萬(wàn)樹(shù)泉，魏麗軍*，王?；?，曾 勇

(1．山西醫(yī)科大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院，山西 太原030001；2．山西醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院婦一科，山西 太原 030013；3．山西醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院分子生物室，山西 太原 030013)

卵巢癌是女性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤之一，在全球的發(fā)病率和死亡率均僅次于宮頸癌[1]。由于缺乏早期癥狀和缺乏有效的早期篩查診斷方法，多數(shù)卵巢癌患者發(fā)現(xiàn)時(shí)已是晚期，5年生存率僅有20%~25%[2]。其主要治療手段是腫瘤細(xì)胞減滅術(shù)加紫杉醇和鉑類藥物等化療藥的聯(lián)合治療，近些年盡管診斷和治療技術(shù)的發(fā)展，死亡率仍無(wú)明顯改善，其主要原因之一是化療耐藥。探尋耐藥性卵巢癌新特異性的分子標(biāo)志物，為其逆轉(zhuǎn)化療耐藥開(kāi)辟新途徑提高治愈率已成為研究熱點(diǎn)。Lee等[3]在秀麗隱桿線蟲(chóng)中發(fā)現(xiàn)能夠按時(shí)序調(diào)控胚胎后期發(fā)育的第1個(gè)miRNA分子lin-4。后續(xù)系列研究證明了miRNA是一類重要的調(diào)控因子，可以通過(guò)結(jié)合靶mRNA的3′UTR導(dǎo)致mRNA降解或翻譯抑制從而調(diào)節(jié)基因的表達(dá)，可參與細(xì)胞增殖、分化、凋亡、新陳代謝等生理過(guò)程[4]，也可參與惡性腫瘤的細(xì)胞增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移和化療耐藥/敏感等病理過(guò)程[5-6]。微小RNA(microRNA)的發(fā)現(xiàn)及其功能作用的揭示為上皮性卵巢癌多藥耐藥機(jī)制的研究帶來(lái)了新的思路。

前期實(shí)驗(yàn)用miRNA基因芯片篩選出上皮漿液性卵巢癌耐藥組織中miR-200b-3p表達(dá)上調(diào)，在此基礎(chǔ)上選用目前常用的3個(gè)miRNA靶基因預(yù)測(cè)數(shù)據(jù)庫(kù)：DIANA TOOLS、 miRTarBase、 TargetScanHuman miRNA進(jìn)行miR-200b-3p靶基因預(yù)測(cè)并取交集，結(jié)合參考文獻(xiàn)，初步選取PAK2為miR-200b-3p可能作用的靶基因，本實(shí)驗(yàn)采用實(shí)時(shí)定量PCR的方法檢測(cè)與化療耐藥相關(guān)的差異表達(dá)miRNA-200b-3p，并闡明其可能的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 組織標(biāo)本

收集2015—2018年在山西省腫瘤醫(yī)院就診的50例上皮漿液性卵巢囊腺癌患者(25例化療敏感和25例化療耐藥)為研究對(duì)象。并定義耐藥組為處理組，敏感組為對(duì)照組。所有患者均符合以下納入標(biāo)準(zhǔn)：①經(jīng)過(guò)病理驗(yàn)證且之前未經(jīng)過(guò)任何治療(化療、生物治療和免疫治療等)；②所有取材患者均已接受腫瘤細(xì)胞減滅術(shù)和術(shù)后3~6個(gè)周期的紫杉醇和順鉑(TP/TC)藥物治療；③臨床資料完整者。根據(jù)2012年卵巢癌NCCN指南來(lái)鑒定化療敏感和化療耐藥，腫瘤細(xì)胞減滅術(shù)后對(duì)初次化療有明確反應(yīng)，并達(dá)到臨床完全緩解，停用化療藥6個(gè)月后復(fù)發(fā)者認(rèn)為是化療敏感，而卵巢癌術(shù)后初次化療后6個(gè)月內(nèi)復(fù)發(fā)認(rèn)為是化療耐藥。卵巢癌復(fù)發(fā)指標(biāo)：①CA125水平升高；②出現(xiàn)胸水和腹水；③體檢發(fā)現(xiàn)腫塊；④找不到原因的腸梗阻；⑤影像學(xué)發(fā)現(xiàn)腫塊。如果滿足以上兩條或者兩條以上指標(biāo)，就可以認(rèn)為卵巢癌復(fù)發(fā)。對(duì)懷疑可能復(fù)發(fā)的病人，有必要做CT、MRI甚至PET。術(shù)中收集新鮮的卵巢癌組織樣本在離體后30 min內(nèi)完全浸泡于RNA保存液中，并放入4℃冰箱過(guò)夜，隨后倒去RNA保存液，置于-80℃冰箱中保存方便后續(xù)進(jìn)行統(tǒng)一操作。這項(xiàng)研究得到了山西醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院支持及患者的知情同意。

1.2 主要試劑和儀器

RNAiso Plus，購(gòu)于日本TaKaRa公司；the First Strand cDNA Synthesis Kit，無(wú)RNA酶水，均購(gòu)于北京Tiangen?公司；SYBR?Select Master Mix，購(gòu)于美國(guó)ABI公司；三氯甲烷/氯仿，購(gòu)于天津福晨化學(xué)試劑公司；異丙醇，購(gòu)于天津科密歐化學(xué)試劑公司；乙醇(75%、95%)，購(gòu)于山西太原康久醫(yī)藥輔料福利公司；Nanodrop 2000/2000c，購(gòu)于美國(guó)Themofisher Scientific公司；ViiA7 PCR儀，購(gòu)于美國(guó)ABI公司；全自動(dòng)樣品冷凍研磨儀，購(gòu)于上海凈信實(shí)業(yè)有限公司；高速低溫離心機(jī)，購(gòu)于德國(guó)Eppendrof公司。

1.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)

取小塊凍存的卵巢癌組織研磨、裂解、提取出總RNA。用Nanodrop儀檢測(cè)總RNA濃度。嚴(yán)格按照ABI反轉(zhuǎn)錄試劑盒的說(shuō)明書進(jìn)行。將提取的總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，分別選取U6為內(nèi)參，反應(yīng)條件為：25℃、10 min，37℃、120 min，85℃、5 min，所得cDNA直接進(jìn)行RT-PCR。嚴(yán)格按照miScript SYBR Green PCR試劑盒說(shuō)明書制備20 μL qPCR反應(yīng)體系，并使用美國(guó)ABI公司的ViiA7 PCR儀進(jìn)行PCR擴(kuò)增。miR-200b-3p引物序列：上游5′-GTGCAGGGTCCGAGGT-3′；下游5′-UAAUACUGCCUGGUAAUGAU-3′。PAK2基因引物序列：上游5′-CACCCGCAGTAGTGACAG AG-3′；下游 5′-GGGTCAATTACAGACCGTGTG-3′。引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成；反應(yīng)條件：95℃、5 min，95℃、45 s，60℃、30 s，40個(gè)循環(huán)，數(shù)據(jù)分析采用2-ΔΔCT法表示相對(duì)定量結(jié)果。△CT=CT，miRNA-CT，U6/p-actin，△△CT=△CT，耐藥組-△CT，敏感組。表示miR-200b-3p、PAK2 mRNA在卵巢癌組織中的相對(duì)表達(dá)水平。

1.4 miR-200b-3p和PAK2 mRNA表達(dá)水平與上皮性漿液性卵巢癌患者的臨床病理指標(biāo)分析

分析miR-200b-3p、PAK2 mRNA表達(dá)水平和上皮漿液性卵巢癌患者年齡、臨床分期、病理分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、血管侵襲和腹水中癌細(xì)胞檢出情況的關(guān)系。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析用 SPSS 22.0。采用 2-ΔΔCT法表示相對(duì)定量結(jié)果，計(jì)量資料采用xˉ±s表示，使用t檢驗(yàn)進(jìn)行比較。計(jì)數(shù)資料采用例數(shù)或百分比表示，采用χ2檢驗(yàn)，α=0.05作為檢驗(yàn)水準(zhǔn)。Spearman法分析miR-200b-3p和PAK2 mRNA相對(duì)表達(dá)水平的相關(guān)性。

2 結(jié)果

2.1 卵巢癌患者基本信息表

敏感組和耐藥組各有25名研究對(duì)象，敏感組平均年齡為(53.4±7.0)歲，耐藥組平均年齡為(57.3±7.3)歲，兩組間年齡差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.056)。耐藥組淋巴結(jié)無(wú)轉(zhuǎn)移的情況明顯高于敏感組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。其余指標(biāo)的差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表1 敏感組和耐藥組患者的基本資料

2.2 miR-200b-3p、PAK2mRNA和內(nèi)參 U6、GAPDH的擴(kuò)增曲線及熔解曲線

擴(kuò)增曲線均呈現(xiàn)S型曲線，miR-200b-3p和內(nèi)參U6的擴(kuò)增趨勢(shì)和擴(kuò)增程度相似，兩者曲線基本是平行移位，提示miR-200b-3p和內(nèi)參U6的擴(kuò)增效率基本一致(圖1)；同樣，PAK2 mRNA和內(nèi)參GAPDH的擴(kuò)增趨勢(shì)和擴(kuò)增程度相似，兩者曲線基本是平行移位，PAK2 mRNA和內(nèi)參GAPDH的擴(kuò)增效率基本一致(圖3)。熔解曲線都表現(xiàn)為單一的峰值，提示miR-200b-3p、PAK2 mRNA和內(nèi)參U6、GAPDH的引物特異性好(圖2、圖4)。

圖1 miR-200b-3p和內(nèi)參U6的擴(kuò)增曲線

圖2 miR-200b-3p和內(nèi)參U6熔解曲線

圖3 PAK2 mRNA和內(nèi)參GAPDH的擴(kuò)增曲線

圖4 PAK2 mRNA和內(nèi)參GAPDH的熔解曲線

2.3 miR-200b-3p和PAK2 mRNA在卵巢漿液性囊腺癌組織中的表達(dá)量

熒光定量PCR(qPCR)結(jié)果顯示，miR-200b-3p在25例化療耐藥卵巢漿液性囊腺癌組織的△CT為3.71±0.98，顯著高于化療敏感卵巢漿液性囊腺癌組織，耐藥組相對(duì)表達(dá)量(2-ΔΔCT)是敏感組的15.78倍，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，表2，圖1A)。耐藥組卵巢癌組織PAK2的表達(dá)量顯著低于敏感組卵巢癌，是敏感組表達(dá)的0.03，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，表2，圖3、4)。

表2 不同組別miR-200b-3p和PAK2 mRNA水平的比較(n=25)

2.4 miR-200b-3p和PAK2 mRNA表達(dá)的相關(guān)性

miR-200b-3p和PAK2 mRNA的相對(duì)表達(dá)水平作Spearman相關(guān)分析，得相關(guān)系數(shù)r=-0.560，P<0.01，可見(jiàn)miR-200b-3p的相對(duì)表達(dá)量與PAK2 mRNA呈負(fù)相關(guān)。

2.5 卵巢癌組織中miR-200b-3p和PAK2 mRNA的表達(dá)與臨床病理指標(biāo)的關(guān)系

按照不同臨床特征對(duì)研究對(duì)象進(jìn)行分組，并用t檢驗(yàn)比較兩組之間miR-200b-3p和PAK2 mRNA平均相對(duì)表達(dá)量，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者miR-200b-3p明顯高于未轉(zhuǎn)移的患者(P<0.01)，但是PAK2 mRNA的情況與之相反，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者PAK2 mRNA表達(dá)量明顯低于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者(P<0.01)。臨床病理分期I-II和III-IV的miR-200b-3p和PAK2 mRNA平均相對(duì)表達(dá)量差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，且I-II的miR-200b-3p高于III-IV的患者，PAK2 mRNA與之相反。其余分化程度、血管侵犯和癌細(xì)胞的分組差別均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果提示miR-200b-3p和靶基因PAK2 mRNA的表達(dá)水平與病理分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移具有顯著的相關(guān)性，而與年齡、分化程度、有無(wú)血管侵犯以及是否發(fā)現(xiàn)癌細(xì)胞均無(wú)明顯相關(guān)關(guān)系(P>0.05，表3)。

表3 卵巢癌患者miR-200b-3p和PAK2 mRNA相對(duì)表達(dá)量與臨床病理指標(biāo)之間的關(guān)系

3 討論

上皮漿液性卵巢癌是一類婦科生殖系統(tǒng)惡性腫瘤，確診晚、死亡率高、晚期患者5年生存率不足30%。腫瘤細(xì)胞減滅術(shù)聯(lián)合化療是治療卵巢癌的重要治療方式?；熌退幨菍?dǎo)致卵巢癌患者預(yù)后不良的主要原因。microRNA(miRNA)是一類長(zhǎng)度約為21~25個(gè)核苷酸的非編碼小分子RNA，具有高度保守性、組織特異性和時(shí)序性。miRNA的作用機(jī)制是降解靶mRNA或抑制其翻譯，在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因表達(dá)、細(xì)胞增殖分化以及腫瘤的發(fā)生發(fā)展[7]。在本實(shí)驗(yàn)中收集25例卵巢癌化療耐藥患者組織樣本和25例卵巢癌化療敏感患者組織樣本，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)miR-200b-3p及其靶基因PAK2的相對(duì)表達(dá)量，qPCR的結(jié)果顯示miR-200b-3p在化療耐藥組中表達(dá)明顯上調(diào)；耐藥組卵巢癌組織PAK2的表達(dá)量顯著低于敏感組卵巢癌患者。Spearman等級(jí)相關(guān)分析發(fā)現(xiàn)miR-200b-3p的相對(duì)表達(dá)量與PAK2 mRNA呈負(fù)相關(guān)，該實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示miR-200b-3p在化療耐藥性卵巢癌中過(guò)表達(dá)，其機(jī)制可能是通過(guò)靶向調(diào)控PAK2參與調(diào)節(jié)化療耐藥和促進(jìn)卵巢癌轉(zhuǎn)移。文獻(xiàn)報(bào)道m(xù)iR-200b過(guò)表達(dá)促進(jìn)腫瘤化療耐藥和轉(zhuǎn)移，Meng等[8]首次提出miR-200b在膽管癌中過(guò)表達(dá)與化療耐藥相關(guān)，抑制miR-200b的表達(dá)可以提高膽管癌細(xì)胞對(duì)吉西他濱的敏感性。但是大量文獻(xiàn)報(bào)道了miR-200b過(guò)表達(dá)可以增強(qiáng)化療敏感性。如Yang等[9]發(fā)現(xiàn)，在對(duì)阿霉素具有抗性的MCF-7乳腺癌細(xì)胞中，miR-200b過(guò)表達(dá)可抑制上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)和增加對(duì)多柔比星的敏感性。miR-200b在化療耐藥乳腺癌、骨肉瘤細(xì)胞中靶向調(diào)節(jié)FN1可增加化療敏感性[10]。Brozovic等[11]研究發(fā)現(xiàn)在耐紫杉醇卵巢癌細(xì)胞OVCAR-3/TP和MES-OV/TP中，miR-200家族抑制EMT，產(chǎn)生了對(duì)卡鉑的抗性，同時(shí)miR-200s的重新轉(zhuǎn)染不能完全逆轉(zhuǎn)EMT，在OVCAR-3/TP中恢復(fù)紫杉醇敏感性，但在MES-OV/TP中卻沒(méi)有改變。miR-200b失調(diào)與腫瘤化療耐藥之間的關(guān)系有以下幾種可能的機(jī)制：①miR-200b可以通過(guò)影響上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化參與腫瘤化療耐藥；②腫瘤干細(xì)胞具有促進(jìn)腫瘤化療耐藥的作用，miR-200b可以通過(guò)干擾腫瘤干細(xì)胞的維持來(lái)參與腫瘤耐藥，腫瘤干細(xì)胞具有促進(jìn)腫瘤化療耐藥的作用；③miR-200b可以作為血管生成抑制劑降低血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子參與化療耐藥。在實(shí)驗(yàn)中，我們還發(fā)現(xiàn)miR-200b-3p的過(guò)表達(dá)與上皮性卵巢癌的臨床分期，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有顯著相關(guān)性，說(shuō)明miR-200b-3p過(guò)表達(dá)可能與上皮性卵巢癌化療耐藥、遷移有關(guān)，大量文獻(xiàn)研究表明miR-200s表達(dá)水平與化療耐藥有關(guān)，具有復(fù)雜性、細(xì)胞環(huán)境和藥物依賴性。但是我們并未查到miR-200b-3p表達(dá)與卵巢癌化療耐藥具有相關(guān)性的文獻(xiàn)，本實(shí)驗(yàn)為卵巢癌化療耐藥治療提供新的方向，miR-200b-3p可能可以作為卵巢癌的潛在治療靶點(diǎn)。

在生物信息學(xué)分析中[12]，我們利用多種miRNA靶基因預(yù)測(cè)軟件預(yù)測(cè)到了307個(gè)靶基因，再進(jìn)一步對(duì)預(yù)測(cè)到的靶基因行GO分析和KEGG Pathway分析，并結(jié)合藥物代謝相關(guān)理論和化療耐藥相關(guān)文獻(xiàn)分析靶基因。靶基因GO分析結(jié)果顯示正調(diào)控含核酸堿基化合物代謝過(guò)程、正調(diào)控高分子代謝過(guò)程及細(xì)胞死亡可能與化療耐藥及藥物代謝存在相關(guān)性。對(duì)預(yù)測(cè)到的靶基因行KEGG Pathway分析結(jié)果顯示MAPK信號(hào)通路、ErbB信號(hào)通路可能參與化療耐藥發(fā)生機(jī)制。MAPK是絲裂原活化蛋白激酶，是一種參與調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化、應(yīng)激、炎癥等多種生理/病理效應(yīng)的絲/蘇氨酸蛋白激酶，具體信號(hào)傳導(dǎo)有4種主要分支路線：ERK、JNK、p38MAPK、ERK5。Peng等[13]發(fā)現(xiàn) miR-299-5p通過(guò)GOLPH3/MAPK/ERK軸之間抑制細(xì)胞凋亡，增強(qiáng)了膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞在體外和體內(nèi)對(duì)替莫唑胺的耐藥性。Zhou等[14]發(fā)現(xiàn)c-Jun激活可抑制食管鱗狀細(xì)胞癌(esophageal squamous cell carcinoma，ESCC)細(xì)胞生長(zhǎng)并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，從而抑制P-gp的表達(dá)，并通過(guò)激活p53信號(hào)傳導(dǎo)途徑增強(qiáng)p21表達(dá)，從而增加對(duì)順鉑的敏感性。ErbB蛋白屬于跨膜酪氨酸激酶的表皮生長(zhǎng)因子受體家族成員。該家族成員包括ErbB1(又稱 為 EGFR/HER1)、 ErbB2(HER2)、 ErbB3(HER3)、ErbB4(HER4)。EGFR活化后可以通過(guò)激活PI3K/AKt下游信號(hào)通路參與腫瘤的增殖、分化、凋亡、轉(zhuǎn)移等生物學(xué)行為[15-16]。綜上所述，MAPK信號(hào)通路、ErbB信號(hào)通路均參與化療耐藥發(fā)生，兩者均可作為后續(xù)機(jī)制研究的方向。同時(shí)靶基因PAK2均參與了這兩條信號(hào)通路，因此，我們選擇miR-200b-3p和它潛在的靶基因PAK2作為接下來(lái)的研究方向。

PAK2是一類絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，是PAKs家族成員之一，在各組織器官中廣泛表達(dá)[17-18]，在運(yùn)動(dòng)、存活、有絲分裂和細(xì)胞凋亡等生理過(guò)程中起著重要作用。Li等[19]發(fā)現(xiàn)人類乳腺癌細(xì)胞系和人乳腺癌組織中PAK2表達(dá)較高，高表達(dá)的PAK2可以通過(guò)負(fù)調(diào)節(jié)降低caspase-7活性，從而抑制細(xì)胞凋亡，在人乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌中介導(dǎo)化學(xué)治療抗性。p21激活的激酶(PAKs)在具有獲得性耐藥性的轉(zhuǎn)移性黑素瘤細(xì)胞中被激活，并且在化療耐藥中起關(guān)鍵作用[20]。在本實(shí)驗(yàn)中，我們發(fā)現(xiàn)PAK2 mRNA表達(dá)水平在耐藥性卵巢癌組織中下調(diào)，miR-200b-3p和PAK2 mRNA的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。我們還發(fā)現(xiàn)低PAK2 mRNA表達(dá)與卵巢癌臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有顯著的相關(guān)性，這說(shuō)明低PAK2 mRNA表達(dá)水平與上皮性卵巢癌侵入和遷移有關(guān)。綜合以上的實(shí)驗(yàn)結(jié)果和討論，我們發(fā)現(xiàn)miR-200b-3p在化療耐藥卵巢癌組織中上調(diào)，可能通過(guò)誘導(dǎo)PAK2 mRNA下調(diào)參與上皮漿液性卵巢癌的化療耐藥，miR-200b-3p和PAK2與上皮漿液性卵巢癌化療耐藥、侵襲轉(zhuǎn)移有潛在的關(guān)系。當(dāng)然這是一個(gè)簡(jiǎn)單的推斷。因此，我們要進(jìn)一步去研究具體的調(diào)節(jié)機(jī)制。