安凌悅，張 珩，羅光恒，田 野，孫兆林

(1.貴州醫(yī)科大學(xué)附屬人民醫(yī)院泌尿外科，貴州貴陽(yáng) 550002；2.貴州省人民醫(yī)院泌尿外科，貴州貴陽(yáng) 550000)

前列腺切除術(shù)后尿路感染發(fā)生率為3.9%～14.0%，尿道狹窄和膀胱攣縮的發(fā)生率為7.0%～10.0%，尿道灼熱及尿痛的發(fā)生率為6.9%～29.5%[1-2]?？梢?jiàn)，前列腺切除術(shù)并發(fā)癥仍未得到較好的控制，究其重要原因是前列腺切除術(shù)后創(chuàng)面修復(fù)的機(jī)制仍不甚清楚。為揭示術(shù)后創(chuàng)面修復(fù)機(jī)制，減少前列腺切除術(shù)后并發(fā)癥，需明確術(shù)后修復(fù)創(chuàng)面的細(xì)胞來(lái)源及過(guò)程。傳統(tǒng)觀點(diǎn)認(rèn)為，前列腺切除術(shù)后修復(fù)創(chuàng)面的細(xì)胞來(lái)源于膀胱頸的尿路上皮細(xì)胞爬行覆蓋[3]。本研究團(tuán)隊(duì)前期發(fā)現(xiàn)，前列腺切除術(shù)后修復(fù)創(chuàng)面的細(xì)胞可能來(lái)源于術(shù)后殘余前列腺包膜或側(cè)葉前列腺導(dǎo)管內(nèi)皮的尿路上皮細(xì)胞，其分布隨著導(dǎo)管尿道開(kāi)口處向腺泡腔底部延伸而逐漸減少至消失[4-5]。前列腺部尿道和前列腺導(dǎo)管開(kāi)口襯著尿路上皮，尿路上皮最外層的傘狀細(xì)胞是其主要功能細(xì)胞，可防止毒性物質(zhì)滲入機(jī)體，發(fā)揮這一關(guān)鍵作用的結(jié)構(gòu)蛋白是尿斑蛋白(uroplakin，UP)。UP是一類與尿路上皮分化密切相關(guān)的特異性糖蛋白，分為UPⅠa、UPⅠb、UPⅡ和UPⅢ。UPⅢ特異性表達(dá)于尿路上皮，在維持尿路上皮延展功能和防止有毒物質(zhì)的滲透中有重要作用[6-7]。因此，UPⅢ不僅是尿路上皮的重要結(jié)構(gòu)功能單位，還是研究尿路上皮的特異性標(biāo)志物。作者前期通過(guò)流式細(xì)胞證實(shí)前列腺組織中存在UPⅢ陽(yáng)性的細(xì)胞[5]。然而，UPⅢ在前列腺腹側(cè)葉和側(cè)葉導(dǎo)管內(nèi)皮的具體表達(dá)情況尚不清楚。本文旨在對(duì)UPⅢ在老年雄性SD大鼠前列腺導(dǎo)管內(nèi)皮中的表達(dá)進(jìn)行定位量化研究，為進(jìn)一步研究尿路上皮在前列腺切除術(shù)后尿道修復(fù)過(guò)程中的意義提供研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物18周齡老年雄性斯?jié)娎鄹瘛ざ嗬?Sprague Dawley，SD)大鼠15只購(gòu)于貴州醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物房(合格證號(hào)：SCXK，黔2012～0004)，體重599.96～700.04 g。將其隨機(jī)均分3組，其中一組HE染色和免疫組織化學(xué)染色(免疫組化)的5只大鼠體重633.01～700.02 g，二組蛋白質(zhì)免疫印跡(Western blot，WB)檢測(cè)分析的5只大鼠體重621.04～691.71 g，三組實(shí)時(shí)定量熒光酶聯(lián)聚合反應(yīng)(Real-time fluorescence quantitative enzyme chain polymerization，RT-PCR)檢測(cè)分析的SD大鼠體重600.01～685.42 g，組間體重?zé)o統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。

1.2 取材將15只SD大鼠予水合氯醛(0.5 mL/100 g)麻醉后仰臥位固定消毒，行下腹部正中切口至恥骨聯(lián)合，充分暴露盆腔臟器，可見(jiàn)SD大鼠的前列腺腹側(cè)葉(中央帶和移行帶)包饒并貼附于尿道，前列腺側(cè)葉(外周帶)貼附于膀胱兩側(cè)，完整取出膀胱、前列腺部尿道及前列腺，均行多聚甲醛固定。

1.3 HE染色取一組SD大鼠膀胱、前列腺部尿道及前列腺組織，按標(biāo)準(zhǔn)操作程序(SOP文件)行病理連續(xù)切片和HE染色鏡檢其尿路上皮細(xì)胞。

1.4 UPⅢ檢測(cè)

1.4.1免疫組化法 取尿路上皮細(xì)胞學(xué)檢測(cè)病理連續(xù)切片按SOP文件行免疫組化染色檢測(cè)UPⅢ，其中膀胱作為尿路上皮細(xì)胞UPⅢ陽(yáng)性對(duì)照(下同)。

1.4.2WB法 取二組大鼠膀胱、前列腺腹側(cè)葉和側(cè)葉組織剪成細(xì)小的碎片，按SOP文件行WB法檢測(cè)UPⅢ。

1.4.3RT-PCR法 取三組SD大鼠膀胱、前列腺腹側(cè)葉和側(cè)葉組織分別提其總RNA，消除總RNA中DNA及DNasel后反轉(zhuǎn)錄制備cDNA，對(duì)其進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增后檢測(cè)UPⅢ基因CT值。擴(kuò)增體系如下：SYBR Green Mix 10Ml，上游引物F 5 moL，下游引物R 5 mol，cDNA模板1 μL，ddH2O 8 μL。引物及序列如下： UPⅢ-F，GGAGTGGAGGCATGATTG；UPⅢ-R，CCAGGGTCTTGGGAACA；β-Actin-F，CGTTGACATCCGTAAAGAC；β-Actin-R，TAGGAGCCAGGGCAGTA。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法數(shù)據(jù)采用SPSS22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，多組計(jì)量資料比較服從正態(tài)分布方差齊的使用單因素方差分析，不服從正態(tài)分布或方差不齊的使用Kruskal-WallisH非參數(shù)檢驗(yàn)，以P<0.05判定為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 HE染色結(jié)果膀胱和前列腺部尿道內(nèi)可見(jiàn)典型、胞質(zhì)均勻的尿路上皮三層細(xì)胞(傘狀細(xì)胞、中間細(xì)胞和基底細(xì)胞)，呈極性排列(圖1A、B)。前列腺腹側(cè)葉中開(kāi)口于尿道的前列腺導(dǎo)管近端也可見(jiàn)尿路上皮，層數(shù)約2～3層，厚薄不均，該處的傘狀細(xì)胞未呈極性排列，中間細(xì)胞和基底細(xì)胞完整，細(xì)胞呈極性排列(圖1C)。尿路上皮三層細(xì)胞隨著前列腺導(dǎo)管向腺泡腔底部延伸，數(shù)量逐漸減少，細(xì)胞排列由極性轉(zhuǎn)變?yōu)榉菢O性，直至轉(zhuǎn)化為單層極性排列的腺上皮細(xì)胞(圖1D、E)。前列腺側(cè)葉中未能切出完整的前列腺導(dǎo)管，未能觀察到其尿路上皮的特點(diǎn)。

圖1 SD大鼠膀胱、尿道和前列腺導(dǎo)管HE染色結(jié)果(HE，×100)

A/B：膀胱和尿道內(nèi)可見(jiàn)尿路上皮典型傘狀細(xì)胞、中間細(xì)胞和基底細(xì)胞，呈極性排列；C：前列腺腹側(cè)葉中開(kāi)口于尿道的前列腺導(dǎo)管近端也可見(jiàn)尿路上皮，其中傘狀細(xì)胞未呈極性排列，中間細(xì)胞和基底細(xì)胞呈極性排列；D/E：隨著前列腺導(dǎo)管向腺泡腔底部延伸，尿路上皮細(xì)胞數(shù)量逐漸減少直至轉(zhuǎn)化為腺上皮細(xì)胞。

2.2 UPⅢ檢測(cè)結(jié)果

2.2.1免疫組化檢測(cè)結(jié)果 UPⅢ在膀胱、前列腺部尿道和前列腺導(dǎo)管內(nèi)均呈胞質(zhì)陽(yáng)性表達(dá)，其中膀胱表達(dá)最強(qiáng)，其次為前列腺部尿道，前列腺腹側(cè)葉中前列腺導(dǎo)管尿道開(kāi)口處的表達(dá)最弱(圖2A、B、C)。前列腺導(dǎo)管開(kāi)口處UPⅢ的陽(yáng)性表達(dá)隨著導(dǎo)管尿道開(kāi)口向腺泡腔底部延伸逐漸減弱，最終在前列腺導(dǎo)管腺泡腔底部呈陰性表達(dá)。前列腺側(cè)葉中因未切出導(dǎo)管，未觀察到前列腺導(dǎo)管內(nèi)UPⅢ的表達(dá)情況(圖2D、E)。

圖2 SD大鼠膀胱、尿道和前列腺導(dǎo)管免疫組化結(jié)果(免疫組化，×100)

A/B:UPⅢ在膀胱和尿道呈胞質(zhì)陽(yáng)性表達(dá)；C：前列腺腹側(cè)葉中前列腺導(dǎo)管尿道開(kāi)口處的UPⅢ同樣呈陽(yáng)性表達(dá)；D/E：前列腺導(dǎo)管開(kāi)口處的UPⅢ陽(yáng)性表達(dá)隨著導(dǎo)管尿道開(kāi)口向腺泡腔底部延伸逐漸減弱，最終在前列腺導(dǎo)管腺泡腔底部呈陰性表達(dá)。

2.2.2WB檢測(cè)結(jié)果 膀胱、前列腺腹側(cè)葉和側(cè)葉UPⅢ的表達(dá)量分別為2 277.20±95.90、1 665.00±78.36和27.40±10.29，各組織間表達(dá)存在差異，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=1 314.250，P<0.001)，其中膀胱表達(dá)強(qiáng)于前列腺腹側(cè)葉，側(cè)葉最低(圖3)。

2.2.3RT-PCR檢測(cè)結(jié)果 膀胱、前列腺腹側(cè)葉和側(cè)葉中UPⅢ基因CT值的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(H=6.618，P=0.037)，其中膀胱與前列腺腹側(cè)葉間的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，前列腺側(cè)葉UPⅢ基因表達(dá)顯著低于膀胱、前列腺腹側(cè)葉(均P<0.05,圖4、表1)。

圖3 SD大鼠膀胱、前列腺腹側(cè)葉和側(cè)葉WB蛋白定量結(jié)果

A:UPⅢ在膀胱內(nèi)的蛋白表達(dá)量最高，前列腺腹側(cè)葉次之，前列腺側(cè)葉極低；B：膀胱、前列腺腹側(cè)葉和側(cè)葉中UPⅢ表達(dá)量比例分布。

表1 RT-PCR檢測(cè)膀胱、前列腺腹側(cè)葉和側(cè)葉中UPⅢ基因的表達(dá)情況比較[M(P25～P75)]

注：*與膀胱、前列腺腹側(cè)葉比較，均P<0.05。

圖4 SD大鼠膀胱、前列腺腹側(cè)葉和側(cè)葉RT-PCR基因定量結(jié)果

A:按膀胱、前列腺腹側(cè)葉和側(cè)葉順序檢測(cè)各組織中UPⅢ基因的定量電泳圖(三復(fù)孔)，膀胱和前列腺腹側(cè)葉中均能檢測(cè)到UPⅢ基因的表達(dá)，前列腺側(cè)葉UPⅢ基因表達(dá)低；B/C：UPⅢ基因檢測(cè)CT值擴(kuò)增曲線和溶解曲線。

3 討 論

尿路上皮主要由三層細(xì)胞組成，他們由內(nèi)到外分別是基底細(xì)胞、中間細(xì)胞和傘狀細(xì)胞，其中發(fā)揮主要尿路上皮屏障功能的是最外層的傘狀細(xì)胞，其頂膜面有微絨毛，具有增強(qiáng)細(xì)胞表面張力、影響細(xì)菌粘附和流體運(yùn)輸?shù)裙δ躘8-9]。此外，90%的傘狀細(xì)胞表面覆蓋著獨(dú)特的不對(duì)稱單位膜(asymmetric unit membrane，AUM)，它使尿路上皮具有高達(dá)75 000 Ω/cm2的擴(kuò)膜電阻，能夠有效阻礙尿液中有害物質(zhì)滲入機(jī)體，形成血尿屏障的重要功能結(jié)構(gòu)[6,10]。

AUM的主要蛋白成分是UP，UP 分為UPⅠa(27 ku)、UPⅠb(28 ku)、UPⅡ(15 ku)和UPⅢ(47 ku)，他們以二聚體的形式構(gòu)成亞單位，每個(gè)亞單位由6個(gè)內(nèi)環(huán)蛋白(UPⅠa和UPⅠb)和6個(gè)外環(huán)蛋白(UPⅡ和UPⅢ)構(gòu)成，約1 000～3 000個(gè)左右的亞單位裝配成一個(gè)斑塊覆蓋傘細(xì)胞頂膜面形成AUM。UPⅢ在細(xì)胞內(nèi)的部分遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)它在細(xì)胞外的部分，這種內(nèi)外不對(duì)稱的分布方式與其他類型UP共同形成AUM的分子基礎(chǔ)。UPⅢ可表達(dá)于尿路上皮組織或尿路上皮源性的原發(fā)腫瘤和轉(zhuǎn)移腫瘤[11]，它對(duì)尿路上皮具有高度特異性，而在除前列腺導(dǎo)管以外的前列腺組織內(nèi)為陰性，因此，UPⅢ常被用于對(duì)尿路上皮的鑒定。

作者前期證實(shí)SD大鼠前列腺導(dǎo)管近端存在尿路上皮細(xì)胞[5]。本研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，前列腺導(dǎo)管內(nèi)UPⅢ的陽(yáng)性表達(dá)和尿路上皮細(xì)胞的排列一致，隨著導(dǎo)管向腺泡腔底部延伸，UPⅢ的陽(yáng)性表達(dá)逐漸減弱至陰性，而前列腺除導(dǎo)管外其他部位并未觀察到UPⅢ的陽(yáng)性表達(dá)(圖1和2)。并在這一特點(diǎn)的基礎(chǔ)上，從蛋白及核酸水平檢測(cè)到前列腺各葉中UPⅢ的表達(dá)量，其中前列腺腹側(cè)葉的表達(dá)量明顯高于前列腺側(cè)葉(P<0.05)，該結(jié)果和免疫組化表達(dá)特點(diǎn)一致。原因可能是前列腺腹側(cè)葉貼附于尿道，其中部分前列腺導(dǎo)管開(kāi)口于前列腺部尿道，導(dǎo)管開(kāi)口處的內(nèi)皮組織有機(jī)會(huì)接觸尿液，為適應(yīng)尿液環(huán)境和防止尿液滲入前列腺組織，該處內(nèi)皮組織形成尿路上皮，該現(xiàn)象屬于機(jī)體的適應(yīng)。反之，前列腺側(cè)葉中的前列腺導(dǎo)管內(nèi)皮幾乎不接觸尿液，UPⅢ表達(dá)量低。

前列腺組織內(nèi)分布有許多粗細(xì)不等的前列腺導(dǎo)管，協(xié)助完成前列腺液的分泌與運(yùn)輸。前列腺切除術(shù)后修復(fù)前列腺部尿道的種子細(xì)胞并不來(lái)源于膀胱頸的尿路上皮細(xì)胞爬行覆蓋，該種子細(xì)胞可能來(lái)源于前列腺切除術(shù)后殘余的前列腺導(dǎo)管內(nèi)皮，它從前列腺導(dǎo)管內(nèi)爬行至創(chuàng)面，形成島狀上皮細(xì)胞，逐漸連接成片修復(fù)創(chuàng)面[4,12]。研究表明，在遭到破壞的膀胱尿路上皮組織中，低表達(dá)UPⅠ和UPⅡ基因，高表達(dá)UPⅢ基因；UPⅢ基因的表達(dá)可能與尿路上皮的修復(fù)密切相關(guān)[13]。

本研究結(jié)果中，由于前列腺側(cè)葉的前列腺導(dǎo)管細(xì)小，病理切片難以切出完成導(dǎo)管，免疫組化僅觀察到UPⅢ在前列腺腹側(cè)葉靠近尿道的前列腺導(dǎo)管內(nèi)皮呈陽(yáng)性，前列腺側(cè)葉中未觀察到導(dǎo)管內(nèi)表達(dá)情況，除導(dǎo)管外的前列腺組織均為陰性。然而，WB及RT-RCR不僅在靠近尿道的前列腺腹側(cè)葉中檢測(cè)到大量UPⅢ，還在遠(yuǎn)離尿道的前列腺側(cè)葉中檢測(cè)到少量UPⅢ。該結(jié)果說(shuō)明前列腺導(dǎo)管內(nèi)皮表達(dá)UPⅢ，推測(cè)前列腺導(dǎo)管內(nèi)存在尿路上皮細(xì)胞，即使是在前列腺側(cè)葉(外周帶)同樣可能存在少量散在分布于前列腺導(dǎo)管的島狀尿路上皮細(xì)胞。當(dāng)前列腺切除術(shù)將大部分前列腺腹側(cè)葉(中央帶和移行帶)切除，即使較多表達(dá)尿路上皮細(xì)胞的前列腺導(dǎo)管缺失，少量殘存于前列腺側(cè)葉(外周帶)中表達(dá)UPⅢ陽(yáng)性的尿路上皮細(xì)胞仍可作為修復(fù)創(chuàng)面的種子細(xì)胞，在前列腺切除術(shù)后尿液及局部微環(huán)境變化的刺激下從殘余前列腺側(cè)葉的導(dǎo)管和包膜爬出，發(fā)生離巢、遷移及增殖，參與前列腺切除術(shù)后前列腺部尿道的修復(fù)過(guò)程，最終形成有功能的尿路上皮。

綜上所述，在老年SD大鼠前列腺導(dǎo)管內(nèi)皮存在一定量的UPⅢ，進(jìn)一步說(shuō)明前列腺導(dǎo)管內(nèi)存在尿路上皮，其主要分布于前列腺腹側(cè)葉(中央帶)的前列腺導(dǎo)管內(nèi)皮，少量島狀尿路上皮細(xì)胞可能散在分布于前列腺側(cè)葉(外周帶)，這部分尿路上皮細(xì)胞可能是前列腺切除術(shù)后修復(fù)創(chuàng)面的種子細(xì)胞，將為前列腺切除術(shù)后創(chuàng)面修復(fù)機(jī)制的研究奠定基礎(chǔ)。