魏正茂，范龍龍，李維清 ，歐龍華，王 燕，李學(xué)松，周利群，史本濤

(1.北京大學(xué)深圳醫(yī)院泌尿外科，廣東深圳 518036；2.中山大學(xué)第八附屬醫(yī)院泌尿外科，廣東深圳 518033；3.深圳大學(xué)第一附屬醫(yī)院泌尿外科，廣東深圳 518035；4.深圳北京大學(xué)香港科技大學(xué)醫(yī)學(xué)中心，廣東深圳 518036；5.北京大學(xué)第一醫(yī)院泌尿外科,北京大學(xué)泌尿外科研究所,北京 100034)

上尿路尿路上皮癌(the upper tract urothelial carcinoma，UTUC)指發(fā)生于腎盂及輸尿管的尿路上皮惡性腫瘤，約占全部尿路上皮癌5%～10%，而且90%以上UTUC源自于移行上皮，是臨床上相對(duì)少見但潛在致死率較高的惡性腫瘤[1-2]。根治性腎盂輸尿管切除術(shù)(radical nephroureterectomy，RNU)是治療UTUC的手術(shù)金標(biāo)準(zhǔn)，然而術(shù)后仍有部分患者病情繼續(xù)進(jìn)展，出現(xiàn)復(fù)發(fā)，最終導(dǎo)致治療失敗。因此，UTUC的早期診斷和整個(gè)尿路的長(zhǎng)期密切隨訪尤為重要，尋找一個(gè)更能準(zhǔn)確反映UTUC生物學(xué)特性及疾病預(yù)后的分子標(biāo)記物對(duì)UTUC患者預(yù)后的判斷及術(shù)后治療方式的選擇具有重要的臨床應(yīng)用價(jià)值。

核轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因2(karyopherin a2，KPNA2)是一種具有核定位信號(hào)區(qū)域的接頭蛋白，作為核孔靶向復(fù)合物的組成部分，與核定位信號(hào)結(jié)合運(yùn)輸?shù)鞍踪|(zhì)進(jìn)入核內(nèi)發(fā)揮作用，調(diào)節(jié)效應(yīng)基因的表達(dá)，與細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化密切相關(guān)[3]。我們的前期研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，KPNA2能夠促進(jìn)膀胱癌細(xì)胞的增殖和侵襲，且KPNA2異常高表達(dá)與膀胱癌患者的不良預(yù)后有關(guān)[4-5]。然而，KPNA2在上尿路尿路上皮癌中的表達(dá)水平及其具體的作用尚未清楚。因此，本研究通過檢測(cè)KPNA2在上尿路尿路上皮癌組織中的表達(dá)水平，探討其與UTUC患者臨床病理參數(shù)及預(yù)后之間的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料152例上尿路尿路上皮癌組織及其對(duì)應(yīng)的癌旁正常上尿路上皮組織石蠟切片，均取自2002年1月至2010年12月期間在北京大學(xué)第一醫(yī)院泌尿外科行根治性患側(cè)腎、輸尿管全長(zhǎng)、膀胱袖狀切除手術(shù)所得標(biāo)本。根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，參照國(guó)內(nèi)學(xué)者胥維勇等[6]的方法，在北京大學(xué)第一醫(yī)院病理科制作完成19個(gè)組織微陣列蠟塊，共計(jì)380個(gè)位點(diǎn)(每個(gè)蠟塊取2個(gè)位點(diǎn))。包含120例上尿路尿路上皮癌組織的商品化組織芯片(產(chǎn)品編碼：HRaU-Uro120Sur-01)，購(gòu)于上海芯超生物科技有限公司。

在全部272例上尿路尿路上皮癌患者中，腎盂癌167例，輸尿管癌105例。年齡分布為 29～86歲，平均(64.59±12.37)歲。隨訪時(shí)間12～108個(gè)月，平均36個(gè)月。所有患者臨床資料完整，術(shù)前均未接受任何化療或者放療，術(shù)后病理證實(shí)均是上尿路移行細(xì)胞癌。腫瘤分期依據(jù)2010年國(guó)際抗癌協(xié)會(huì)TNM 分期標(biāo)準(zhǔn)(第7版)，腫瘤分級(jí)采用1973年WHO標(biāo)準(zhǔn)。本研究得到了醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)通過(批準(zhǔn)號(hào)：2014-113)。

1.2 主要試劑和儀器KPNA2兔抗人多克隆抗體(ab84440)購(gòu)自英國(guó)Abcam公司。即用型SP系列免疫組織化學(xué)檢測(cè)試劑盒(SP-9001)購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。10%正常山羊血清、一抗稀釋液、中性樹膠、蘇木素染液、EDTA抗原修復(fù)液、10%甲醛和1%鹽酸乙醇購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。組織芯片制作儀、石蠟切片機(jī)購(gòu)自德國(guó)Leica公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法嚴(yán)格按照免疫組化二步法操作說明進(jìn)行實(shí)驗(yàn)：將組織芯片采用二甲苯脫蠟，梯度乙醇逐級(jí)水化。3%H2O2室溫孵育10～15 min，消除內(nèi)源性過氧化物酶的活性。pH值8.0的EDTA抗原修復(fù)液高溫加熱修復(fù)抗原。加1∶1 600稀釋的KPNA2抗體4 ℃過夜，磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered solution，PBS)洗3次，10 min/次。加入帶有生物素標(biāo)記的二抗(1∶5000)，37 ℃孵育40 min。加入鏈霉素抗生物蛋白一過氧化物酶溶液，37 ℃孵育35 min，再次PBS洗3次，10 min/次。加入二氨基聯(lián)苯胺(Diaminobenzidine，DAB)試劑，顯微鏡下觀察并及時(shí)終止反應(yīng)。蘇木素復(fù)染，1%鹽酸乙醇分化，溫水返藍(lán)。常規(guī)乙醇梯度脫水、透明、中性膠封片。置于光學(xué)顯微鏡下分析染色結(jié)果。以PBS代替一抗作陰性對(duì)照，以試劑盒陽(yáng)性片作為陽(yáng)性對(duì)照。

1.4 結(jié)果判定所有病理染色標(biāo)本均由2名病理醫(yī)師盲法閱片，每張組織切片隨機(jī)選取10個(gè)高倍視野并計(jì)數(shù)(×400)。判斷標(biāo)準(zhǔn)：KPNA2陽(yáng)性染色表現(xiàn)為細(xì)胞核中出現(xiàn)棕黃色或棕褐色顆粒。依據(jù)染色的強(qiáng)度和陽(yáng)性百分比評(píng)定分?jǐn)?shù)。

染色強(qiáng)度(I)評(píng)分：0分指無(wú)色，1分指淡黃色，2分指棕黃色，3分指棕褐色。陽(yáng)性細(xì)胞所占的百分比計(jì)算分?jǐn)?shù)(P)：<5%為0分，5%～25%為1分，26%～50%為2分,>50%為3分。采用積分法，即總的評(píng)分按照P×I計(jì)算，乘積≥4分為高表達(dá)，<4分為低表達(dá)。

2 結(jié) 果

2.1 KPNA2蛋白在上尿路尿路上皮癌和癌旁組織中的表達(dá)在152例上尿路尿路上皮癌及其對(duì)應(yīng)的癌旁組織的組織芯片免疫組化結(jié)果中，有6例癌組織切片脫片，最終得到146例上尿路尿路上皮癌和配對(duì)癌旁組織的免疫組化結(jié)果。在120例UTUC商品化的組織芯片免疫組化結(jié)果中，有1例癌組織脫片，最終得到119例上尿路尿路上皮癌組織的免疫組化結(jié)果?？傆?jì)獲得265例上尿路尿路上皮癌組織的免疫組化結(jié)果和146例癌旁組織的免疫組化結(jié)果。

免疫組化結(jié)果顯示，KPNA2蛋白染色主要定位于細(xì)胞核，陽(yáng)性細(xì)胞呈棕黃色或棕褐色顆粒(圖1A、1B)。在265例癌組織標(biāo)本中，高表達(dá)數(shù)為197例；在146例癌旁組織標(biāo)本中，高表達(dá)數(shù)為36例。KPNA2蛋白在上尿路尿路上皮癌組織中的高表達(dá)率(74.34%)明顯高于其對(duì)應(yīng)的癌旁組織中的高表達(dá)率(24.66%)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，表1)。

表1 UTUC和癌旁組織中KPNA2蛋白的表達(dá)水平比較

圖1 KPNA2蛋白在UTUC和正常上尿路上皮組織中的表達(dá)(×200)

A:UTUC組織；B：正常上尿路上皮組織。

2.2 KPNA2蛋白表達(dá)與UTUC患者臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系通過對(duì)KPNA2蛋白的表達(dá)水平與患者的臨床病理參數(shù)進(jìn)一步研究分析發(fā)現(xiàn)：UTUC患者癌組織中KPNA2蛋白表達(dá)水平與患者T分期(P=0.000)、G分級(jí)(P=0.033)和術(shù)后有無(wú)膀胱復(fù)發(fā)(P=0.004)有關(guān)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。而與患者的年齡(P=0.265)、性別(P=0.312)、腫瘤大小(P=0.582)和腫瘤邊側(cè)(P=0.386)無(wú)關(guān)，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，表2)。

表2 KPNA2蛋白表達(dá)與UTUC患者臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系

2.3KPNA2蛋白表達(dá)與UTUC患者生存率之間的關(guān)系 共隨訪265例患者，其中失訪1例，在264例UTUC患者中，KPNA2高表達(dá)患者5年總體生存率為64.80%(127/196),明顯低于KPNA2低表達(dá)患者5年總體生存率80.88%(55/68),統(tǒng)計(jì)分析證實(shí),KPNA2的表達(dá)水平與患者的預(yù)后有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.014,圖2)。

圖2 KPNA2蛋白表達(dá)水平與UTUC患者生存率之間的關(guān)系

3 討 論

KPNA2(karyopherin a2)基因位于人染色體17q24.2，全長(zhǎng)約14 459 bp，其編碼產(chǎn)物是含529個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)，分子量為62 ku。KPNA2蛋白是karyopherin a/importin a輸入蛋白家族一員[7-8]，作為生物大分子物質(zhì)核質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)過程中一種重要的核轉(zhuǎn)運(yùn)受體蛋白，在乳腺癌、肺癌、卵巢癌、前列腺癌、胃癌、肝癌、膀胱癌等多種惡性腫瘤中高表達(dá)，與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，而且與患者的不良預(yù)后有關(guān)[9-14]。目前，國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)中尚無(wú)關(guān)于KPNA2在上尿路尿路上皮癌的研究報(bào)告，因此，探討KPNA2在UTUC中的表達(dá)水平、臨床意義及其對(duì)腫瘤細(xì)胞生物學(xué)行為的影響，可為UTUC發(fā)病機(jī)理的闡述、早期診斷、以及預(yù)后評(píng)估提供新思路。

本研究使用組織芯片和免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)265例UTUC組織和146例癌旁正常尿路上皮組織中KPNA2的表達(dá)情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)KPNA2蛋白主要定位在細(xì)胞核中，與其他惡性腫瘤中的表達(dá)情況相似[9-10]。KPNA2蛋白高表達(dá)率在UTUC組織標(biāo)本中為74.34%，在癌旁組織標(biāo)本中為24.66%,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),提示KPNA2的異常表達(dá)可能與UTUC發(fā)生、發(fā)展有關(guān)。

根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果接下來(lái)分析了KPNA2蛋白表達(dá)與UTUC臨床病理特征之間的關(guān)系，結(jié)果發(fā)現(xiàn)KPNA2在UTUC組織中的表達(dá)與患者的T分期、G分級(jí)和術(shù)后膀胱復(fù)發(fā)有關(guān)，與患者的年齡(P=0.265)、性別(P=0.312)、腫瘤大小(P=0.582)和腫瘤邊側(cè)(P=0.386)無(wú)關(guān)。KPNA2的表達(dá)強(qiáng)度隨著T分期的增高和組織分化程度的變化呈現(xiàn)逐漸高表達(dá)趨勢(shì),提示KPNA2在UTUC腫瘤進(jìn)展、晚期浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移過程中可能發(fā)揮重要作用。研究結(jié)果與KPNA2在其他腫瘤中的研究結(jié)果相似,2007年DANKOF等[15]對(duì)浸潤(rùn)性乳腺癌、癌旁正常組織和乳腺導(dǎo)管原位癌癌組織進(jìn)行免疫組化實(shí)驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)KPNA2的表達(dá)與腫瘤的分級(jí)、分期及淋巴管浸潤(rùn)呈正相關(guān)，提示KPNA2與乳腺癌的發(fā)生發(fā)展有重要關(guān)系。2012年SAKAI[16]運(yùn)用免疫組織化學(xué)方法研究了116例食管癌患者的KPNA2的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)KPNA2的高表達(dá)與腫瘤的低分化、靜脈侵犯、腫瘤分期正相關(guān)。

2012年HE等[17]發(fā)現(xiàn)在卵巢生殖細(xì)胞腫瘤中，KPNA2的表達(dá)水平明顯升高，與腫瘤的病理類型和復(fù)發(fā)率正相關(guān)，與5年總體生存率和無(wú)疾病進(jìn)展存活率有關(guān)，是一個(gè)獨(dú)立的預(yù)測(cè)因素。2011年丹麥學(xué)者JENSEN等[18]研究了KPNA2基因在肌肉非浸潤(rùn)性膀胱癌和肌肉浸潤(rùn)性膀胱癌中的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在Ta、T1期腫瘤中，KPNA2的高表達(dá)預(yù)示較高的疾病進(jìn)展的風(fēng)險(xiǎn)，在肌肉浸潤(rùn)性膀胱癌患者中，高表達(dá)的KPNA2往往提示患者行根治性手術(shù)后有較差的預(yù)后。本研究運(yùn)用Kaplan-Meier法和對(duì)數(shù)秩檢驗(yàn)(Log-ranktest)進(jìn)行生存分析，發(fā)現(xiàn)KPNA2低表達(dá)組5年總體生存率(88.2%)明顯高于KPNA2高表達(dá)組(77.3%，P=0.005)，推測(cè)KPNA2的表達(dá)水平同樣可預(yù)測(cè)UTUC患者預(yù)后。目前關(guān)于KPNA2與腫瘤關(guān)系的研究多數(shù)是有關(guān)臨床病理特征或預(yù)后關(guān)系的研究，涉及KPNA2促進(jìn)腫瘤進(jìn)展的機(jī)制研究較少。2016年TSAI等[19]研究發(fā)現(xiàn)miR-26b通過KPNA2/c-jun途徑可抑制胃癌細(xì)胞遷移和侵襲，提出miR-26b過表達(dá)或KPNA2/c-jun抑制可能具有抑制胃癌轉(zhuǎn)移的治療潛力。

綜上所述，KPNA2在UTUC組織中高表達(dá)，與UTUC患者的T分期、G分級(jí)和術(shù)后膀胱復(fù)發(fā)有關(guān)，而且影響患者的5年生存率。提示KPNA2可作為UTUC患者早期診斷和預(yù)后評(píng)估的潛在生物標(biāo)志物。