沒有小泡參與底物降解是分子伴侶介導(dǎo)自噬的鑒別特征。首先，熱休克蛋白70(heat shock protein 70，HSP70)和熱休克蛋白90(heat shock protein 90，HSP90)、熱休克蛋白40(heat shock protein 40，HSP40)等輔助分子選擇性識別底物蛋白中的特定氨基酸序列KFERQ，與之結(jié)合形成復(fù)合物，并使底物蛋白去折疊。該復(fù)合物通過溶酶體相關(guān)膜蛋白2A(lysosome associated membrane protein，LAMP2A)被轉(zhuǎn)運至溶酶體內(nèi)進行降解[3]。已有研究表明，LAMP2A與分子伴侶介導(dǎo)自噬的激活程度正相關(guān)，LAMP2A高表達，則分子伴侶介導(dǎo)自噬的激活程度高[4]。所以LAMP2A被認為是分子伴侶介導(dǎo)自噬的關(guān)鍵調(diào)控蛋白。

2 EMT與侵襲轉(zhuǎn)移

EMT主要分為3個類型，Ⅰ型與胚胎的發(fā)育、器官的形成有關(guān)，Ⅱ型與組織再生、器官發(fā)育有關(guān)，Ⅲ型和腫瘤發(fā)生進展有關(guān)[5]。原始部位的腫瘤細胞發(fā)生Ⅲ型EMT，腫瘤細胞的上皮細胞特性慢慢開始喪失，細胞之間的粘附作用進一步降低，這是EMT侵襲轉(zhuǎn)移機制的關(guān)鍵步驟。然后，細胞從基底膜脫落，獲得間葉細胞特性，因而侵襲運動能力增加。這些具有侵襲運動能力的細胞最終將侵入血管轉(zhuǎn)移至遠處形成新的病灶[6]。盡管已有研究表明，不是所有上皮性腫瘤細胞都需要轉(zhuǎn)變至間充質(zhì)細胞狀態(tài)來形成轉(zhuǎn)移灶[7-8]，但是EMT仍是細胞侵襲轉(zhuǎn)移機制的研究重點。

EMT表現(xiàn)為上皮細胞的特征消失，其相關(guān)蛋白E-鈣粘蛋白、細胞角蛋白、α-連環(huán)蛋白、β-連環(huán)蛋白表達下降；間充質(zhì)細胞相關(guān)蛋白N-鈣粘蛋白、波形蛋白、纖連蛋白等表達上升[9]。這些特異標志物的變化也是實驗檢測EMT發(fā)生進展的基礎(chǔ)。

EMT通過多條信號途徑影響腫瘤細胞的侵襲轉(zhuǎn)移，比如轉(zhuǎn)化生長因子β(transforming growth factor-β，TGF-β)信號途徑、Wnt信號途徑、Notch信號途徑、Hedgehog信號途徑、整合素連接激酶(inte-grin-linked kinase，ILK)信號途徑等[10-12]。這些途徑之間也存在著相互聯(lián)系，協(xié)同上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化的進展。

3 不同類型自噬對EMT的作用

3.1 大自噬對EMT的作用目前，大自噬對腫瘤細胞EMT的作用機制還不完全明確，在不同的細胞中，自噬通過不同的信號途徑對EMT發(fā)揮著重要的作用。

3.1.1大自噬對EMT的促進作用

3.1.1.1TGF-β 在腫瘤細胞生理、病理進程中，TGF-β是誘發(fā)EMT的重要的因子。外源重組的TGF-β細胞因子可以刺激許多腫瘤細胞系發(fā)生EMT[13-14]。一般認為TGF-β可以通過Smad、c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase，JNK)等途徑上調(diào)BECN1、自噬相關(guān)基因(autophagy-related gene，ATG) 5、7等從而上調(diào)自噬[15]。另外，我們研究團隊發(fā)現(xiàn)，在膀胱癌細胞株中，饑餓處理細胞6 h誘導(dǎo)的大自噬可促進TGF-β1分泌增加，TGF-β1作為配體與膜上的Ⅱ型受體結(jié)合，使Ⅰ型受體激活，進而使轉(zhuǎn)錄激活因子Smad 2、Smad3發(fā)生磷酸化，磷酸化后的Smad 2、Smad3可以與Smad4形成復(fù)合體進入細胞核內(nèi)，調(diào)控靶基因表達，促進EMT進展，進一步促進膀胱癌細胞侵襲轉(zhuǎn)移能力(圖1)[16]。

圖1 饑餓誘導(dǎo)大自噬促進膀胱癌細胞株EMT進展

饑餓處理膀胱癌細胞株，誘導(dǎo)的大自噬可促進TGF-β1分泌增加，TGF-β1作為配體與膜上的Ⅱ型受體結(jié)合，使Ⅰ型受體激活，進而使轉(zhuǎn)錄激活因子Smad 2、Smad3發(fā)生磷酸化，磷酸化后的Smad 2、Smad3可以與Smad4形成復(fù)合體進入細胞核內(nèi)，調(diào)控靶基因表達，促進EMT進展，進一步促進膀胱癌細胞侵襲轉(zhuǎn)移能力。

在頭頸部鱗狀細胞癌中，CHEN等[17]應(yīng)用外源的重組TGF-β1細胞因子處理細胞，發(fā)現(xiàn)TGF-β1在誘發(fā)EMT增強細胞侵襲遷移能力的同時也誘導(dǎo)了自噬的發(fā)生，抑制自噬后，EMT也被抑制，細胞侵襲遷移減弱。說明了在頭頸鱗癌中，自噬對TGF-β1誘導(dǎo)的EMT正性調(diào)控。在肝癌細胞中，TGF-β2在誘導(dǎo)細胞發(fā)生EMT增強侵襲轉(zhuǎn)移的同時也能誘導(dǎo)自噬的發(fā)生，抑制自噬后，其對EMT的促進作用也受到了抑制。說明在肝癌細胞中，自噬對TGF-β2誘導(dǎo)的EMT正性調(diào)控，其機制可能與抑制自噬后導(dǎo)致細胞內(nèi)活性氧(reactive oxygen species，ROS)水平增加有關(guān)[18]。

3.1.1.2Notch信號途徑 Notch信號通路與細胞的增殖、分化、凋亡以及侵襲轉(zhuǎn)移等過程密切相關(guān)，也是EMT發(fā)生的重要途徑之一[19]。在非小細胞肺癌細胞株A549中，用無血清培養(yǎng)基饑餓處理細胞可誘導(dǎo)自噬發(fā)生的同時也明顯促進EMT的發(fā)生，并且細胞遷移能力增強。通過沉默Atg3抑制自噬后，其遷移能力下降，EMT相關(guān)標志物逆轉(zhuǎn)以及Notch、snail蛋白的表達明顯降低；說明自噬通過Notch/snail信號通路對EMT正性調(diào)控[20]。

3.1.1.3Hedgehog信號途徑 Hedgehog信號途徑主要參與胚胎細胞的生長分化，在胚胎發(fā)育過程中起著重要的調(diào)控作用。同時Hedgehog信號途徑同樣參與腫瘤的進展，其也是EMT發(fā)生的重要途徑之一[21]。有研究表明，在膀胱癌細胞中，辣椒素(capsaicinoids，CPS)可以通過誘導(dǎo)自噬激活Hedgehog信號途徑從而促進EMT的發(fā)生[22]。

3.1.1.4自噬通過其他途徑促進EMT 鞘氨醇激酶1(sphingosine kinase1，SPHK1)是一種鞘氨醇代謝酶，可以通過多途徑影響腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移能力，比如SPHK1通過促進表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor,EFGR)通路激活從而促進食管癌細胞侵襲轉(zhuǎn)移[23]；SPHK1通過促進PTK2/FAK通路激活促進結(jié)腸癌細胞侵襲轉(zhuǎn)移[24]。LIU等[25]發(fā)現(xiàn)，在肝癌細胞中，SPHK1誘導(dǎo)EMT增強侵襲轉(zhuǎn)移能力的同時也能誘導(dǎo)自噬發(fā)生。在過表達SPHK1增強侵襲遷移的同時應(yīng)用3-甲基腺嘌呤、氯喹抑制自噬，EMT相關(guān)標志物逆轉(zhuǎn)且遷移侵襲能力降低。表明在肝細胞癌中，SPHK1誘導(dǎo)EMT發(fā)生與自噬相關(guān)，且自噬正性調(diào)控EMT，其具體機制與自噬促進上皮鈣黏蛋白基因1(cadherin1，CDH1)的降解密切相關(guān)。CDH1是上皮鈣黏蛋白編碼基因，其表達下降是EMT發(fā)生的基礎(chǔ)。胰腺癌細胞中，低氧在誘導(dǎo)自噬的同時促進EMT發(fā)生并增強細胞的遷移能力；應(yīng)用3MA抑制自噬或干擾低氧誘導(dǎo)因子-1α(hypoxia-inducible factor-1α，HIF-1α)后，細胞遷移能力下降，EMT相關(guān)蛋白標志物逆轉(zhuǎn)。說明在胰腺癌細胞中，低氧通過HIF-1α誘導(dǎo)的自噬正性調(diào)控EMT[26]。乳腺癌相關(guān)成纖維細胞(carcinoma-associated fibroblasts，CAFs)能促進乳腺癌細胞的侵襲、轉(zhuǎn)移，其部分是通過誘導(dǎo)自噬，促進EMT完成的[27]。在缺氧條件下，長鏈非編碼氨基甲酰磷酸合成酶1(long non-coding carbamoyl phosphate synthetase 1,lncRNA CPS1)可抑制結(jié)直腸癌細胞EMT與侵襲轉(zhuǎn)移，其可能是通過lncRNA CPS1抑制 HIF-1α，從而抑制缺氧誘導(dǎo)的自噬完成的[28]。其表明自噬正性調(diào)控結(jié)直腸癌EMT，lncRNA CPS1通過抑制自噬進而抑制了細胞的EMT進展。

3.1.2大自噬對上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化的抑制作用

3.1.2.1Wnt信號途徑 前文提到EMT通過TGF-β、Notch、Hedgehog、Wnt等多條信號途徑影響腫瘤細胞的侵襲轉(zhuǎn)移，其中自噬可以正性調(diào)控TGF-β、Notch、Hedgehog信號途徑促進EMT進展。而對于Wnt信號途徑，有研究表明自噬對其則是負性調(diào)控來影響EMT。在結(jié)腸癌細胞中，雷帕霉素和饑餓處理誘導(dǎo)自噬后，Wnt信號通路的關(guān)鍵誘導(dǎo)因子Wnt3a表達下降，用3MA抑制自噬后，饑餓處理對Wnt3a的抑制作用得到逆轉(zhuǎn)，說明了自噬可以負性調(diào)節(jié)Wnt信號通路進而影響EMT[29]。

3.1.2.2P62蛋白 P62蛋白對于腫瘤的進展、炎癥反應(yīng)以及一些代謝相關(guān)疾病都發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用，也是自噬降解的一種選擇性底物蛋白，可以起到接頭蛋白調(diào)節(jié)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的作用。有研究表明，在小鼠黑色素瘤細胞中，抑制自噬能促進EMT：敲除Atg3、Atg5、Atg9、Atg12抑制自噬后，P62表達增加，E-鈣黏蛋白表達下降，同時細胞侵襲轉(zhuǎn)移能力增強。這里自噬負性調(diào)控EMT與P62對TWIST1的正性調(diào)控有關(guān)，TWIST1是EMT的重要調(diào)控因子，具有抑制腫瘤細胞E-鈣黏蛋白的作用[30]。

3.1.2.3SNAIL轉(zhuǎn)錄因子 SNAIL轉(zhuǎn)錄因子和前文提到的TWIST1都是誘導(dǎo)EMT發(fā)生的關(guān)鍵性調(diào)控因子和始動因素。在膠質(zhì)母細胞瘤中，饑餓處理或應(yīng)用雷帕霉素后，自噬被誘導(dǎo)，細胞遷移侵襲能力下降，抑制自噬后其遷移侵襲能力上升。其具體機制與自噬對SNAIL的抑制有關(guān)，自噬被誘導(dǎo)后，抑制SNAIL表達，其對鈣黏蛋白的抑制解除，鈣黏蛋白表達增加，細胞進而獲得上皮樣表形[31]。

3.1.2.4BECN1對EMT的直接作用 BECN1是自噬的特異基因，是自噬的關(guān)鍵啟動因素。在乳腺癌細胞中發(fā)現(xiàn)死亡效應(yīng)結(jié)構(gòu)域DNA結(jié)合蛋白(death effector domain DNA-binging protein,DEDD)能直接與BECN1復(fù)合體結(jié)合，穩(wěn)定磷酸肌醇-3-激酶3 (Phosphoinositide-3-Kinase Class 3，PIK3C3)，促進BECN1與PIK3C3的相互作用，誘導(dǎo)自噬發(fā)生，進而抑制EMT和細胞侵襲轉(zhuǎn)移[32]。

3.1.2.5自噬通過其他途徑抑制EMT 有學(xué)者認為，在腫瘤進展過程中細胞骨架與線粒體是自噬和EMT相互作用的橋梁。EMT的激活可使細胞骨架聚合和重塑，進而促進線粒體裂解進一步維持EMT和細胞遷移。但自噬的大量激活可誘導(dǎo)線粒體重建，導(dǎo)致游離線粒體減少，進而抑制細胞EMT進程和遷移[33]。

3.2 分子伴侶介導(dǎo)自噬對EMT的作用分子伴侶介導(dǎo)自噬和大自噬一樣，在一些應(yīng)激因素刺激下，都會被誘導(dǎo)。已有研究表明分子伴侶介導(dǎo)自噬對于腫瘤的生存、進展起著重要作用。KON等[34]首先驗證了在多種腫瘤細胞株中，分子伴侶介導(dǎo)自噬具有高活性，然后在肺癌細胞株中，沉默分子伴侶介導(dǎo)自噬的限速蛋白LAMP2A后，分子伴侶介導(dǎo)自噬活性降低，腫瘤細胞的增殖、遷移能力也明顯下降。另外有研究發(fā)現(xiàn)，分子伴侶介導(dǎo)自噬活性的減弱會導(dǎo)致P65降解受損，而逐漸積累的P65會增加核因子κB(nuclear factor kappa-B，NF-κB)的活性，進一步促進EMT的進展[35]。分子伴侶介導(dǎo)自噬對腫瘤細胞EMT的作用以及具體機制尚不完全明確，還有待進一步研究。

3.3 小自噬對EMT的作用相對于其他兩種類型自噬，小自噬的研究較為淺顯。特別是在哺乳動物的腫瘤細胞中，小自噬研究較少。目前關(guān)于小自噬的研究大多集中在其形態(tài)學(xué)方面，其對腫瘤細胞侵襲轉(zhuǎn)移作用以及其對EMT作用還有待進一步研究。

4 總結(jié)與展望

在早期階段，自噬通過誘導(dǎo)線粒體重塑并去除受損和有毒性物質(zhì)來抑制腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移。腫瘤進展到晚期，自噬又可通過協(xié)助腫瘤細胞應(yīng)對外界刺激，獲得更頑強的生存能力以及更強的侵襲轉(zhuǎn)移能力。自噬可能以不同的分子機制在腫瘤上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化侵襲轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮著“雙重作用”(圖2)。研究表明，自噬作為一種細胞自我保護機制，對許多腫瘤化療藥耐藥的形成至關(guān)重要，抑制這種保護性自噬后，藥物敏感性增加[36-37]。但是，在抑制自噬增強化療藥敏感性的同時，抑制自噬對腫瘤細胞上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化以及侵襲轉(zhuǎn)移是否也是抑制作用？即靶向調(diào)控自噬，是否在多方面對腫瘤的治療起到協(xié)同作用，這還需要進一步的探討。

圖2 自噬以不同的分子機制對EMT的作用

現(xiàn)階段關(guān)于自噬對腫瘤細胞上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化作用的研究還處于初步階段，分子伴侶介導(dǎo)自噬和小自噬對EMT以及侵襲轉(zhuǎn)移機制的研究并未深入。進一步探討不同腫瘤、不同誘導(dǎo)因素誘導(dǎo)的自噬對EMT的作用以及3種自噬功能的交互聯(lián)系，明確其關(guān)鍵調(diào)節(jié)點的信號通路，針對不同腫瘤靶向調(diào)控自噬，將有可能為個性化的抑制腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移尋找新的思路。