仲超逸,田洪磊*,詹 萍*,王 鵬,周文杰
(1.石河子大學(xué)食品學(xué)院,新疆 石河子 832000;2.陜西師范大學(xué)食品工程與營養(yǎng)科學(xué)學(xué)院,陜西 西安 710119)
當(dāng)今社會快節(jié)奏的生活方式導(dǎo)致大多數(shù)人的飲食變得不規(guī)律、飲酒過量或頻繁服用各類藥物,這使得胃黏膜變得很脆弱且易受到損傷[1]。目前,對胃黏膜保護(hù)的手段主要有胃黏膜保護(hù)劑(如生胃酮、硫鋁糖等)[2]及具有健胃養(yǎng)胃功效的天然提取物,如能促進(jìn)胃黏膜細(xì)胞增殖和DNA合成的丹參[3]、能提高胃組織中前列腺素E2(prostaglandin E2,PGE2)和一氧化氮(NO)含量的鹽藻多糖等[4]。因此作為新疆特有的藥食兩用資源——大果阿魏在對胃腸道疾病輔助治療方面的功能性食品開發(fā)與研究具有良好的前景。
大果阿魏(Ferula lehmannii Boiss)屬于傘形科阿魏屬(Ferula),因具有強(qiáng)烈蔥蒜樣氣味常作為調(diào)味食材[5]。多種阿魏屬植物在民間已經(jīng)廣泛用于抗驚厥、祛風(fēng)、解痙、滋補(bǔ)、潤腸等方面,也能用于治療神經(jīng)紊亂、糖尿病、風(fēng)濕病和背痛等慢性疾病[6-8],因此部分研究學(xué)者針對阿魏屬植物的主要化學(xué)成分進(jìn)行了分離與鑒定,試圖獲得阿魏屬植物對胃部功能性修復(fù)的關(guān)鍵組分及明確具體的保護(hù)機(jī)理[9-10]。目前國內(nèi)已有部分關(guān)于阿魏屬植物對胃腸道損傷修復(fù)功能的報(bào)道,如王颯[11]研究發(fā)現(xiàn)多傘阿魏的揮發(fā)油及其多種提取物對胃癌細(xì)胞增殖有一定的抑制作用;熊元君等[12]建立與臨床急性胃黏膜損傷相近的大鼠動物模型,比較并評價了烏恰阿魏、多傘阿魏和阿魏原汁對胃黏膜的保護(hù)及修復(fù)作用。然而針對新疆大果阿魏對胃黏膜保護(hù)作用的研究鮮見報(bào)道。
本實(shí)驗(yàn)采用國內(nèi)外常用的乙酸所致大鼠胃黏膜損傷模型,觀察大果阿魏石油醚提取物對胃黏膜損傷的修復(fù)作用,以損傷面積、損傷抑制率、胃組織中超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、丙二醛(malondialdehyde,MDA)活力和PGE2、NO含量為指標(biāo),評價了大果阿魏石油醚提取物對胃黏膜的保護(hù)作用,同時將分離與鑒定提取物中的化學(xué)成分與各指標(biāo)建立構(gòu)效關(guān)系,為開發(fā)以大果阿魏為原料的具有養(yǎng)胃功能特性的食品提供理論依據(jù)。
SD(清潔級)雄性大鼠60 只,體質(zhì)量180~220 g,由新疆醫(yī)科大學(xué)動物中心提供,許可證號:SCX(新)XJ-0001。
大果阿魏采摘于新疆石河子市南山紅土地帶(2017年4月),挑選出新鮮完整的地上部分后,迅速平鋪于空地并在室溫下自然陰干,在室溫下密封保存。
冰乙酸(分析純,乙酸含量≥99.5%) 天津市東麗區(qū)天大化學(xué)試劑廠;鹽酸雷尼替丁 山西太原制藥有限公司;羧甲基纖維素鈉(carboxymethylcellulose sodium,CMC-Na) 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;SOD、MDA、PGE2、NO試劑盒 南京建成生物工程研究所;正構(gòu)烷烴混合標(biāo)準(zhǔn)品(C7~C40) 美國Sigma-Aldrich公司。
5977A氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀 美國Agilent公司;游標(biāo)卡尺(量程0~125 mm,精密度0.02 mm) 上海精密儀器儀表有限公司;低溫離心機(jī) 德國Sigma公司。
1.3.1 大果阿魏石油醚提取物制備
參考文獻(xiàn)[13]的方法,稱取干燥粉末100 g,加入8 倍體積的石油醚溶劑,水浴回流提取3 次,合并提取液,減壓抽濾得到上清液,用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀真空濃縮得到浸膏。
1.3.2 大果阿魏石油醚提取物成分分析
氣相色譜-質(zhì)譜條件:H P-5色譜柱(30 mh0.25 mm,0.25 μm);升溫程序:初始溫度溫度60 ℃,保持5 min,以4 ℃/min升高到230 ℃,保持10 min;載氣流量為1.0 mL/min,進(jìn)樣量1 μL,不分流進(jìn)樣。離子源為電子轟擊離子源,溫度230 ℃;四極桿溫度150 ℃;電子能量70 eV;掃描范圍30~450 amu。
定性定量方法:分離出的未知物各色譜峰與NIST 14 Library相匹配,為使化合物匹配更為精確,同時通過與文獻(xiàn)化合物中的相對保留指數(shù)(retention index,RI)進(jìn)行比對驗(yàn)證所鑒定的化合物。RI標(biāo)準(zhǔn)值為保留指數(shù)值,通過NIST數(shù)據(jù)庫(http://webbook.nist.gov/chemistry/nameser.html)查閱得到。RI值根據(jù)式(1)計(jì)算。
式中:TR(m)、TR(m+1)、TR(X)分別為碳原子數(shù)m、m+1的正構(gòu)烷和待測物X的保留時間,且通常TR(m)<TR(X)<TR(m+1)。
1.3.3 大鼠乙酸性胃黏膜損傷模型的建立及分組
所有動物在相對濕度50%~60%、溫度23~25 ℃的動物房適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d,給予正常飲食自由飲水。
模型建立前12 h大鼠禁食不禁水,由于乙酸所致胃黏膜損傷與人類慢性胃黏膜損傷最相似,故采用Okabe等[14]的方法經(jīng)過改良后制作乙酸損傷胃黏膜實(shí)驗(yàn)大鼠模型。大鼠腹腔注射體積分?jǐn)?shù)3%苯巴比妥鈉麻醉,劑量為0.18 mL/100 g。注射后約10 min完全麻醉,麻醉時間5 h左右。將大鼠固定在動物手術(shù)臺上,用碘酒、乙醇常規(guī)消毒,劍突下1 cm縱向切開皮膚,找出胃,移出腹腔,用微量注射器(5 μL)將胃前壁胃竇部膜下近肌層處注入體積分?jǐn)?shù)20%冰乙酸0.05 mL,注射結(jié)束后,將胃復(fù)位,涂抹適量抗生素。術(shù)后當(dāng)日將大鼠放回籠中,給予自由飲水,次日給予自由飲食。
造模完成后將大鼠隨機(jī)分成6 組,分別為正常組(未造模)、模型組、陽性組(雷尼替?。┘按蠊⑽菏兔烟崛∥锔撸?.0 g/kg mb)、中(0.2 g/kg mb)、低(0.04 g/kg mb)劑量組,每組8 只。
1.3.4 胃組織損傷面積及損傷抑制率的測定
給藥方法:術(shù)后次日開始給藥,正常組和模型組每天灌胃等體積的0.5% CMC-Na溶液;陽性組每天按照0.03 g/kg mb灌胃雷尼替??;大果阿魏石油醚提取物高、中、低劑量組用0.5% CMC-Na混懸配制,大鼠給藥體積為1 mL/100 g mb,連續(xù)灌胃2 周。
末次給藥后,所有大鼠禁食12 h不禁水,處死后打開腹腔,結(jié)扎幽門和賁門,取出全胃。然后放入體積分?jǐn)?shù)1%福爾馬林溶液中,用蒸餾水洗凈內(nèi)容物,濾紙吸干,平展在玻璃板上,觀察損傷愈合情況,用游標(biāo)卡尺量取損傷部分的最大縱徑和橫徑,分別根據(jù)式(2)、(3)計(jì)算損傷面積及損傷抑制率。
1.3.5 胃組織病理切片觀察
胃組織病理切片觀察參考文獻(xiàn)[15]。用體積分?jǐn)?shù)4%甲醛溶液固定各組胃組織,用流水沖去固定液后放入體積分?jǐn)?shù)70%的乙醇溶液中保存。將各胃組織依次置于不同體積分?jǐn)?shù)的乙醇中梯度脫水至組織塊完全脫水透明,然后進(jìn)行包埋、切片、染色,于顯微鏡下觀察。
1.3.6 胃組織生化指標(biāo)的測定
各組取損傷邊緣相同部位的一塊胃組織,稱取0.3~0.4 g,用質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.9%的冰生理鹽水制備成10%的組織勻漿,離心后取上清液,置于4 ℃下測定SOD活力、MDA含量、PGE2質(zhì)量濃度及NO含量。
1.3.7 主成分分析
主成分分析(principal component analysis,PCA)是一種較為經(jīng)典的特征抽取和降維技術(shù)之一,同時在無監(jiān)督的模式下對各因素進(jìn)行分類與可視化識別[16]。以所測指標(biāo)即SOD、MDA、PGE2和NO水平為分類變量,對提取物中的揮發(fā)性物質(zhì)進(jìn)行分類。依據(jù)PCA分析的基本原則,即各化合物在得分圖上距離越接近某項(xiàng)指標(biāo),其對于該指標(biāo)的貢獻(xiàn)率越大。
測定結(jié)果及主成分分析均采用SPSS 19.0軟件,數(shù)據(jù)以fs表示,組間比較采用單因素方差分析,檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05,以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
采用氣相色譜-質(zhì)譜分析得到大果阿魏石油醚提取物的總離子流圖如圖1所示,共鑒定出25 種成分,結(jié)果詳見表1。大果阿魏石油醚提取物中主要有萜類及含硫化合物。相對含量最高的是萜類物質(zhì),玫瑰醚、側(cè)柏醇、橙花醇3 種單萜和馬兜鈴烯、橙花叔醇等10 種倍半萜相對含量為49.47%,其中橙花叔醇、玫瑰醚相對含量較高,分別為8.70%和6.59%。1-(1-(甲硫基)丙基)-2-丙基二硫醚(10.88%)、(Z)-仲丁基丙烯基二硫醚(7.52%)、(Z)-2-丁烯基1-甲基丙二硫醚(3.73%)和二甲基三硫醚4 種含硫化合物相對含量為24.01%,這些含硫物質(zhì)的存在賦予了大果阿魏特殊的蔥蒜樣氣味[17]。
圖1 大果阿魏石油醚提取物的總離子流圖Fig.1 Total ion current chromatography of the petroleum ether extract from Ferula lehmannii Boiss
表1 大果阿魏石油醚提取物成分分析Table1 Chemical composition of the petroleum ether extract from Ferula lehmannii Boiss
大鼠體質(zhì)量的變化是評價提取物是否具有毒性的一個重要指標(biāo),由表2可知,空白組、模型組、陽性組及大果阿魏石油醚提取物高、中、低劑量組間大鼠的初始體質(zhì)量無顯著差異(P>0.05)。經(jīng)過灌胃給藥2 周后,各組間大鼠體質(zhì)量無顯著性差異(P>0.05),可以說明大鼠在受試過程中正常生長,未受到大果阿魏提取物的影響。
表2 大鼠體質(zhì)量(n=8)Table2 Body mass of rats (n= 8)
圖2可以直觀地體現(xiàn)出不同實(shí)驗(yàn)組胃黏膜損傷面積的變化情況。與空白組相比,模型組胃黏膜損傷程度最嚴(yán)重,損傷面積達(dá)到41.14 mm2。經(jīng)過灌胃給予不同劑量的藥物及提取物干預(yù)后,胃黏膜損傷呈現(xiàn)出不同程度的修復(fù)。其中,陽性組損傷面積為27.78 mm2,相比于模型組減小了13.36 mm2,抑制率達(dá)到32.47%;大果阿魏石油醚提取物高劑量組(1.0 g/kg)的損傷面積為28.04 mm2,相比于模型組減小了13.10 mm2,抑制率達(dá)到31.84%,效果與陽性組差異不明顯。低劑量組對胃黏膜損傷也有一定的修復(fù)作用,其損傷抑制率達(dá)到18.67%,但與高劑量組相比,修復(fù)能力相對較弱。中劑量組對受損胃黏膜的修復(fù)作用介于低劑量組及高劑量組之間,高劑量組與中、低劑量組對胃黏膜的修復(fù)能力存在顯著差異。然而通過胃黏膜損傷面積的測量無法明確提取物中的物質(zhì)成分與胃黏膜修復(fù)之間存在何種作用效果,因此需要對大鼠胃組織中的生化指標(biāo)進(jìn)行測定,從而明確具體的構(gòu)效關(guān)系。
圖2 大果阿魏石油醚提取物對大鼠胃黏膜損傷面積和損傷抑制率的影響Fig.2 Inf l uence of the petroleum ether extract from Ferula lehmannii Boiss on gastric mucosal injury area and injury inhibition percentage
圖3 各組大鼠胃組織HE染色切片F(xiàn)ig.3 Microscopic observation of stomach tissues of rats
如圖3所示,空白組大鼠胃壁結(jié)構(gòu)正常,胃黏膜各層次清晰,胃腺呈管狀整齊有序,可以看見正常的黏膜柱狀細(xì)胞和完整的腺細(xì)胞,無炎性細(xì)胞浸潤;與此形成對比的是,模型組大鼠胃黏膜破壞嚴(yán)重,損傷已經(jīng)到達(dá)肌層,表面黏膜上皮細(xì)胞脫落,可見充血、水腫且有大量炎細(xì)胞浸潤。缺口處有較少的黏膜再生,組織結(jié)構(gòu)較為紊亂。相比于模型組,陽性組及提取物組胃黏膜組織形態(tài)存在較大差異。陽性組損傷部位愈合現(xiàn)象明顯,有新生上皮細(xì)胞覆蓋在損傷處,炎性細(xì)胞減少并有新生腺體。低劑量組大鼠胃黏膜缺損程度依然較為嚴(yán)重,損傷累及肌層,有出血、淤血現(xiàn)象;中劑量組和高劑量組大鼠表現(xiàn)出胃黏膜中度再生,損傷底部可見新生的肉芽組織,高劑量組大鼠新生的腺體覆蓋在損傷部位,并出現(xiàn)許多新生的結(jié)締組織,仍有少量炎性細(xì)胞浸潤,但愈合趨勢明顯。
表3 大果阿魏石油醚提取物對大鼠胃組織生化指標(biāo)的影響(n= 8)Table3 Effect of the petroleum ether extract from Ferula lehmannii Boiss on biochemical indexes of gastric tissue in rats (n= 8)
如表3所示,與空白組相比,乙酸引起的胃黏膜損傷使得大鼠胃組織中SOD活力下降而MDA活力上升。與模型組相比,高劑量組中SOD活力顯著增加37.27%(P<0.05),與陽性組SOD活力增加程度(41.84%)較為接近;高劑量組M D A含量減少了3 2.5 1%(P<0.05),陽性組減少了33.25%。中、低劑量組這兩個指標(biāo)的活力發(fā)生變化但差異性不顯著。說明高劑量提取物能明顯提高自由基的清除能力,從而加快胃黏膜修復(fù)進(jìn)程。乙酸刺激大鼠胃部后胃組織中PGE2和NO含量都有所下降。與模型組相比,陽性組中PGE2和NO含量顯著增加了30.79%和56.49%。經(jīng)過提取物干預(yù)后,各組大鼠胃組織中PGE2和NO含量增加。其中,高劑量組大鼠PGE2增加了22.41%,NO增加了28.13%,但并無明顯影響。由此可見,提取物對胃黏膜保護(hù)因子的增強(qiáng)作用并不顯著,其對胃黏膜損傷的修復(fù)作用主要是由于存在的抗氧化物質(zhì)能夠有效地清除各種自由基,提高了胃黏膜的抗氧化能力。為了更進(jìn)一步明晰提取物中化合物和所測生化指標(biāo)間的內(nèi)在聯(lián)系,從而確定胃黏膜修復(fù)機(jī)理,采用PCA法構(gòu)建了已鑒定化合物與各生化指標(biāo)的相關(guān)性模型。
PCA屬于無監(jiān)督判別模式[18],因此所構(gòu)建PCA模型分析提取物中化合物和抗氧化因子及胃黏膜保護(hù)因子之間的關(guān)系是客觀科學(xué)的,具體結(jié)果如圖4所示。
圖4 提取物中化合物與指標(biāo)間的PCA分析Fig.4 Principal component analysis plots of chemical composition and biochemical indexes
PCA模型中PC1(58.78%)和PC2(26.39%)累計(jì)方差貢獻(xiàn)為85.71%,可以反映化合物的大部分信息,因此保留PC1-PC2主成分的化合物分布圖。根據(jù)PCA分析的基本原則,即化合物與指標(biāo)在得分圖上距離越近,化合物對于該指標(biāo)的貢獻(xiàn)率就越大。由圖4可以看出,各指標(biāo)與成分分布在X軸中軸線兩側(cè),且分布具有明顯的區(qū)分度。以圖中中軸線為界,代表抗氧化能力的SOD與MDA分布在左半邊,代表胃黏膜修復(fù)因子指標(biāo)的NO與PGE2分布在圖的右邊,且各參數(shù)間能夠明顯地區(qū)分開。其中,SOD附近主要聚集了包括對乙烯基愈創(chuàng)木酚、愈創(chuàng)木醇、橙花叔醇等在內(nèi)的6 種化合物,這些物質(zhì)對于自由基的清除有顯著影響。例如苯乙醛除存在于竹葉、木瓜籽等多種植物具有抗氧化活性的揮發(fā)油中,還廣泛存在于啤酒中,其含量的增加可以提高啤酒的還原力[19];馬士巧[20]以抗菌和抗氧化活性為指標(biāo),篩選了東北黑蜂蜂膠中的極性活性物質(zhì)并進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)愈創(chuàng)木醇為其主要的活性物質(zhì)。MDA周圍主要成分是紫羅蘭酮、石竹烯氧化物、桉葉油醇及兩種含硫化合物((Z)-2-丁烯基1-甲基丙二硫醚、1-(1-(甲硫基)丙基)-2-丙基二硫醚)。陳景明等[21]發(fā)現(xiàn)石竹烯氧化物為赤楠葉揮發(fā)油中的主要成分并評價了其抗氧化性及抗氧化效果;桉葉油醇具有良好的抗氧化及抗菌活性存在于多種植物的精油中[22]。(Z)-2-丁烯基1-甲基丙二硫醚和1-(1-(甲硫基)丙基)-2-丙基二硫醚廣泛存在于新疆阿魏中,但鮮有研究表明其抑制脂質(zhì)過氧化活性。綜上所述,桉葉油醇及石竹烯氧化物對于MDA活性的減少起到關(guān)鍵的積極作用。除環(huán)氧十六烷外,沒有與NO和PGE2距離相近的化合物,可能是由于各組分與各生化指標(biāo)間的相關(guān)性評價是一個十分復(fù)雜的體系,單純的采用一種判別模式無法全面揭示出全部的內(nèi)在關(guān)聯(lián),僅僅從二維PCA圖以PC1-PC2為坐標(biāo)軸,只是在無監(jiān)督的判別模式下得出較為全面的相關(guān)性模型,因此研究與NO和PGE2指標(biāo)最大相關(guān)性成分,有待后期更進(jìn)一步深層次的數(shù)據(jù)分析及模型構(gòu)建。
國內(nèi)外很多學(xué)者對阿魏屬植物的揮發(fā)油進(jìn)行研究,結(jié)果表明該屬多種植物的不同部分的揮發(fā)油具備良好的抗菌性及抗氧化性。Iranshahi等[23]發(fā)現(xiàn)從F. latisecta果實(shí)中提取出的揮發(fā)油存在大量硫化物,對革蘭氏陽性菌尤其是金黃色葡萄球菌有著顯著的抑制活性;Kavoosi等[24]提取并分析了3 批不同時間采集的F. assa-foetida的揮發(fā)油,發(fā)現(xiàn)(Z/E)-仲丁基丙烯基二硫醚、β-蒎烯及桉葉油醇為其主要的化合物,并且提取的揮發(fā)油對自由基具有良好的清除能力。通過對阿魏草石油醚提取物物質(zhì)組成分析,可以看出提取物中所含大量萜類化合物,這些物質(zhì)具有許多生理活性。如愈創(chuàng)木醇廣泛存在于植物的揮發(fā)油中,具有抗菌、抗氧化等功能[25];王慧英等[26]的研究表明,玫瑰精油中存在的玫瑰醚等物質(zhì)不僅賦予其天然的香味,更是具有很好的抗氧化活性;石竹烯、橙花叔醇等倍半萜類物質(zhì)存在于很多藥用植物中,這些植物的揮發(fā)油具有良好的抗菌、抗腫瘤活性[27]。含硫化合物也是阿魏草石油醚提取物中物質(zhì)的重要組成部分。有研究表明,二甲基硫醚作為催化抗氧化體系的重要小分子底物,在氧化應(yīng)激條件下,可以快速和活性氧反應(yīng)生成二甲基亞砜,從而發(fā)揮其抗氧化作用[28]。
乙酸性胃黏膜病變的起源是一個多因素的過程,主要是由于胃壁黏液的消耗,這種消耗經(jīng)常與自由基的含量顯著相關(guān),結(jié)果導(dǎo)致黏膜損傷,包括潰瘍、糜爛、出血。氧自由基,主要是羥自由基、超氧化物陰離子自由基和脂質(zhì)過氧化物,是導(dǎo)致胃黏膜損傷的有害化合物[29],抗氧化能力及胃黏膜防御因子的含量對胃黏膜的保護(hù)意義重大。乙酸性胃黏膜損傷程度與自由基的含量顯著相關(guān)。正是由于如羥基自由基、超氧化物陰離子和脂質(zhì)過氧化物等大量氧自由基的存在使胃黏膜損傷加劇。SOD是體內(nèi)清除自由基的首要物質(zhì),它能夠?qū)购妥钄嘤捎谘踝杂苫鶎?xì)胞造成的損傷并及時修復(fù)受損細(xì)胞[30],是生物體內(nèi)重要的抗氧化酶。而MDA是一種重要的脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物,其含量增加會破壞細(xì)胞膜的完整性增加通透性,從而引起組織損傷[31]。PGE2和NO被認(rèn)為是胃黏膜保護(hù)因子,PGE2具有通過影響?zhàn)つど掀ぜ?xì)胞的增殖、黏液生成和黏膜血液供應(yīng)來保護(hù)胃黏膜[32]。NO能夠使黏膜血管擴(kuò)張,也可以有效地調(diào)節(jié)胃黏膜保護(hù)因子及胃酸、酸根等損傷因子,同時增加胃黏膜血流量達(dá)到胃黏膜防御作用[33]。本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表明,大果阿魏石油醚提取物能明顯提升大鼠胃黏膜中SOD活力,降低MDA含量。隨著用藥劑量增加,其作用效果愈明顯,相比模型組,提取物高劑量組效果更加明顯。
綜上,大果阿魏石油醚提取物具有明顯的促進(jìn)損傷胃黏膜修復(fù)的作用,且治療效果接近雷尼替丁。潛在的作用機(jī)制主要是通過提高胃黏膜的抗氧化能力,提高SOD活力,降低MDA含量,加快胃黏膜的增殖與修復(fù),從而達(dá)到保護(hù)胃黏膜的作用。